Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Summary

BoTest Матрица нейротоксин ботулизма (BoNT) анализы обнаружения быстро очистить и количественно Бонт из целого ряда образцов матриц. Здесь мы приводим протокол для обнаружения и количественного определения BoNT от обоих твердых и жидких матриц и продемонстрировать анализа с помощью ботокса, помидоры, и молока.

Abstract

Точное обнаружение и количественное определение ботулинического нейротоксина (ботулинического токсина) в комплексных матриц требуется для фармацевтической, экологических и испытаний образцов пищевых продуктов. Быстрое BoNT тестирование продуктов питания необходим во время вспышки экспертизы, диагностики пациента и тестирования безопасности пищевых продуктов в то время как точная потенции испытания для производства ботулинического токсина типа на основе лекарственного препарата и безопасности пациентов. Широко используется мышь биопроб для тестирования ботулинического токсина очень чувствительна, но не хватает точности и пропускной необходимое для быстрого и регулярного тестирования ботулинического токсина. Кроме того, использование биоанализе в животных привело к призывам лекарственного продукта регулирующими органами и сторонниками за права животных в США и за рубежом, чтобы заменить биоанализ мыши для тестирования ботулинического токсина. Несколько в пробирке запасные анализы были разработаны, которые хорошо работают с очищенной BoNT в простых буферов, но большинство из них не было показано, что применимо к тестированию в очень сложных матриц. Здесь, протокол для обнаруженияBoNT в комплексных матриц с использованием BoTest Matrix анализов представлена. Анализ состоит из трех частей: Первая часть включает в себя подготовку образцов для тестирования, вторая часть является шагом иммунопреципитацию использованием анти-Бонт антител покрытием парамагнитные шарики, чтобы очистить Бонт из матрицы, и третья часть количественно протеолитической изолированной Бонт в Деятельность, использующая флуорогенный репортер. Протокол написана для высокой пропускной тестирования в 96-луночных планшетах с использованием как жидкие, так и твердые матрицы и требует около 2 ч ручного приготовления с всего раз анализе 4-26 часов в зависимости от типа образца, токсинов нагрузки и желаемого чувствительности. Данные представлены для BoNT / A тестирования с забуференным фосфатом физиологическим раствором, лекарственного продукта, культурального супернатанта, 2% молока и свежих томатов и включает обсуждение критических параметров успеха анализа.

Introduction

Нейротоксинов ботулина (BoNTs) являются самыми смертоносными вещества, известные, с внутривенных человека смертельных доз оценивается в 1-3 нг / кг ^1,2. Семь структурно подобные серотипов BoNT, помечены через G, существует, каждый из которых состоит из тяжелой цепи домена, ответственного за связывание клеток, поглощение, и транслокации в цитозоль и легкой цепи, которая кодирует цинка эндопептидазы ^3-5. Изысканный токсичность BoNT результатом, в частности, его специфического связывания и вступление в моторных нейронов в нервно-мышечном соединении ^6. Оказавшись внутри нейрона, легкой цепи эндопептидаза специально расщепляет один или несколько из растворимого N-этилмалеимид чувствительных рецепторов белка привязанность фактором (SNARE) белков, необходимых для слияния пузырьков, ингибирования высвобождение нейромедиаторов и приводит к вялым параличом ^7-14. Обычно известный как болезнь "ботулизма", паралич диафрагмы и межреберных мышц по BoNT в конечном итоге приводитдыхательная недостаточность и смерть, если ранней диагностики и лечения принимаются.

