Визуализация нейробласта Цитокинез Во С. Элеганс Эмбриогенеза

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как изображение делящихся клеток в ткани в Caenorhabditis Элеганс эмбрионов. В то время как несколько протоколов описывают, как разделение изображения клеток в раннем эмбрионе, этот протокол описывает, как изображение деление клетки в развивающемся ткани во время середины позднего эмбриогенеза.

Аннотация

Этот протокол описывает использование флуоресцентной микроскопии для изображения делящихся клеток в развитии Caenorhabditis Элеганс эмбрионов. В частности, этот протокол фокусируется на том, как изображение деления нейробластов, которые находятся под клеток эпидермиса и могут иметь важное значение для эпидермального морфогенеза. Формирование тканей имеет решающее значение для развития многоклеточных и полагается на внешние сигналы из соседних тканей. С. Элеганс является отличным модельным организмом для изучения тканей морфогенез в естественных условиях из-за его прозрачности и простой организации, что делает его ткани легко изучать с помощью микроскопии. Брюшные корпус является процесс, в котором вентральной эмбриона покрыта одним слоем эпителиальных клеток. Это событие, как считается, способствует основных нейробластах, которые обеспечивают химические сигналы наведения посредничать миграцию вышележащих эпителиальных клеток. Тем не менее, нейробласты весьма пролиферативного а также могут действоватьв качестве субстрата для механической вентральных клеток эпидермиса. Исследования с использованием этого экспериментальный протокол может раскрыть важность межклеточной коммуникации во время формирования ткани, и могут быть использованы для выявления роли генов, участвующих в клеточном делении в развивающихся тканях.

Введение

В то время как существуют протоколы, описывающие, как разделение изображения клеток в начале C. Элеганс эмбрионов, этот протокол описывает, как разделение изображения клеток в ткани во время середине эмбриогенеза. Одна из основных проблем в визуализации организмов в процессе разработки была их чувствительность к фототоксичности. Тем не менее, расширение доступности к вращающемся диске конфокальной микроскопов или прокатилась микроскопов полевых позволило более широкое применение визуализации. Обе системы используют твердотельные лазеры и рассеянный свет, ограничивая уровни УФ, что организмы подвергаются. Тем не менее, Widefield стенды-прежнему можно использовать для работы с изображениями в естественных условиях, особенно если они оснащены камерами с высокой чувствительностью (например EMCCD), управление диафрагмой и управления освещением (например, светодиодов или регулируемые ламп ртуть). Этот протокол описывает, как использовать либо систему конфокальной основе или системы с широким полем зрения до разделения изображений клеток в развитии С. Элеганс </ EM> эмбрионы. В качестве примера, мы опишем, как изображение деление нейробластов клеток. Нейробласты может способствовать эпидермальный морфогенез, предоставляя химические или механические сигналы в клетки эпидермиса вышележащих, и обеспечить отличный пример важности межклеточной коммуникации в формировании тканей.

Caenorhabditis Элеганс является идеальным модельным организмом для исследований микроскопии, основанные из-за его прозрачности и простой организации ткани ^1. Кроме того, С. Элеганс поддается генетических методов и RNAi, и так как многие из его генов у человека гомологи, он может быть использован для идентификации консервативных механизмов для формирования ткани ^2-5. В С. Элеганс, формирование эпидермиса происходит в течение середины эмбриогенеза, когда эмбрион имеет> 300 клеток. Эпидермального морфогенез состоит из нескольких основных этапов, в течение которых эмбрион закрытых в слое клеток эпидермиса, что сужают и расширяют превратить EMBRлет от яйцевидной формы в продолговатой формы червя ^6. Брюшной корпус описывает один из этих морфогенетических событий, когда брюшные клетки эпидермиса мигрируют в направлении вентральной срединной линии, чтобы покрыть вентральной поверхности эмбриона (рис. 1). Во-первых, две пары передних расположенный передней кромки клеток мигрировать в направлении вентральной средней линии, где они прилипать и плавким предохранителем с их соседей контралатеральной ^6. Это сопровождается миграции задних расположен карман клеток, которые образуют клин как форм, создающих вентральной карман ^6-7. Механизм, который закрывает карман не очень хорошо понял. Одной из возможностей является то, что supracellular актина структура миозина сократительная связывает карманные клетки вместе в кошелек строки, как мода, подобно ранозаживляющее ^8. Интересно, что миграция некоторые из кармана клеток опосредовано специфическими подмножеств, лежащих в основе нейробластов ⁹ (нейрональных предшественников, которые находятся под epidermiс; фиг.1В).

