Минимально инвазивная Создание мышиной артифициального мочевого пузыря ксенотрансплантатов

Исследования рака зависит от животных моделях рака у человека с использованием линий клеток, полученных из опухолей пациентов для того, чтобы углубить наше понимание биологии опухоли. Для в естественных условиях анализа роста при различных стратегий лечения мышиный Ортотопическая модели рака мочевого пузыря остается эталон ^1,2. Прививка человеческих раковых клеток мочевого пузыря с ослабленным иммунитетом мышей (ксенотрансплантат модель) опирается на внутрипузырного введения ("внутрипузырную модель") ^3,4,5 или прямой инъекции в стенке мочевого пузыря ("очный модели") ^6,7. Оба метода также может быть выполнена на крысах ^8,9.

Внутрипузырного введения индуцирует образование опухолей на уротелиальной поверхности мочевого пузыря, который затем поддаются последующей внутрипузырного введения новых препаратов лечения. Тем не менее, количество клеточных линий, которые надежно онкогенными при доставке через этот метод ограниченг один из тех клеточных линий, KU7, недавно было показано, что клетки HeLa ^4,10. Внутрипузырного введения также отнимает много времени из-за необходимых временами удержания, и это часто вызывает рост опухоли в смежных элементов мочевыводящих путей, в том числе уретры, мочеточника и почечной лоханки ^11. Кроме того, внутрипузырного введения часто приводит к росту опухоли на полу мочевого пузыря, где мочеточники войти в мочевой пузырь, и это может привести к обструкции верхних тракта и сопутствующей почечной недостаточности.

Первичные инвазивные ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря, которые пригодны для лечения системных создаются путем прямой инъекции опухолевых клеток в стенке мочевого пузыря ^12. Несмотря на многочисленные клеточные линии расти адекватно в этой модели, ее ограничением является насильственный характер модели, связанной с необходимостью брюшной разрез ^13. Модель также вызов, чтобы узнать из-за технических трудностей инъекционных клетки именно в мышечную стенкумочевого пузыря.

Новый подход для установления Ортотопическая первичные инвазивных ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря у мышей была разработана в нашем отделе в целях устранения существующих недостатков "очной модели". Мы смогли оптимизировать чрескожное, под ультразвуковым контролем инъекции раковых клеток мочевого пузыря в переднюю стенку мочевого пузыря, что приводит к этой новой техники, чтобы успешно заменить установленную инвазивной модель. Кроме того, мы потенциально повысило точность и воспроизводимость "очной модели".

Все животные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными (ССАС). Протокол был утвержден на уход за животными комитета Университета Британской Колумбии (протокол №: A10-0192) на.

1. Подготовка клеточных линий

1. Подтверждение личности соответствующих клеток рака мочевого пузыря человека линий по ДНК-дактилоскопии ^7.
2. Для анализа роста опухолей ксенотрансплантатов по биолюминесценции, трансфекции клеточных линий лентивирусным конструкции несущего ген люциферазы светляков ^3.
3. Оттепель и расширить существующие клеточные линии в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37 ° С в увлажненной 5% CO ₂ атмосферы. Прохождение клетки по крайней мере, 3x, но избежать раза культуры более 3 месяцев.

2. Получение клеточной суспензии

1. Оттепель Матригель. Держите температуру ниже4 ° C, чтобы избежать увеличения вязкости геля.
2. Trypsinize клетки при впадении 70% и приостановить в нормальном питательной среды.
3. Подсчитайте количество клеток с гемоцитометре или автоматическим счетчиком клеток.
4. Спин клеточной суспензии в течение 5 мин при 200 х г. Удалить супернатант.
5. Добавить соответствующий объем DMEM (10% FBS) и Матригель (соотношение 1:01), чтобы достичь желаемой концентрации клеток, который зависит от используемой линии клеток и желаемые кинетика роста (8-15 × 10 ⁶ / мл). Введенный объем суспензии опухолевых клеток будет 40 мкл.
6. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз (P1000), не создавать пузырьки воздуха в суспензии.

3. Подготовка животных

Примечание: В связи с потенциальной необходимости в трансуретральной катетеризации в шаге 4.7, самки мышей являются предпочтительным пол в этой модели на животных.

1. Мыши дома в соответствии с институциональной и национальной ухода за животными гуidelines. Получить одобрение комитета по этике для всех экспериментах с мышами.
2. Обезболить мышей с 3%-ным раствором изофлюран / кислорода. Подтверждение надлежащего обезболивания животных (например, отсутствие ответа на носок пинчах).

4. Экспериментальная установка

1. Разрежьте стабилизации мочевого пузыря от любого вида плоской жесткого пластмассового материала [рисунок 2 я]. Внимательно осмотрите ремень и удалите все острые края перед нанесением на мышей.
2. Установите животное на стол изображения с подогревом [Рисунок 1 Я] небольшого животного изображений платформе с непрерывного мониторинга жизненно важных функций. Fix нижних конечностей с резинкой [Рисунок 1 III].
3. Лечить живот с 2% хлоргексидина глюконата и протрите кожу стерильной кончика хлопка.
4. Остановите пузырь с стабилизационного пузыря ремнем [Рисунок 2 II]. Таким образом, уклонение от уплатымочевого пузыря в течение интрамурального инъекции в шаге 5.6 можно будет избежать.
5. Применение ультразвука стерильный гель на нижней части живота.
6. Медленно подойти к ультразвуковой сканирующей головки (частота 40 МГц) [Рисунок 1 IV] к коже (продольный с черепной углом 45-70 °) и визуализировать пузырь на экране ультразвукового [Рисунок 3 I].
7. Если мочевой пузырь пуст, заполнить ее с 50 мкл стерильной, тепло фосфатно-солевом буфере (PBS) через трансуретральной 24 г ангиокатетер.

