В этой рукописи описывается протокол выделения экзосом из мочи человека с использованием модифицированной техники осаждения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модифицированный Осадки Метод изолировать мочевых экзосомы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Идентификация биомаркеров, которые позволяют раннее выявление заболеваний почек в моче и плазме, является областью активного интереса в течение нескольких лет. Мочевые экзосомные везикулы размером 40-100 нм выделяются в мочу в нормальных условиях клетками всех сегментов нефрона и могут содержать белок, мРНК и микроРНК, характерные для их клеточного типа происхождения. В условиях почечной дисфункции или повреждения экзосомы могут содержать измененные пропорции этих компонентов, которые могут служить биомаркерами заболевания. В настоящее время существует несколько методов выделения экзосом мочевого пузыря, и ранее мы проводили экспериментальное сравнение каждого из этих подходов, в том числе три из них основаны на ультрацентрифугировании, один с использованием наномембранного концентратора ультрафильтрации, один с использованием коммерческого реагента для осаждения и один с использованием модификации метода осаждения с использованием реагента ExoQuick, который мы разработали в нашей лаборатории. Мы обнаружили, что модифицированный метод осаждения дает наибольший выход экзосомных частиц, микроРНК и мРНК, что делает этот подход пригодным для выделения экзосом для последующего профилирования РНК. Мы пришли к выводу, что модифицированный метод осаждения экзосом предлагает быструю, масштабируемую и эффективную альтернативу для выделения экзосом из мочи. В этом отчете мы описываем наш модифицированный метод осаждения с использованием реагента ExoQuick для выделения экзосом из мочи человека.
Введение
Мочевой экзосомы небольшие внутренние пузырьки 100 нм мультивезикулярных органов (MVB), полученных из клеток всех типов в нормальных и патологических условиях в моче пространства, включая клубочков подоцитов, клетках почечных канальцев и клеток, выстилающих мочевые системы дренажа, которые появляются в обогащении микроРНК 1 -2. Многие исследователи обнаружили различные белки в экзосом, выделенных из мочи здоровых лиц, а также пациентов с почечной и / или системными заболеваниями 3-5. Экзосомы может быть выделен с помощью различных методов, таких как двухступенчатой дифференциального ультрацентрифугирования с или без сахарозы 6-7, комбинируя наномембраны фильтр ультрацентрифугирования 8-9 или 10-11 осадков. Мы недавно разработали простой, быстрый, масштабируемый и эффективный метод, чтобы изолировать мочевых экзосомы и выявления микроРНК и белка биомаркеров 11. Хотя биомаркеры могут быть обнаружены в самых разных биологических жидкостях, игине является наиболее удобен для больных с заболеваниями почек и мочевого тракта, поскольку он может быть получен в больших количествах в относительно неинвазивным способом.
Хотя существует несколько методов, чтобы изолировать мочевого экзосомы 6-11, наиболее часто используемые процедуры, зависит от дифференциального ультрацентрифугирования с 30% сахарозы подушке. В то время как этот способ является эффективным и качество получаемых экзосом изолированных с этой процедурой является высокой, сама техника требует квалифицированного персонала и отнимает много времени и требует несколько шагов ультрацентрифугирования. Другие методы, такие как фильтрация и осадков, были разработаны для изоляции экзосом, в том числе тот, который использует запатентованную осадков реагент (т.е. ExoQuick-TC: Система биологических наук; Mountain View, CA). Хотя осадков использованием этого реагента очень быстро и сравнительно легко, чистота выделенных экзосом является низкой по сравнению с ультрацентрифугирования метOD. Мы недавно сравнил шесть методов для выделения в моче экзосом, в том числе модификации метода осаждения с использованием ExoQuick-TC, которые мы разработали в нашей лаборатории 11. Мы обнаружили, что этот модифицированный способ осадков дали более высокие количества белка, микроРНК, и мРНК и сама процедура была быстрее и проще в реализации, чем ультрацентрифугированием. Здесь мы опишем экспериментальный протокол нашего модифицированного метода осаждения ступенчато, и включают в себя обсуждение преимуществ и недостатков этого метода по сравнению с другими методами изоляции экзосома. Модифицированный метод осаждения включает начальное осаждение частиц экзосом, с последующим удалением Тамм-Хорсфолл белка, который коррелирует с exosomal белков, и известно, снижают экзосома выход из мочи. Мы обнаружили, что эти модификации повышает выход и чистоту препарата exosomal из мочи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ:. Этапы выделения мочевой экзосом с использованием модифицированного метода осаждения показаны на рисунке 1 Первые шаги включают удаление больших мертвых клеток и клеточных обломков путем центрифугирования. Конечный осадок, полученный из надосадочной жидкости, полученной от каждого последующего шага соответствует экзосома, который растворен в растворе изоляции для дальнейшей экстракции белка, РНК и ДНК.
