Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ

Summary

Здесь мы опишем два анализы для измерения активации комплемента, вызванное антителами против красных кровяных клеток. Основным преимуществом над текущими анализов является их количественный и природа простой в интерпретации.

Abstract

Антитела против красных кровяных телец (эритроцитов) может привести к активации комплемента, что приводит к ускоренному оформлению через рецепторы комплемента в печени (внесосудистая гемолиз) или приводит к внутрисосудистого лизиса эритроцитов. Аллоантител (например АВО) или аутоантител к антигенам эритроцитов (как видно на аутоиммунной гемолитической анемии, АМСЗ), ведущие к активации комплемента потенциально вредны и могут быть - особенно, когда приводит к внутрисосудистого лизиса - со смертельным исходом ^1. В настоящее время, активацию комплемента вследствие (авто)-антител на эритроцитах оценивается в пробирке с помощью тест Кумбса, отражающий отложение комплемента на РБК или с помощью неколичественные гемолитической анализа отражающей РБК лизиса ^1-4. Тем не менее, для оценки эффективности ингибиторов комплемента, то в обязательном порядке иметь количественные методы. Здесь мы опишем два таких методов. Во-первых, анализ, чтобы обнаружить C3 и отложение C4 на красных кровяных телец, который, вызванных антител в сыворотке пациента предварительнозаслушанных. Для этого анализа FACS используется с флуоресцентно меченных анти-С3 или С4 анти-антител. Далее, количественный гемолитическая анализ описан. В этом анализе комплемент-опосредованной гемолиз, индуцированный сыворотки пациента измеряется с использованием спектрофотометрического обнаружения опубликованном гемоглобина. Оба этих анализов очень воспроизводимым и количественный, что облегчает изучение активации комплемента антитело-индуцированный.

Introduction

Антитела против красных кровяных телец (эритроцитов) может быть вызвана при переливании эритроцитов, экспрессирующих антиген, которого нет на БС-получателей. Эти алло-антитела могут вызывать тяжелые острые гемолитические реакции переливания из-за активации комплемента на следующем переливании ^5. В аутоиммунного гемолитической анемии (АМСЗ), пациенты имеют аутоантитела против собственного эритроцитов. Это приводит к ускоренному оформлению клеток через взаимодействие IgG, связанного с эритроцитов с Fcγ-рецепторами на фагоцитов в селезенке и / или в случае аутоантител, способных активировать комплемент через рецепторы комплемента в печени ^6,7. Акти....

Protocol

1. Подготовка Бромелайн обработанных ЭРИТРОЦИТОВ

1. Вымойте 0 типизированных эритроциты 3x с 1x PBS (центрифугирования при 664 мкг в течение 2-5 мин).
2. Инкубируют 1 объем эритроцитарной массы с двумя объемами 0,5% раствора бромелайн в течение 10 мин при 37 ° С
3. Вымойте клетки 3x с 1x PBS.
4. Клетки могут быть сохранены в виде 3%-ного раствора при 4 ° С в 1x PBS в течение не менее одной недели.

2. С3 и С4 осаждения Анализ на эритроциты по СУИМ

1. Тепло-инактивировать необходимое количество сыворотки пациента (или другого источника анти-антитела) RBC путем нагрева образца в течение 30 мин при 5....

Results

Рисунок 2А показывает, представитель точечный график для эритроцитов. Подходит стробирования для одиноких эритроцитов можно увидеть в де FSC-W - FSC-участке (Р1). Обычно около 95% эритроцитов находятся в пределах этой P1 ворота (одиночные клетки), но когда высокий процент сыворотки пациента используется, это может упасть до 70-80%, особенно, когда анти-РБК IgM присутствует в сыворотке пациента.

Представитель результаты влияния пациента АМСЗ сыворотки по осаждению C4 показаны.......

Discussion

Вышеуказанные анализы воспроизводимым и надежным. Они легко выполнить и можно выполнять их со многими образцов в то же время (в 96-луночный планшет с). Таким образом, этот подход будет также подходит для полностью автоматизированной системой, например системы робота ELISA. В отличие от используемых в настоящее время методов, эти анализы количественный и это поможет, например, при изучении эффекта ингибиторов комплемента. Кроме того, интерпретация цель, которая является улучшением по сравнению с использ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Fresenius Kabi
BSA	Sigma	B-4287
Барбитал	Фагрон	0261	Это химическое вещество подлежит регулированию лекарственных средств.
Барбитал натрия	Fagron	0263	Это химическое вещество подлежит регулированию лекарственных средств.
Желатин	Merck	1.0470.0500
Хлорид натрия	Merck	1.06404.1000
Хлорид магния	Merck	1.05833.0250
Хлористый кальций	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 аминовый реактивный краситель	Pierce	46402
Dylight 650 аминовый реактивный краситель	Pierce	62265
α С5 (Экулизумаб)	Alexion Pharmaceuticals
FACS (Canto)	BD		Можно использовать любую FACS, которая имеет подходящие лазеры.
Спектрофотометр (например, Multiskan spectrum)	Thermo Labsystems	1500-193	Любой спектрофотометр с правильным диапазоном длин волн может быть использован
программным обеспечением BD FACSDiva v 6.1.2	BD	643629	Любое совместимое программное обеспечение для анализа FACS может быть использовано
Bromelain	Sanquin	K1121