Человека пищевого ботулизма чаще всего ассоциируется с ботулинического токсина серотипов A, B, E, и F (BoNT / A, BoNT / B, и т.д.) и обычно возникает в результате употребления в пищу загрязненных продуктов питания ^15,16, хотя несколько случаев раны ботулизма было зарегистрировано среди потребителей инъекционных наркотиков ^17,18. В Соединенных Штатах, детский ботулизм в результате проглатывания Clostridium спор детьми в возрасте до одного является наиболее распространенной формой ботулизма ^19-21. Тем не менее, были зарегистрированы пищевые вспышки ботулинического токсина в результате неправильного домашнего консервирования и переработки пищевых продуктов как в Соединенных Штатах и ​​за рубежом. Между 2000-2009 было зарегистрировано по меньшей мере 338 случаев пищевого ботулизма во всем мире в том числе шесть погибших ^22. Способность быстро и чутко обнаружить пищевого происхождения вспышек ботулизма является одним из важнейших признаков того, что может помочь ранней диагностики ^23,24. Кроме того, методы обнаружения, которые позволяют экономически эффективным и рутинное тестирование питания приведет к улучшению продовольственной безопасности.

Нейронов специфика Бонт и долго биологического полураспада также делает его мощным терапевтическим. В Соединенных Штатах, наркотики ботулинического токсина типа на основе утверждаются по контролю за продуктами и лекарствами для лечения косметических состояний и нервно-мышечных расстройств, связанных в том числе глабеллярных линий, цервикальной дистонии, мигрени, гиперактивного мочевого пузыря, и косоглазия. Многочисленные "не по прямому назначению" приложений задокументированы, в том числе высоких доз лечения тяжелой дисфункцией мышц ^25-28. Точная токсин количественное имеет решающее значение для правильного дозирования, как недокомпенсация может привести к неэффективному лечению в то время как передозировка ставит пациентов риску потенциально вредных побочных эффектов. К сожалению, ни стандартизированный протокол потенции анализ не является общим для производителей, в результате чего неравенства четкости блок между ботулинического токсина типа на основе произво наркотиковк.т.н. ^29-31.

Стандартный тест на BoNT является биоанализа мыши, в котором BoNT-содержащие образцы инъецировали внутрибрюшинно мышам и количество смертей, зарегистрированных в течение 1-7 дней ^16,32,33. Биологический мыши очень чувствительна с пределов обнаружения (LOD) 5-10 пг BoNT / A ^34, однако этические опасения по поводу использования животных, высокая стоимость обучения персонала и поддержание объектов животного, длинные раз анализе и отсутствие стандартизированные протоколы привели призывы разработать стандартизированную, животное без Бонт тестирования и методы количественной ^35-39. В последнее время несколько альтернативные методы ботулинического токсина количественного были разработаны, которые предлагают мыши или почти мыши чувствительность биопроб ^40-49. Эти методы обычно используют флуоресценцию, масс-спектрометрии, или иммунологические методы и предлагают раз опробования значительно короче биопроб мыши без использования животных. Масс-спектрометрии подходов в сочетании с иммунологической TechniqЕЭС были показаны для выявления и количественной BoNT содержится в продуктах питания и других сложных образцов, однако требования к обучению персонала и предел специализированное оборудование этих анализов ^50-55. Большинство других альтернативных анализы не всегда применимы к сложной образца тестирования или не хватает пропускной способности, необходимой для регулярного тестирования ботулинического токсина. Сильно варьирует характер образца пищевой вязкости, рН, содержание солей и матричных компонентов представляет особенно трудную задачу, пытаясь развить в пробирке методы анализа с чувствительностью, чтобы соответствовать крайнюю потенцию BoNT. Кроме того, даже простые и относительно доброкачественные буферные системы, такие, как в результате ресуспендированием лекарственных продуктов ботулинического токсина типа на основе, содержат соли, альбумина и сахара стабилизаторы (т.е. наполнители), что значительно повлиять в пробирке BoNT потенции ^56. Очистка Токсин требуется для точной деятельности тестирования всех, кроме простейших образцов ^56-59.