5. Разделение мочевого пузыря стены Layers

1. Прикрепите шприц 1,0 мл, наполненный PBS и подключенный к 30 G, ¾ в иглу (скос направлен вперед) к шприца зажима.
2. Поместите иглу к коже непосредственно над лобковой костью в угол 30-45 ° (80-90 ° по отношению к продольной оси ультразвукового сканирующей головки [Рисунок 1]).
3. Обнаружение иглуна экране ультразвука.
4. Медленно проколите кожу и мышцы живота стены [Рисунок 3 II].
5. Поверните скос игольчатого 180 ° (в настоящее время направлены назад).
6. Вставьте кончик иглы в стенку мочевого пузыря, не проникая в слизистую [Рисунок 3 III]
7. Медленно введите 50 мкл PBS между мышечной оболочки и слизистой оболочки, чтобы создать искусственное пространство [Рисунок 3 IV].
   Примечание: Если слизистая оболочка случайно перфорированный на этапе 5.6, медленно вытяните назад иглу и вводят 50 мкл PBS после слой слизистой дернулся назад на кончике иглы.
8. Вывод иглу.

6. Очный Инокуляция клеток рака мочевого пузыря

1. Прикрепите вторую 1,0 мл шприц (наполненный клеток рака, взвешенных в Матригель) с 30 г, ¾ в иглу на шприц зажима.
2. Руководство кончик иглы к тому жеPBS заполненные пространство, которое было создано в шаге 5.7.
3. Введите 40 мкл клеточной суспензии в этом пространстве [На рисунках 3 V и VI].
4. Вывод иглу.

7. После интервенционной Поддерживающая терапия

1. Демонтировать мышь с платформы визуализации.
2. Держите животное в теплой и комфортной среды под непрерывным наблюдением во время восстановления после анестезии.
3. После приходя в сознание и возобновления нормального передвигаться, разместить животное обратно в дом клетке.

Внутренние инъекции из трех различных линий опухолевых клеток (UM-UC1 Люк, УМ-UC3 Люк и УМ-UC13 Люк) проводили в 50 животных под ультразвуковым-руководства по три дня подряд. Прививка была выполнена эффективно (среднее время 5,7 мин / животное) и не было связано с какими-либо внутри-или пост-интервенционных осложнений.

Мониторинг роста опухоли проводили на ультразвуковой визуализации и биолюминесценции. На день # 3 опухоль может быть обнаружена с помощью ультразвука в передней пузыря всех 50 животных [Рисунок 4 Я]. 98% мышей показали постоянный рост опухоли в течение последующего периода [4 и 5]. После прививки УМ-UC3 Luc, одна мышь разработана внутрибрюшинную распространение опухоли и опухоли инволютированную после день # 7 во втором животного [Таблица 1]. Это было первое группа мышей, инокулированных этой новой техники.

Рисунок 1. Изображение и схематическое изображение экспериментальной установки. Мышь установлен на таблице операции с подогревом (I) и проходит под анестезией (<сильный> II) с 3%-ным раствором изофлюран / кислорода. Нижние конечности крепятся с резинкой (III). Подойдя к ультразвуковой сканирующей головки (IV) к коже (продольная выравнивания с черепной углом 45-70 °) мочевого пузыря (V) визуализируется на экране ультразвука. Шприц с иглой 30 G (VI) направляется к коже под углом 30-45 ° (80-90 ° по отношению к продольной оси ультразвукового сканирующей головки).

Рисунок 2. Иммобилизация мочевого пузыря. Размеры и иллюстрации построить стабилизации пузыря ремень (I) Ремешок крепится к нижней части живота и обездвиживает мочевого пузыря (II). Таким образом уклонение от мочевой пузырь во время очного инъекции избегать.

Рисунок 3. Внутренние инокуляция клеток опухоли. Визуализация мочевого пузыря на экране ультразвукового (I). Перфорация кожи и мышц брюшной стенки (II). Вставки иглы в стенке мочевого пузыря без проникновения слизистой оболочки (III). PBS (50 мкл) между мышечной оболочки и слизистой оболочки после медленного инъекции (IV). Клетки опухоли, взвешенные в Матригель в очной искусственно созданного пространства (V, VI).

1123fig4.jpg "/>
Рисунок 4. . Последующий ультразвуком Непрерывное наблюдение с помощью ультразвука показали значительное увеличение объема опухоли (Я: день № 3, II: день № 7, III: день № 13).

Рисунок 5. Последующие меры по биолюминесценции. Непрерывное наблюдение по биолюминесценции показал постоянное увеличение люминесценции за период исследования.

Рисунок 6. Гистология опухоли ксенотрансплантата и метастазов в лимфатических узлах. В целом H & E разделе представительного ксенотрансплантате ТУ мор демонстрируя инвазивный рост в мышцу без вторжения в соседние органы (I). 60% мышей, несущих УМ-UC13 Люк опухолей и 20% мышей, несущих УМ-UC3 Люк опухоли, представленные забрюшинных лимфатических узлах (II).

Таблица 1. Инъекции под ультразвуковым контролем опухолевая клетка - порядок и результаты.

Открытый доступ для этого видео-статье спонсируется FUJIFILM VisualSonics, Inc