Методическая статья

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

18.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51105

⸱

17 декабря 2013 г.

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает чувствительный анализ цитотоксичности на основе клеток. Перечисляя снижение частоты живых целевых CD4+ Т-клеток в присутствии увеличивающегося числа эффекторных CD8+ Т-клеток, этот анализ позволяет напрямую оценить цитолитическую активность антиген-специфических CD8+ Т-клеток.

Аннотация

Цитолитическая активность CD8+ Т-клеток оценивается редко. В данной работе мы описываем новый клеточный анализ для измерения способности антиген-специфичных CD8+ Т-клеток убивать CD4+ Т-клетки, загруженные родственным им пептидом. Целевые CD4+ Т-клетки делятся на две популяции, помеченные двумя различными концентрациями CFSE. Одна популяция пульсируется интересующим пептидом (CFSE-низкий), в то время как другая остается непульсирующей (CFSE-высокий). Импульсные и неимпульсные CD4+ Т-клетки смешивают в равном соотношении и инкубируют с растущим числом очищенных CD8+ Т-клеток. Специфическое уничтожение аутологичных CD4+ Т-клеток-мишеней анализируют методом проточной цитометрии после совместного культивирования с CD8+ Т-клетками, содержащими антиген-специфические эффекторные CD8+ Т-клетки, обнаруженные с помощью пептида/тетрамерного окрашивания MHCI. Специфический лизис целевых CD4+ Т-клеток, измеренный при различных соотношениях эффекторов и мишеней, позволяет рассчитать литические единицы, LU30/106 клеток. Этот простой и понятный анализ позволяет точно измерить внутреннюю способность CD8+ Т-клеток убивать целевые CD4+ Т-клетки.

Введение

Цитолитическая активность является основной функцией CD8+ Т-клеток, но все еще редко измеряется, поскольку анализы, используемые для этой цели, громоздки и их трудно стандартизировать. Точное измерение этой функции имеет первостепенное значение при характеристике эффекторных функций CD8+ Т-клеток, так как до сих пор не описаны достоверные предикторы эффективной клеточно-опосредованной цитотоксичности1,2. В данной работе мы предлагаем новый функциональный анализ для измерения цитотоксической активности антиген-специфических CD8+ Т-клеток на целевых CD4+ Т-клетках. Было разработано несколько подходов для обеспечения альтернативы золотому стандарту, анализу высвобождения хрома. Мы представляем здесь клеточный анализ, который раскрывает весь процесс убийства, поскольку он измеряет смерть живых клеток-мишеней. Этот метод был выведен из протоколов цитотоксических анализов in vivo на основе проточной цитометрии у мышей4,5 и in vitro у человека6. В этом протоколе антиген-специфические CD8+ Т-клетки, содержащиеся в общей популяции CD8+ Т, используются в качестве эффекторных клеток, а аутологичные CD4+ Т-клетки используются в качестве клеток-мишеней. Представляющие интерес эффекторные CD8+ Т-клетки перечислены с использованием MHCI/пептидных тетрамеров7. Гибель клеток-мишеней рассчитывается по соотношению между пептидно-заряженными/незагруженными CD4+ Т-клетками. Ранее мы показали, что этот метод является воспроизводимым, чувствительным, специфичным и не зависит от количества эффекторных клеток вобщей популяции CD8+ Т-клеток8. Путем перечисления как эффекторных, так и целевых клеток в кокультуральном анализе можно рассчитать внутреннюю способность CD8+ Т-клеток убивать клетки-мишени и выразить их в литических единицах9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение эффекторных CD8+ Т-клеток