BoTest Матричные анализы предназначен для быстрого, высокой пропускной способностью, и в соответствии количественное BoNT от очень сложных образцов с использованием оборудования обычно встречаются в научно-исследовательских лабораториях ^56,60. Эти анализы использовать парамагнитные шарики, ковалентно связанные с серотипа конкретных анти-ботулинического токсина антител связываться и поглощения Бонт из образца, а затем удалить вмешиваясь матричные соединения промывкой. После промывания, граница протеолитическую активность ботулинического токсина затем количественно в оптимизированном реакционного буфера, используя репортер, совместимый с серотип ботулинического токсина проходит испытания. Эти репортеры флуорогенные белки, состоящие из N-концевой голубой флуоресцентный белок (СФП) фрагмент и желтый флуоресцентный производной (Венера) фрагмент С-концевой белок, связанный с помощью ботулинического токсина подложки, SNAP25 остатков 141-206 или синаптобревин остатков 33-94 составляющих BoTest / E или B / D / F / G репортеры, соответственно ^45. Репортер расщепление BoNT контролируется с использованием Förster резонансный перенос энергии (FRET). При тон репортер не повреждена, возбуждение CFP приводит лад с Венеры, закалки эмиссию CFP и интересно излучение Венеры. Расщепление репортера по BoNT предотвращает FRET, что приводит к увеличению эмиссии CFP и снижения выброса Венера. BoNT активность может быть количественно измерена с помощью соотношение количества выбросов CFP и Венеры. LOD ниже 3 мкг возможны из широкого спектра пищевых продуктов с использованием высокой пропускной формат 96-луночный планшет ^56. Увеличение чувствительности могут быть получены с использованием больших объемов образцов, так как анализ позволяет концентрацию токсина на поверхности шарика.

Матрица анализы BoTest для BoNTs А, В, Е и F были разработаны и протестированы с пищевой, фармацевтической, и проб окружающей среды ^56,60. Здесь мы описываем процедуры для выполнения этих анализов для обнаружения BoNT в низкой сложности (например, фармацевтической, BoNT в буфере) и высокая сложность (например, продукты питания, экологической) образцы. Конкретные методы обработкина несколько типов образцов, рассматриваются в данном протоколе и типов образцов, не описанные здесь, как правило, могут быть адаптированы с помощью комбинации представленных методов. Протокол был разработан и испытан с BoNT / A, но адаптированы к условиям других серотипов ботулинического токсина использовали свою анализов, как показано в другом месте ^56,60.

Protocol

1. Подготовка реагентов для анализа

1. Thaw 200x дитиотреитола (DTT), 10x Матрица Связывающий буфер (10х буфера для связывания далее), 10x нейтрализации буфера (рН пищевых или несбалансированные образцы только) и 10x BoTest Реакционный буфер (10х реакционного буфера далее) при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин или до полного оттаивают. См. Таблицу 1 для списка буферов и реагентов, используемых в данном протоколе. См. Таблицу 2 для списка материалов и оборудования, необходимых для этого протокола.
2. Vortex талой буферы для 5 сек перемешать. 10x Нейтрализация буфера, 200xDTT и 10x Реакция буфер должен появиться ясно в то время как связывание буфера 10x будет иметь мутный вид. Нагревают 10x реакционного буфера в течение 5 мин при 37 ° С и повторить вихревание, если он появляется облачно следующее размораживание.
3. Генерация 3,8 мл 1x реакционного буфера.
   1. Этикетка 15 мл коническую трубку "1x реакционного буфера" и добавить 3,42 мл молекулярная биология класс Ватэ-э, 380 мкл 10х Реакция буфера и 19 мкл 200x DTT. Смешайте буфера хорошо инверсии.
   2. Ингибиторы вырезать отдельную ЭДТА без ингибитор протеазы таблетку в кварталах с использованием чистой лезвие и добавить одну четверть таблетки на 1х реакционного буфера (остальные таблетки часть может храниться при 4 ° С для дальнейшего использования). NB протеазы не может быть необходимо, если с использованием очищенного токсина и простые буферы (например, фармацевтические образцов).
   3. Vortex 1x буфер Реакция пока протеазы таблетки полностью не растворится.
4. Теплый бисер Матрица A (IP-бусы далее) в течение 20 мин при комнатной температуре.
5. Оттепель репортеру BoTest / E (A / E репортер далее) при комнатной температуре в защищенном от света месте.
6. Этикетка 15 мл коническую трубку "0,5 мкМ / E-репортер" и добавить 45 мкл 20 мкМ / E репортера складе до 1,8 мл 1x реакционного буфера. Тщательно перемешать с помощью пипетки и хранить на защищенном от света льда.

