Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

Summary

Мы опишем способ маркировать белка на поверхности живых нейронов использованием конкретного поликлональные антитела к эпитопам внеклеточных. Белок связаны антитела на поверхности клеток и впоследствии усвоены через эндоцитоз можно отличить от оставшихся на белок, или продают в, поверхности во время инкубации.

Abstract

Для того чтобы продемонстрировать клеточной поверхности локализацию предполагаемого рецептора трансмембранного в культивируемых нейронах, мы меченый белок на поверхности живых нейронов с конкретным первичного антитела против повышенной внеклеточной части белка. Учитывая, что рецепторы продают в и от поверхности, если клетки проницаемыми после фиксации затем оба клеточной поверхности и внутренний белок будет обнаружен тот же меченого вторичного антитела. Здесь мы адаптирован метод, используемый для изучения оборота белка ("кормления антитело") дифференциально метки белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело и белка, которые либо остались на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода . Способность различать эти два пула белка стало возможным благодаря включению ночного шага блокирующего с высококонцентрированных немеченного вторичным антителом после начального incubatioп unpermeabilized нейронов с флуоресцентно-меченого вторичного антитела. После стадии блокирования проницаемости нейронов разрешенных обнаружение интернализованной бассейн с флуоресцентным вторичным антителом, меченным другом флуорофора. Используя эту технику, мы смогли получить важную информацию о внутриклеточной локализации этого предполагаемого рецептора, показывая, что это было, действительно, продаются в поверхности клетки в нейронах. Эта методика широко применимы к ряду типов клеток и белков клеточной поверхности, обеспечивая соответствующее антитело с внеклеточным эпитопом доступен.

Introduction

При установлении функцию недавно идентифицированных белков, исследование субклеточном локализации и торговли белка в вопрос может дать важную информацию о вероятной роли / с белковой ^1,2. Биоинформационный анализ транскриптома развивающегося неокортекса ³ предоставил нам список генов вл ющие экспрессию во время мыши мозга corticogenesis. Мы тогда приняли ген нокаут подход констатировать, что белок, кодируемый одной из этих генов, sez6, играет ключевую роль в развитии нейронов. Мы наблюдали, что ген, связанных с захватом 6, или Sez6, белок находится в развивающихся дендритов и также присутствует в дендритных шипов, специализированных стр....

Protocol

1. Диссошиэйтед гиппокампа Нейрон Культура

1. Подготовка покровные (боросиликатного стекла):
   1. Стирать в 100%-ном этаноле.
   2. Воздух сухой при УФ-облучении.
   3. Coat с Poly-D-лизина (0,5 мг / мл в 0,15 М боратного буфера в течение ночи при 4 ° С).
   4. На следующий день (день культуры) промыть 3 раза в PBS затем слой с ламинина (2,5 мкг / мл, природный мышь ламинин) + 5% объем / объем инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) разводили в PBS в течение 2 ч при 37 ° С.
2. Проанализируйте эмбриональных день 18 (E18) крыса гиппокампа и собирать в PBS, содержащий кальций и магний, охлажденные на льду.....

Results

Методика флуоресцентный иммунное окрашивание двух цветов, представленные здесь полезно для маркировки внеклеточные домены трансмембранных белков в живых клетках (схематически показано на фиг.1). Во время инкубационного периода, иммуноглобулины связать доступные эпитопы и доля населения, белковых молекул, а также связанного антитела, подвергается эндоцитозу. Кроме того, вновь синтезированный белок может достигать поверхности клеток с помощью переднего торговли и переработанные белковые молекулы могут быт.......

Discussion

Техника, описанная здесь дополняет, что из клеточной поверхности биотинилирования (обзор Arancibia-Carcamo др..) ^12, и это является методом выбора для сохранения информации о субклеточном локализации интернализованной белка, при условии подходящей первичное антитело к внеклеточный эпитоп доступен. Кроме того, количественное определение торговли людьми белок / интернализации в течение долгого времени может быть выполнена (с помощью фиксации покровные в разное время на протяжении всего живого инкубации.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS с Ca и Mg	Invitrogen	14040182
Нейробазальная среда	Invitrogen	21103-049
B27 Добавка	Invitrogen	17504-044
L-глутамин	Invitrogen	25030-081
Система диссоциации папаина	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Бычья сыворотка Альбумин	Сигма Олдрич Австралия	A9418
Хэнк' s сбалансированный солевой раствор без кальция, магния, фенола красного	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Натуральный мышиный ламинин	Invitrogen	23017-015	Разморозить на льду перед изготовлением аликвот
Фетальная бычья сыворотка HyClone	Thermo Fisher
Фтордезоксиуридин	Sigma Aldrich Австралия	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Австралия	U3003
18 мм Круглые стеклянные покровные накладки	Menzel Glä ser	CB00180RA1
VECTASHIELD водный монтажный медиум	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab фрагмент козьего антикролика 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Параформальдегид	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - ручка в вытяжном шкафу
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-конъюгированный ослик анти-кролик 2° антитело	Invitrogen - Молекулярные зонды	A21206