Предыдущие исследования показали, что нейробласты регулировать вентральной миграцию клеток эпидермиса и вентральной корпус. VAB-1 (эфрин рецептор) и VAB-2 (эфрин лиганд) экспрессируются на высоком уровне в нейробластах и облегчить сортировку передних и задних нейробластах друг от друга, и мутации в VAB-1 или VAB-2 вызывают брюшной корпуса фенотипы ^10-13. Тем не менее, промоутер спасательные эксперименты показали, что VAB-1 также требуется в вышележащих брюшных клеток эпидермиса и рецепторов для других сигналов наведения секретируемых нейробластах выражаются в вентральной клеток эпидермиса ^9. Хотя мутации в любом из этих рецепторов вызывает брюшной фенотипа шкафа, это не ясно, если дефекты возникают из-за проблем в нейробласта позиционирования или из-за отказа вентральных клеток эпидермиса реагировать на сигналы наведения ^14. Изменение разделение нейробласты Wiства без сказывается на их способности выделять сигналы наведения могли бы пролить свет на роль нейробластов и их способности обеспечивать механическую вход во эпидермального морфогенеза. Недавно было обнаружено, что ген, деление клеток, ани-1 (anillin) экспрессируется на высоком уровне в нейробластов (рис. 2а) и его истощение вызывает нейробластов деление дефектов. Интересно, что эти эмбрионы отображения брюшной фенотипа шкафа (Fotopoulos, Wernike и Piekny, неопубликованные данные).

Anillin требуется для деления клеток, и особенно для цитокинезе, которая описывает процесс, в котором материнская клетка физически делит на две дочерние клетки. Цитокинез движет формированию сократительной кольца актомиозинового, который должен быть под жестким контролем в пространстве и времени, чтобы убедиться, что он правильно подключен с сестринских хроматид сегрегации. Главный регулятор многоклеточных цитокинезе является RhoA (Ро-1 в C. Элеганс), небольшой ГТФ, что являетсяCTIVE в ГТФ-связанной форме. ГЭФ Ect2/ECT-2 активирует RhoA, после чего RhoA-GTP взаимодействует с нижестоящих эффекторов, которые формируют сократительную кольцо и опосредуют его втеканию ^15. Anillin является мульти белок домена, который связывается с RhoA через его С-конце и с актином и миозином через его N-конце. Anillin требуется, чтобы стабилизировать положение сократительной кольца в млекопитающих или Drosophila S2 клетках ^16. Истощение Anillin вызывает сократительные кольца пройти боковые колебания, и в конечном итоге терпит неудачу цитокинез формирования многоядерных клеткам ^17-19. Интересно, что хотя С. Элеганс ани-1 координат актомиозина сократимость в ранних эмбрионов, это не является необходимым для цитокинеза. Однако, как описано выше, ани-1 требуется для нейробластов цитокинеза в течение середины эмбриогенеза (Fotopoulos, Wernike и Piekny, неопубликованные данные). Отказ Цитокинез бы менять количество и положение нейробластах и ​​может повлиять на Locданию химических сигналов наведения, или он может изменить механические свойства ткани. Обе модели выделить неавтономную роль нейробластах для брюшной корпусе, и важность ткани ткани связи во время эмбрионального развития.

Это экспериментальный протокол описывает, как разделение изображений клеток во время С. Элеганс середине эмбриогенеза с помощью флуоресцентной микроскопии. Большинство экспериментов по изучению механизмов клеточного деления были выполнены в единичных клеток в культуральные чашки (например. HeLa или S2 клетках) или в ранних эмбрионов с ограниченным числом клеток (например, C. Элеганс один клеток эмбриона, Xenopus, или иглокожих эмбрионы). Тем не менее, важно также изучить деление клеток в тканях, так как есть внешние сигналы, которые могут влиять на выбор времени и размещение разделительной плоскости. Кроме того, клетки могут обеспечить химические или механические сигналы, чтобы влиять на развитие соседних тканейс, и очень важно, чтобы понять, как межклеточное общение помогает тканей с образованием в процессе разработки.