2. СтоятьARD Образец Кривая поколения

Стандартная кривая описано здесь охватывает 10-30,000 MLD ₅₀ / г пищи или за буфером мл в разведении полулогарифмических (табл. 3). Конечный пользователь может свободно использовать альтернативные концентрации в зависимости от обстоятельств.

1. Прокалывание и инкубации матрицы с справочного материала. Генерация стандартной кривой с использованием разбавителя из той же матрицей, как неизвестный, по возможности, снизить матричные эффекты. Использование желатина фосфатного буфера (ГПБ) или фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве разбавителя, если дополнительные, BoNT-отрицательных матрица не доступны (например, поле или BoNT вспышка тестирование образец). Генерирование стандартную кривую пики BoNT / A в матрицу выбора после соответствующего протокола ниже.
   1. Образцы низкой сложности (например, PBS, ГПБ, или фармацевтической)
      1. Добавьте 10 мл соответствующего буфера в 15 мл коническую трубку и отложите в сторону. Этот пример будет использован в качестве разбавител дл стандартизации Организацииг кривой и неизвестные разведения (раздел 4).
      2. Добавить 1,2 мл буфера для микроцентрифужных трубки.
      3. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материалов должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в 1,2 мл образца так, чтобы конечная концентрация 30 000 ₅₀ MLD / мл (36000 MLD ₅₀ всего).
   2. Образцы Жидкие пищевые (или другие сложные жидкие образцы) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов как твердых частиц (. Например целлюлозно) в жидких матриц будет меняться. Этот протокол предполагает не менее 1,2 мл осветленной надосадочной будет оправился от 1,4 мл SAMPле. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Добавьте 10 мл жидкой пищи к 15 мл коническую трубку и отложите ее в сторону. Этот образец будет использоваться в качестве разбавителя для стандартной кривой и неизвестных разведения (раздел 4).
      2. Взвесьте пустой 1,5 трубки микроцентрифужных мл и записать его массу.
      3. Добавить 1,4 мл жидкого пищи взвешенной микроцентрифужных трубки.
      4. Взвешивают в микроцентрифужную пробирку и рассчитать массу добавленного образца пищевого путем вычитания массы пустой трубы.
      5. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материалов должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в образце 1,4 мл при конечной концентрации 30 000 ₅₀ MLD / г пищи.
      6. Инкубациит.е разбавитель и шипами образцы при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение 2 часов, чтобы дать время BoNT взаимодействовать с пищевой матрицы, имитируя естественное загрязнение.
   3. Образцы твердой пищи (или в других твердых образцов) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта, выделенного из усредненных и осветленных образцов после добавления 1 мл ГПБ / г пищи. Этот протокол предполагает, что по крайней мере 1,2 мл осветленный супернатант будут восстановлены из 2 г образца. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Взвесить 10 г твердого образца в 50 мл коническую трубку и отложите в сторону. Это будет использоваться в качестве разбавителя.
      2. Взвесить 2 г твердого образца пищи во второй 50 мл коническую трубку.
      3. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материаловс должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в поверхности 2 г образца в конечной концентрации 30 000 ₅₀ MLD / г пищи (60000 общий MLD _50).
      4. Инкубируйте разбавитель и шипами образцов при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение 2 часов, чтобы дать время BoNT взаимодействовать с пищевой матрицы, имитируя естественное загрязнение.
2. Образец гомогенизации и буфер регулировки. Обработайте шипами стандартного образца кривой и разбавителя сгенерированный выше в зависимости от типа образца.
   1. Низкие образцы сложности
      1. Никакой дополнительной обработки образцов не требуется.
   2. Образцы жидких пищевых продуктов (или другие сложные жидкие образцы)
      1. Нет образец гомогенизации не требуется.
      2. Добавить 140 мкл 10x нейтрализации буфера с 1,4 мл шипами образец и 1 мл 10x Обезвреживаион буфер для разбавителя образца на 10 мл. Смешайте образцы хорошо инверсии.
      3. Частично прояснить оба образца центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.
   3. Образцы твердой пищи (или в других твердых образцов)
      1. Добавить 2 мл ГПБ (1 мл ГПБ / г пищи) к 2 г BoNT / A-шипами твердого образца продуктов питания и 10 мл ГПБ в 10 г разбавителя образца.
      2. Гомогенизируют образцы, используя пестик пока полностью не смешиваются. В зависимости от природы пробы, могут быть небольшие куски материала, который не может быть гомогенизируют, который является приемлемым. С другой стороны, могут быть использованы механические методы гомогенизации. Использование блендер не рекомендуется, поскольку это может инактивировать а также аэрозоль токсин.
      3. Добавить объем 1/10th из 10х буфера для нейтрализации разбавителя образца на основе приближенного общего объема (например, 2 мл, если объем 20 мл). ЭкстраполироватьОбщий объем / образец ботулинического токсина А-шипами и добавить объем 1/10th из 10х нейтрализации буфера. Смешайте образцы хорошо инверсии.
      4. Частично прояснить оба образца центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.
3. Подготовка стандартной кривой серийные разведения для тестирования
   1. Использование BoNT / A-шипами стандартного образца кривую, как D1 и nonspiked образец в качестве разбавителя, генерировать оставшиеся стандартных образцов кривой в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в соответствии с таблицей 3.