1. Сбор мочи
- До сбора мочи, подготовить ингибитор протеазы коктейль в соответствии с инструкциями изготовителя и добавить 3,125 мл этого коктейля на пустой стерильной емкости. Трубка, содержащая ингибитор протеазы коктейль затем могут быть распространены на волонтеров для сбора мочи.
Примечание: причина для добавления ингибитора протеазы, чтобы минимизировать деградацию белка в образце мочи. Хотя мы специально использовали ингибитор протеазы коктейль изСигма, другие коммерчески доступные ингибиторы протеазы могут быть замещены. - Собирают приблизительно 10 мл первого пустот мочи. Процесс мочу сразу после сбора без хранения или охлаждения. Изолировать мочевых экзосомы в двух экземплярах с использованием модифицированного метода осаждения; один из дубликатов для ДНК, РНК и общего белка экстракцией, а другой для количественного определения частиц экзосом мочевых.
Примечание: 24 ч образец мочи можно собрать для изоляции экзосома при хранении при 4 ° С.
2. Удаление остатков клеток и Тамма-Horsfall белка (THP)
- Трансфер образцы мочи до 15 мл центрифужные пробирки. Центрифуга 10 мл мочи при 17000 мкг в течение 10 мин при 37 ° С, чтобы устранить клетки и клеточных обломков (рисунок 1).
- С помощью пипетки, передавать супернатант в чистую пробирку для дальнейшей обработки. Ресуспендируют осадок в 500 мкл раствора изоляции (250 мМ сахарозы, 10 мМ испытующемуanolamine, рН 7,6) с последующим 10-минутной инкубации с DL-дитиотреитола (DTT: конечная концентрация 200 мг / мл) при 37 ° С.
Примечание: ДТТ добавляют к ухудшению ТНР, который поглощает экзосомы, что приводит к снижению урожайности. Позаботьтесь, чтобы оставить осадок ненарушенных во время передачи супернатанта и убедитесь, что супернатант ясно окатышей. - Образцы гранул Вихревые каждые 2 мин до осадок полностью не растворится. Затем добавляют 500 мкл раствора изоляции в растворенном осадке.
- Сразу же после добавления изоляции раствора к осадку, центрифугируют при 17000 х г в течение 10 мин при 37 ° С. Пипеткой супернатант и в сочетании с надосадочной жидкости, собранной ранее.
- Ресуспендируют осадок в 50 мкл изоляции раствора для анализа SDS-PAGE.
Примечание: PBS, или терапию, может быть использован вместо раствора изоляции, чтобы вновь суспендируют таблетку.
3. Выделение экзосома Пелле
- Для 11 мл собранной supernatant, добавить 3,3 мл ExoQuick-TC реагента и инкубировать при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 12 часов.
Примечание: Отношение объема надосадочной жидкости до ExoQuick-TC реагента можно регулировать, чтобы увеличить или уменьшить выход exosomal. Мы заметили, что меньшие объемы добавленной реагента производят меньшие урожаи экзосом. - После инкубации, центрифуги смеси образца / ExoQuick-ТК при 10000 х г в течение 30 мин при 25 ° С.
- Передача супернатант в новую пробирку для анализа SDS-PAGE.
- Экзосом осадок можно хранить при -80 ° С в течение ДНК, РНК и белка экстракции и количественного определения частиц экзосом использованием ELISA CD9 11.
ПРИМЕЧАНИЕ: экзосом осадок может храниться при -80 ° С в течение 1 года с ограниченным замораживания и оттаивания.