  1. Разморозьте аутологичные криоконсервированные PBMC (2-3 флакона по 50 x 106 клеток) путем переноса криовиала из жидкого азота на водяную баню при температуре 37 °C.
  2. Промойте клетки, заполнив пробирку до 50 мл полным РПМИ (4 мМ L-глютамина, а также 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, дополненных 10% FBS). Подсчитайте PBMC и ресуспендируйте клетки в концентрации 5 x 106/мл в полном объеме RPMI.
  3. Добавьте в PBMC специфический пептид (5 мкг/мл) и IL-2 (10 нг/мл).
  4. Засейте культуру в 96 лунок глубиной планшета; засейте по 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку.
  5. Через 3 дня культивирования замените половину среды для культивирования клеток свежей полной RPMI.
  6. Через 6 дней культивирования соберите все ПМК многоканальной пипеткой и перенесите клетки в стерильный резервуар
    7. .
  7. Подсчитайте, промойте и повторно суспендируйте PBMC в дозе 5 x 107/мл в рекомендуемом буфере для разделения в пробирках с круглым дном объемом 14 мл. Добавьте коктейль для обогащения CD8+ Т-клеток человека в концентрации 50 мкл/мл клеток. Перемешайте и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте магнитные частицы в концентрации 150 мкл/мл и инкубируйте в течение 5 минут.
  8. Доведите клеточную суспензию до 7 мл, добавив разделительный буфер. Приступайте к иммуномагнитной изоляции нетронутой CD8+ Т-клетки, поместив пробирку в магнит. Через 5 минут, пока трубка все еще находится в магните, налейте интересующие элементы в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Возьмите небольшую аликвоту и окрашивайте клетки антителами против CD3 и CD8 в 1X PBS-2% FBS на 30 мин при 4 °C. Затем чистота CD8+ Т-клеток может быть измерена с помощью проточной цитометрии с ожидаемой чистотой 95% или выше.
  9. Ресуспендируйте CD8+ Т-клетки в 450 мкл с полным RPMI.
  10. Добавьте 225 μл полного RPMI в 5 пробирок с завинчивающейся крышкой.
  11. Приготовьте серийные разведения (от 1:2 до 1:32), перенеся 225 мкл CD8+ в следующую пробирку (см. Рисунок 1 на верхней панели).

2. Получение целевых CD4+ Т-клеток

  1. Разморозьте аутологичные криоконсервированные PBMC (1 флакон 50 x 106 клеток) путем переноса криовиала из жидкого азота на водяную баню при температуре 37 °C.
  2. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл RPMI.
  3. Промойте камеры и ресуспендируйте PBMC в дозе 5 x 107/мл с разделительным буфером в пробирках с круглым дном по 14 мл. Добавьте коктейль для обогащения CD4+ Т-клеток человека в концентрации 50 мкл/мл клеток. Перемешайте и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте магнитные частицы в концентрации 100 мкл/мл и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Доведите клеточную суспензию до 7 мл, добавив разделительный буфер. Приступайте к выделению CD4+ Т-клеток, поместив пробирку в магнит. Через 5 минут, пока трубка все еще находится внутри магнита, налейте желаемые ячейки в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Возьмите небольшую аликвоту и окрашивайте клетки антителами против CD3 и CD4 в 1x PBS-2% FBS в течение 30 мин при 4 °C. Затем чистоту CD4+ Т-клеток можно измерить с помощью проточной цитометрии с ожидаемой чистотой 95% или выше.
  5. Подсчитайте CD4+ Т-клетки, разделите их на две конические пробирки по 15 мл и промойте в теплой среде 1x PBS.
  6. Приготовьте рабочий раствор с высоким содержанием CFSE 0,4 мкМ в теплом PBS.
  7. Приготовьте раствор с низкой рабочей концентрацией 0,04 мкМ CFSE, разбавив часть 10-кратного раствора CFSE с высокой рабочей концентрацией в теплом PBS.
  8. Ресуспендируйте клетки при дозе PBS 20 x 106/мл (если количество CD4+ Т-клеток меньше 10x 10 6/мл, ресуспендируйте клетки в 0,5 мл PBS) и окрашивайте половину CD4+ Т-клеток, добавив один равный объем 0,4 мкМ рабочего раствора CFSE (конечная концентрация 0,2 мкМ). Например, на 1 мл клеток добавьте 1 мл рабочего раствора CFSE. Окрасьте оставшуюся половину CD4+, добавив один равный объем 0,04 мкМ CFSE-низкорабочего раствора (конечная концентрация 0,02 мкМ). Окрашивать ячейки в течение 15 мин при температуре 37 °C в атмосфере 5%CO2.
  9. После инкубации гранулированные ячейки при 1500 об/мин в течение 5 мин и ресуспендирование в 1 мл теплого полного RPMI для гашения реакции мечения.
  10. Пульсируйте CFSE с низким уровнем CD4+ Т-клеток путем добавления интересующего пептида в конечной концентрации 5 мкг/мл в полную RPMI и инкубируйте в течение 45 мин в атмосфере 5%CO2 при 37 °C.
  11. Промойте CFSE-high и CFSE-low CD4+ Т-клетки в полном RPMI. Повторите в общей сложности два мытья. Ресуспендируйте в концентрации 2 x 10по 5 клеток/мл каждый в полном RPMI.
  12. Смешайте две целевые популяции в соотношении 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (см. рисунок 1 на нижней панели).