3. Подготовка неизвестных образцов

В этом разделе может быть завершена в параллельной секции 2.

1. Определить количество и разведения неизвестных. Проверьте неизвестных в трех экземплярах, если это возможно.
   1. Для качественных анализов, запускать неизвестные без дальнейшего разбавления, чем требуется для обработки образца, как descriкровать ниже.
   2. Для количественных анализов, подготовка по меньшей мере два 1:10 разбавление образцов, как описано ниже, чтобы гарантировать, что один или более образцов попадают в пределах линейного диапазона ответа анализа. Создать разведения с использованием разбавителя из той же матрицей, как неизвестное, если это возможно, чтобы уменьшить матричные эффекты, как описано в разделе 3. В противном случае, использовать PBS или ГПБ в качестве разбавителя.
2. Создание и разбавления неизвестных образцов в зависимости от типа образца.
   1. Низкие неизвестных сложности (например, PBS, ГПБ, или фармацевтической)
      1. Добавить по крайней мере, 750 мкл неизвестные микроцентрифужных трубки для генерации Неизвестный разбавление 1.
      2. Добавить 675 мкл разбавителя для двух микропробирок меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      3. Серийно разбавить разбавление 1 путем передачи 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      4. Серийно разбавлятье разведение 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.
   2. Жидкие неизвестные питания (или другие сложные жидкие образцы) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов, как описано в разделе 3. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Добавить ≥ 875 мкл жидкой неизвестны микроцентрифужных трубки.
      2. Добавить объем 1/10th из 10х нейтрализации буфера образца (например, 87,5 мкл для 875 мкл образца).
      3. Частично уточнить образец центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Сразу передачи супернатант в новую пробирку. Это неизвестно разбавления 1.
      4. Добавить 675 мкл разбавителя для двух труб меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же обработке материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      5. Серийно разбавить разбавление 1 переводомкольцо 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      6. Серийно разбавить разбавление 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.
   3. Твердые неизвестные питания (или в других твердых образцов) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов, как описано в разделе 3. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Взвесить 2 г твердого неизвестного образца в 50 мл коническую трубку.
      2. Добавить 2 мл ГПБ (1 мл ГПБ / г пищи) к 2 г твердого образца.
      3. Гомогенизируют образцы, как описано в разделе 3.2.3.2.
      4. Добавить объем 1/10th из 10х буфера нейтрализации к образцу на основе приближенного общего объема (например, 0,4 мл если объем 4 мл). Смешайте образцы хорошо инверсии.
      5. Частично уточнить образец центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Immediatelу передачи ≥ 750 мкл супернатанта в микроцентрифужных трубки. Это неизвестно разбавления 1.
      6. Добавить 675 мл разбавителя до двух трубок меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же обработке материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      7. Серийно разбавить разбавление 1 путем передачи 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      8. Серийно разбавить разбавление 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.