Протокол

1. Подготовка пластин для Поддержание Worm штаммов и исполнительских RNAi

1. Нематоды Рост Медиа Плиты
   1. Плиты
      1. Подготовка нематода питательной среды (NGM) пластины для поддержания штаммов червь и выполнять генетические кресты. Смешайте 3 г NaCl, 17 г агара и 2,5 г бактопептона с 1 л дистиллированной воды в 2-литровую колбу и добавить панель металл перемешивания.
      2. Автоклав колбу для растворения агара и стерилизовать средства массовой информации. Затем колбу помещают на магнитной мешалки и позволяют средства массовой информации остыть при перемешивании.
      3. После того, как средства массовой информации остынет и еще несколько теплый на ощупь (45-50 ° С), добавить 1 мл 1 М CaCl _2, 1 мл 1 М MgSO _4, раствор 1 мл 5 холестерина мг / мл и 25 мл 1 М калий-фосфатный буфер (ППБ; рецепт в таблице реагентов / материалов; фильтр стерилизовать растворы) и сразу же залить СМИ на мелкие чашки Петри (60 мм х 15 мм; заполнить посуду ~ 3/4 к верхней или 13 мл / пластины USIнг автоматизированную дозатор). Примечание: для длительного поддержания некоторых штаммов тетрациклина могут быть добавлены к пластинам (12,5 мкг / мл), чтобы позволить TN10 транспозона инактивации бактериальных гена РНКазы III.
      4. Пусть СМИ укрепить ночи при комнатной температуре. Примечание: Пластины должны храниться в биологической капотом или в зоне лаборатории, которая меньше склонны к загрязнению. Кроме того, удалите конденсат, который построен на крышках (например чистых салфеткой), чтобы ограничить грибковой загрязнения. Если Тетрациклин также добавляли в планшеты, затем покрыть их с алюминиевой фольгой, как этот антибиотик является светочувствительным.
      5. На следующий день, семена сухие NGM пластин с суспензией E. палочки (штамм OP50, см. раздел 1.1.2), который был мягко встряхивали. Чтобы пластины для спаривания, добавить ~ 50 мкл OP50 в центре каждой пластины (с образованием небольшой круг). Чтобы пластины для поддержания штаммов червь, семена каждый NGM пластины с ~ 100-200 мкл OP50 (кгарантировать, что он охватывает большую площадь пластины).
      6. Пусть отобранные плиты сухой o / n при комнатной температуре.
      7. На следующий день, поверните высушенные NGM пластин с ног на голову и складывать их в пластиковые контейнеры для хранения при 4 ° С. Примечание: Плиты могут использоваться до ~ 3-4 недели. Плиты, содержащей тетрациклин следует хранить в темноте.
   2. Еда
      1. Используйте E. палочка OP50 [от Caenorhabditis генетический центр (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] в качестве источника пищи для C. . Элеганс Примечание: OP50 могут быть сохранены как запасы глицерина при температуре -80 ° С (соотношение 1:01 в 50% об / об глицерине).
      2. Чтобы OP50 для пластин NGM, чтобы полоса пластину с помощью небольшого аликвоты раствора в глицерине (<10 мкл; использовать стерильный наконечник пипетки). Распространение бактерий на чашке с агаром LB (рецепт в таблице реагентов / материалов) и оставить ее при 37 ° С в течение ~ 16 часов. Примечание: Если есть проблемы с загрязнением, стрептомицина устойчивы OP50 может использоваться,й стрептомицин могут быть добавлены в чашки с агаром LB (50 мкг / мл).
      3. На следующий день, выбрать одну колонию и инокул ции 100 мл жидкой LB-среде (рецептов в таблице реагентов / материалов) в 500 мл колбу.
      4. Пусть культуры растут O / N при 37 ° С при встряхивании.
      5. На следующий день, используйте бактериальной суспензии для посева NGM пластин. Примечание: OP50 может быть аликвоты в 50 мл конические пробирки и хранили при 4 ° С в течение ~ 4-6 недель.
2. РНК-интерференции
   Кормление является одним из основных способов выполнения РНК опосредованное вмешательство (RNAi; в нокдаун конкретный продукт гена) в С. Элеганс. С. Элеганс гермафродиты можно подавать E. Штамм HT115 трансформированная вектором кормления, который выражает дсРНК при индукции. Это дцРНК (или его фрагменты), передается на гонады, как правило, приводит к существенному нокдаун конкретного гена-мишени.
   1. RNAi Плиты
      1. Подготовка NGM пластины, как описано выше (см. раздел 1.1.1), но и добавить 1 мл 1 М IPTG (изопропилтио-бета-D-галактозид; чтобы индуцировать экспрессию дсРНК) и 500 мкл 50 мг / мл ампициллина (Amp; векторы, выражающие дсРНК являются Amp устойчивостью) к теплому информации (45-50 ° C).
      2. После пластины высохли, семя их с ~ 50-100 мкл Е. палочка HT115 (см. раздел 1.2.2). Примечание: Unseeded пластины можно хранить при температуре 4 ° С в течение ~ 4-5 недель.
      3. Пусть отобранные плиты сохнуть в течение ночи при комнатной температуре.
      4. На следующий день, поверните высушенные RNAi пластины с ног на голову и хранить их в пластиковый контейнер для хранения при 15-20 ° С. Примечание: высевают пластины сохраняют эффективность RNAi для до ~ 2-3 недели.
   2. РНК-интерференции Питание
      1. Используйте E. палочка HT115 (от CGC, см. раздел 1.1.2) трансформируют вектором L4440 подачи или L4440, содержащей кДНК в геном. Примечание: Кормление библиотеки, ориентированные на большинство открытых рамок считывания в геномеуже были сделаны и доступны (клоны в L4440 превращается в HT115; например, содержащие фрагмент из Y49E10.19 Ани -1 ^20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / Страницы / rnai.html). Примечание: HT115 могут быть сохранены как запасы глицерина при температуре -80 ° С (соотношение 1:01 в 50% об / об глицерине).
      2. Чтобы создать новую конструкцию ориентации представляющий интерес ген, увидеть L4440 векторную карту и клон кДНК между фланговые T7 промоутеров, которые индуцируется IPTG.
      3. Transform HT115 с L4440 конструкции с использованием стандартного протокола для преобразования (например, сделать химически компетентные бактерии и выполнять теплового шока преобразование).
      4. Как описано в OP50 (см. раздел 1.1.2), подряд бактерии из раствора в глицерине на чашке с агаром LB, но пластины должны также содержать 50 мкг / мл ампициллина. Примечание: При использовании предварительно существующий L4440 конструкцию, пропустите разделы 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. Выберите одну колонию и привить 5 млЛ.Б. средах, содержащих 5 мкл ампициллин от 50 мг / мл складе (LB Amp) и поместить его при 37 ° С при встряхивании.
      6. После ~ 16 часов, привить 5 мл свежей LB Amp СМИ с 50 мкл культуры O / N и расти культуру на 7-8 часа при встряхивании при 37 ° С
      7. Центрифуга бактерии течение 1 мин при 4,000-8,000 мкг, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл свежей LB Amp СМИ.
      8. Используйте эту бактериальную решение, чтобы отобрать тарелки RNAi, как описано выше (см. раздел 1.2.1). Примечание: HT115 следует использовать немедленно и не должны быть сохранены.