3. Кокультура

  1. При каждом разведении CD8+ Т-клеток затравите 100 мкл в двух экземплярах в 96-луночный планшет с круглым дном.
  2. Добавляйте смешанные целевые CD4+ Т-клетки (100 мкл) к каждому разведению эффекторных клеток до конечного объема 200 мкл.
  3. Чтобы измерить базальный апоптоз, засейте 3 лунки только клетками-мишенями.
  4. Инкубируйте кокультуру в течение 6 часов в атмосфере с содержанием 5%CO2 при 37 °C.

4. Окрашивание и сбор данных с помощью проточной цитометрии

  1. Перенесите ячейки на 96-луночный планшет с V-образным дном и окрашивайте ПЭ-сопряженными тетрамерами pMHC в течение 15 мин в атмосфере 5%CO2 при 37 °C.
  2. Простирать в 1x PBS-2% FBS и окрашивать ячейки с помощью Far Red LIVE/DEAD исправляемых мертвых клеток, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 в течение 30 минут при температуре 4 °C, в защищенном от света месте.
  3. Промойте ячейки один раз 1x PBS-2% FBS и повторно суспендируйте в 100 мкл с 2% формальдегидом в 1x PBS.
  4. Получение клеток на проточном цитометре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема на Рисунке 1 резюмирует ход анализа. Очищенные Т-клетки CD8+ (эффекторные клетки) ресуспендировали в 450 µl полного RPMI; серийные разведения выполняли путем добавления 225 µl Т-клеток CD8+ в следующую пробирку, содержащую 225 µl среды (верхняя панель). Очищенные Т-клетки CD4+ (клетки-мишени) подсчитали, разделили на две пробирки и окрасили двумя различными концентрациями CFSE (высокой и низкой), как описано в протоколе. Т-клетки CD4+ с низкой экспрессией CFSE (CFSE-low) нагружали интересующим пепт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь анализ позволяет количественно оценить основную функцию CD8+ Т-клеток: цитолитическую активность. Точное измерение этой функции имеет первостепенное значение при характеристике эффекторных функций CD8+ Т-клеток, поскольку в предыдущих исследованиях сообщалось о несоответствии между этой функцией и секрецией цитокинов антиген-специфических CD8+ Т-клеток10,11. Из-за короткого времени инкубации кокультур (6 часов) и использования аутологичных клеток-мишеней наблюдается низкая скорость неспецифичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Управлением туризма, торговли и экономического развития Флориды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EasySep Набор для обогащения человеческих CD4+ Т-клетокСтволовые клетки19052
EasySep Набор для обогащения человеческих CD8+ Т-клетокСтволовые клетки19053
Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSE - для проточной цитометрииInvitrogenC34554
Far Red LIVE/DEAD исправляемые мертвые клеткиInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 Мышь против человека CD3BD
Brilliant Violet 650 Антитело к человеку CD4Biolegend317435
PerCP Антитело против человеческого CD8Biolegend344707
RPMI 1640 Medium 1xVWR10-040-CV
Пенициллин-стрептомицин 100x РастворInvitrogen15070063
Сыворотка плода крупного рогатого скота - золото, инактивированная при нагреванииPAAА15-252
96-луночные планшеты; Обработаны; U-образное дно; с крышкойBD Falcon353077
25 мл стерильный полистирол, индивидуально упакованные резервуарыСША Scientific2321-2230
96-луночный U-образный дно, стерильные 2 мл глубинные луночные планшетыThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126), исследовательский классMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer, разделительный буферСтволовые клетки20104
15 мл Полипропиленовая коническая трубкаBD Falcon352097
14 мл круглая нижняя трубка, полипропиленBD Falcon352059
стволовая клеткаEasy EasySep18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96-лунка; V-образная пластина с крышкойFisher12-565-481
Раствор формальдегида, реагент ACS, 37 мас.% в H2OSigma-Aldrich252549-500ML
1,5 мл микротрубка с завинчивающейся крышкой, коническаяSarstedt72.692.005
557943Большая магнитная

Ссылки

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
  2. Betts, M. R., Harari, A. Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV. Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).
  3. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284, 553-555 (1980).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J. Immunol. 171, 27-31 (2003).
  5. Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 171, 17-21 (2003).
  6. Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).
  7. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  8. Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells. J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).
  9. Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).
  10. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  11. Trautmann, L., et al. Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection. Blood. 120, 3466-3477 (2012).
  12. Hildemann, S. K., et al. High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells. PLoS One. 8, (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

T CD8CFSE

Похожие статьи