4. Окончательная проба Разъяснение

Если тестирование жидкие или твердые образцы продуктов питания, центрифуги все образцы в течение 5 мин при ≥ 14000 мкг в микроцентрифуге в полной мере прояснить образцы. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.

5. Тарелка Настройка и BoNT / Pull Down

1. Конкретная схема пластины зависит от приложения, однако, не следует использовать внешние скважин с тем,чтобы избежать краевых эффектов. Каждый неизвестный образец и стандартный образец кривая D1-D8 требуется 3 скважины в то время как образец D9 требуется 6 скважин. Предлагаемый макет пластина показано на рисунке 1.
2. Добавить 20 мкл 10х буфера для связывания в каждую лунку быть использованы.
3. Добавить 200 мкл каждого осветленной разбавления и неизвестно к каждому из трех скважин (шесть скважин для D9) для трех экземплярах тестирования. Смешайте пластины в течение 10 сек на микропланшет-смесителе.
4. Добавить бусинки IP-A.
   1. Вихревые шарики IP-A в течение 10 секунд на максимальной скорости. Продолжить вихревание если шарики не полностью ресуспендировали и однородным.
   2. Внесите 20 мкл IP-Бусы в каждом образце хорошо.
   3. Смешайте пластины в течение 30 сек на микропланшет-смесителе.
5. Инкубировать при помощи вращающейся пластины инкубатор в течение 2 часов при 750 оборотах в минуту, 25 ° С или комнатной температуре. Проведение теста сильно зависит от генерации и поддержании IP-шарик суспензии в течение всех этапов инкубации. Всегда ресуспендируйте шарики с micropпоздно смеситель после гранулирования и поддерживать приостановку используя орбитальный микропланшетах шейкер в течение всех этапов инкубации.