4. биомаркеров для выявления и анализа экзосома Пелле
- Для последующих анализов, извлечения ДНК, РНК и белка из экзосома гранул с использованием ДНК / РНК / комплект изоляции белка и РНК изоляции кит в соответствии с инструкциями изготовителя. Определение концентрации с использованием спектрофотометра NanoDrop путем измерения оптической плотности при 260 и 280 нм с 2 мкл образца.
- Выполните количественный реального времени RT-PCR (КПЦР) с помощью TaqMan микроРНК анализов (в нашем случае мы использовали человеческие микроРНК-192 стран и Мир-1207-5p специфические анализы) или микроРНК-специфических праймеров.
- Для анализа SDS-PAGE, используйте 4-12% Bis-Tris гель и отдельные образцы белка одномерного электрофореза. Представьте гели с использованием набора окраски серебром в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните Вестерн-блоттинга с использованием PVDF мембраны в соответствии с указаниями производителя. Использование кроличьих поликлональных антител к апоптоз-сшитый ген-2 взаимодействующего белка X или ALIX и мышиных моноклональных антител к ген восприимчивости опухолей 101 белка или TSG101 в Вестерн-блот-обнаружения. Количественная плотность полос открытого доступа программного обеспечения NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) илиАналогичная программа.
- Определить число мочевыводящих частиц экзосом полученных с использованием набора CD9 ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мочевой экзосомы нести белок, микроРНК и мРНК биомаркеров, выделяемые из почек эпителиальных клеток. Выделение и определение из этих экзосом может обеспечить полезную диагностическую инструмент для ранней диагностики заболеваний почек, таких как диабетическая нефропатия. Есть несколько способов изоляции экзосом из образцов мочи, собранных от человеческих субъектов. Мы ранее сравнению шесть методов выделения мочи экзосома и исследованы полученного белка, уровень мРНК, и микроРНК 11. Наша цель здесь в том, чтоб...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Большинство методов с участием осаждение экзосом из мочи не учитывают удаление полимерного сети, образованной Тамм-Хорсфолл белка (ТНР). Этот белок присутствует в больших количествах в моче, где предположительно ловушки экзосомы во время начальной низкоскоростным центрифугированием. В нашем модифицированного метода мы уменьшили ТНР с помощью DTT до экзосома осадков. Как показано на рисунке 2, большее количество ТНР наблюдалось в необработанной моче и гранулы, без ТНР в конечном супернатанте и экзосома г...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Публикация сборы для этой статьи были оплачены SBI биологических наук.
Благодарности
Мы благодарны Фонду семьи Рони за поддержку этого исследования. Мы признательны доктору М. Лукресии Альваресу за его вклад в планирование и проведение экспериментов, описанных в этой работе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Corning 15 мл Центрифуга Пробирка | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Центрифуга | Sorvall | ||
| DL-дитиотреитол | Sigma Aldrich | D9779 | используется в конечной концентрации 200 мг/мл |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE система (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 мм, 10 лунок | Invitrogen | NP0321BOX | Для анализа SDS-PAGE |
| ECL Advance Western blotting Detection kit | GE Healthcare Life | Sciences RPN2135 | Для вестерн-блоттинга для детекции биомаркеров |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | Для выделения экзосом |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | Для количественного определения экзосом |
| Мини-набор AllPrep для ДНК/РНК/белка | Qiagen | 80004 | для выделения ДНК, РНК, белка |
| Rneasy MinElute Cleanup набор | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis спектрофотометр | Thermo Scientific | для количественного определения белка | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | Для окрашивания гелей |
| SDS-PAGEXcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | Для запуска гелей SDS-PAGE Анализы | |
| микроРНК TaqMan | Life Technologies | Для анализов ОТ-ПЦР | |
| программное обеспечение qBasePlus v1.5 | Biogazelle NV | Для анализа данных анализа ОТ-ПЦР | |
| Поликлональное антитело кролика к ALIX | Millipore | Для обнаружения биомаркеров | |
| методом вестерн-блоттингМышиное моноклональное антитело к TSG101 | Abcam | Для обнаружения биомаркеров вестерн-блоттинга |
Ссылки
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