6. Тарелка Стиральная и бисера Ресуспендирование

1. Вымойте тарелки вручную или с помощью магнитного шарика-совместимый автоматизированный плоскую шайбу. Автоматизированная промывания планшетов настроен на магнитных шариков значительно увеличивает анализа пропускной способности.
   1. Руководство Стиральная
      1. Этикетка 50 мл коническую трубку "1x промывочного буфера" и добавить 45 мл молекулярная биология класс воды и 5 мл 10x Матрица промывочного буфера. Смешайте буфера хорошо инверсии.
      2. Извлеките пластину с вращающейся пластины инкубаторе.
      3. Сразу же место пластину на 96-луночном магнитный шарик разделительной пластине в течение 5 мин.
      4. Удерживая пластину на 96-луночного разделения магнитного шарик плиты, аккуратно снимите и выбросьте супернатанты из образца скважин с помощью пипетки одно-или многоканальный. Не аспирациибисер-визуально контролировать атмосферный буфер в пипетки для случайного удаления борта. Если удаление свидетелем, мягко добавить содержимое наконечников обратно в скважины, reseparate, и повторите удаление.
      5. Добавить 300 мкл буфера 1x Wash к каждому образцу хорошо.
      6. Полностью ресуспендируют бисером путем смешивания пластины в течение 30 сек на микропланшет-смесителе.
      7. Инкубировать на 96-а магнитное борта разделительной пластины в течение 2 мин.
      8. Снимите и выбросьте супернатанты из образца скважин, как и раньше.
      9. Повторите шаги 6.1.1.5-6.1.1.8 еще три раза в общей сложности 4 стирок.
      10. С пластины на 96-а магнитное борта разделительной пластины, осмотрите скважин для подтверждения даже надосадочную удаление; использовать пипетку, чтобы удалить лишнюю остаточный буфер по мере необходимости. Некоторые буфера останется в скважинах и необходимо позаботиться, чтобы избежать удаления шарик или шарик сушки.
      11. Добавить 50 мкл 1x буфер реакция на каждого образца скважины и смешать тарелку для 30 SEс на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером. При необходимости используйте пипетку, чтобы полностью ресуспендируют бисером.
   2. Автоматизированная Стиральная плиты
      1. Установка и программа шайба согласно таблице 4. Чистый и флеш шайба с высоким качеством (например NanoPure) воды.
      2. Премьер-шайба, запустив программу "Премьер".
      3. Извлеките пластину с вращающейся пластины инкубаторе.
      4. Сразу же место пластину на 96-а магнитное борта разделительной пластины на пластины шайбой.
      5. Запустите программу ссылка «Мастер Wash". Первым шагом программы является шагом инкубации 5 мин, где шайба будет стационарным.
      6. После завершения программы, удалить пластину из мойки, добавить 50 мкл 1x реакционного буфера к каждому образцу хорошо, и смешать пластину в течение 30 сек на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером. При необходимости используйте пипетку, чтобы полностью ресуспендируют бисером.

   7. Анализ Инициирование и Инкубационный

   1. Добавить 50 мкл 0,5 мкМ / E репортера (см. раздел 1) для каждого образца скважины и перемешивать в течение 30 сек на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером.
   2. Добавить 100 мкл воды для каждого неиспользуемого скважины на тарелку, чтобы предотвратить краевые эффекты.
   3. Уплотнение пластину с пластиной герметизирующей лентой и инкубируют планшет с использованием вращающейся пластины инкубатор при 750 оборотах в минуту, 25 ° C или RT. Защитите пластину от света во время инкубации.

   8. Сбор и анализ данных

   Примечание: Этот анализ в режиме реального времени анализ, который может быть измерена несколько раз, пока не будет достигнуто желаемое чувствительность, нет никаких стоп-реагенты. Рекомендуемые начальные время чтения являются 2, 4 и 24 часа в сутки время инкубации с чувствительности анализа возрастает со временем инкубации.

   1. Сбор данных
      1. На каждом читать времени, удалить пластину из вращающейся пластины инкубатора, снять пломбуING ленту, и сразу же поместите пластину на 96-а магнитное борта разделительной пластины. Разрешить шарики, чтобы отделить в течение 2 мин.
      2. Место пластины в микропланшетного и измерять выбросы на ~ 470 и ~ 526 нм при возбуждении в ~ 434 нм.
      3. Если дополнительные время чтения желательно, ресуспендируют бисером в течение 30 сек на микропланшет-смеситель, запечатать пластину, и вернуть пластину к вращающейся пластины инкубаторе.
   2. Анализ данных
      1. Рассчитать отношение выбросов для каждого образца путем деления относительного блок флуоресценции значение (РФС) на 526 нм по значению РФС на 470 нм.
      2. Участок соотношение выбросов по сравнению с журнала [BoNT / A] для стандартных точек данных кривой. В зависимости от BoNT / A диапазоне потенции проверено, сигмоидальная кривую доза-реакция будет получена (см. репрезентативные результаты).
      3. Установите стандартные данные кривой с переменным наклоном доза-реакция кривой Y = Нижняя + (верх-низ) / (1 ​​+10 ^ ((LogEc _50-X) * Hillslope)), где X являетсялогарифм концентрации, Y является ответом, и Y начинается в нижней части и идет к вершине с сигмоидальной форме.
      4. Определить границы обнаружения (LOD), пределы количественного (ПКО) и полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС _50). Пределы обнаружения определяются в качестве образца, имеющего соотношение выбросов менее 3 стандартных отклонения (SDS) ниже пустых управления (N = 6). Пределы количественного определяются как образец, имеющий степень эмиссии менее 10 СД ниже пустых управления (N = 6). EC ₅₀ определяется из сигмоидальной кривой подгонки доза-ответ.
      5. Интерполировать потенцию неизвестных образцов против сигмоидальной стандартной кривой доза-реакция.
         1. Для количественных результатов, неизвестный образец в идеале должна находиться в пределах линейной части калибровочной кривой. Аппроксимировать линейной части калибровочной кривой путем расчета общее окно отклика анализ 20-80% (например, если коэффициент эмиссии стандартной кривой гАнгес от 0,5-2,5, линейный диапазон будет часть стандартной кривой в диапазоне от 0,9-2,1).
         2. Для качественных результатов, сравнение неизвестного образца по отношению к LOD и LOQ стандартной кривой.
         3. Не экстраполировать неизвестных образцов за пределы стандартной кривой.

Results

Схема подведения шаги в описанной протокола показано на рисунке 2. Анализ требует от 4-26 часов, чтобы завершить в зависимости от типа образца и желаемой чувствительности анализа, но только ~ 2 часа из практического времени. Анализ проводят в 96-луночных планшетах и, в зависимости от типа тестирование выполняется, позволяет трех экземплярах тестирование до 20 образцов в том числе стандарты на чашку.

Фиг.3 показывает репрезентативные результаты анализа с испо...

Discussion

Этот протокол описывает процедуры для количественного BoNT / A сложный, голотоксина или Clostridium супернатанта культуры в комплексных матриц. Протокол то же самое, однако, при тестировании других серотипов ботулинического токсина (например BoNT / B, E, и F) с соответствующими Matrix анализов ^56,60, хотя анализ чувствительности будет варьироваться в зависимости от серотипов и анализов. Этот протокол не учитывает для каждого типа образца возможно и некоторые модификации могут потребоваться в...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Наборы для обнаружения BoNT/B и F.
Флуоресцентный микропланшетный ридер Varioskan Flash	Thermo Fisher Scientific	5250040	Можно использовать большинство монохроматоров или фильтров с возбуждением 434 нм и способностью излучения 470 нм и 526 нм.
96-луночная пластина для разделения магнитных шариков	V& P Scientific	VP771H	Можно использовать и другие магнитные пластины, но пластина должна быть спроектирована таким образом, чтобы отделять шарики сбоку от лунки.
Магнитная шайба для мытья пластин	BioTek	ELx405 VSRM	Опционально, требуется только для автоматической мойки тарелок. Также можно использовать другие шайбы, совместимые с магнитными шайбами, но перед использованием их следует проверить.
Микроцентрифуга			Опционально, требуется только для образцов, нуждающихся в центрифугировании.
Пластинчатый миксер	MixMate Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Используется при комнатной температуре или при температуре 25°°; C Если доступен контроль температуры
, таблетки ингибитора протеазы без ЭДТА	Roche	4693132001	Требуется только для тестирования пищевых продуктов или окружающей среды. Ингибиторы протеазы не должны содержать ЭДТА.
BoNT/A	Метабиологические препараты		Необязательные, требуются только для целей стандартизации и количественного определения
Черные, плоскодонные 96-луночные пластины	NUNC	237105	Пластины не следует обрабатывать
96-луночные пластины Уплотнительная лента	Thermo Fisher Scientific	15036