2. Культивирование Worm Штаммы

Поддерживать C. штаммы Элеганс, заказанные в CGC на NGM пластин согласно стандартному протоколу ^1. Штаммы, используемые для этого протокола включают: C. Элеганс вар Бристоль, дикого типа (штамм ID в CGC N2); UNC-119 (tm4063); wgIs102 [ветчина-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + UNC-119 (+)] (штамм ID в CGC OP102); UNC-119 (ed3); ltIs44pAA173 [пирог-1п-mCherry :: PH (PLC1delta1) + UNC-11 9 (+)] (штамм ID в CGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [AJM-1 :: GFP + РОЛ-6 (su1006)] (штамм ID в CGC SU159); UNC-119 (ed3) ; xnIs96 [pJN455 (HMR-1п :: HMR-1 :: GFP :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (штамм ID в CGC FT250).

1. Pick ~~~HEAD=iobj 3 молодых взрослых гермафродитов, которые отображают правильный фенотип на свежий NGM пластины. Примечание: N2 (вар. Bristol; дикого типа) может поддерживаться между 15-25 ° С, но они будут достигать плотности быстрее при более высоких температурах. Новые акции должны быть сделаны, когда плотность червь высока.
2. Храните все люминесцентные штаммов (например GFP и / или mCherry-выражающие черви) при 20-25 ° С в течение оптимальной экспрессии флуоресцентных белков. Новые акции должны быть сделаны, когда плотность червь высока, и питания с низким.
3. Подобрать червей, использоватьвыбрать сделаны из вытащил стеклянную пипетку с проводом платины плавленого на вытащил конце (~ 3-5 см в длину). Свести провод с ровным краем. Использование выбор на "совок" до гермафродитов и перенести их на новых пластин. Пламя провод между использования, чтобы избежать перекрестного загрязнения штаммов.

3. РНК-интерференции

1. Выполнение RNAi
   1. Во-первых, место ~ 8 L4 гермафродиты на без затравки NGM пластины для ~ 30-60 мин для удаления OP50 бактерий из червей.
   2. Затем поместите 8 гермафродитов на качестве NGM Amp ИПТГ пластины засеянного HT115, который несет L4440 плазмиды, выразив дсРНК для интересующего гена (например Ани-1;. См. 1.2) для ~ 24 часов. Примечание: В зависимости от интересующего гена, или желаемым фенотипов (которое может зависеть от силы нокдаун), черви могут быть оставлены на пластинах РНК-интерференции на более или менее длительные периоды времени (после 24 часов, поместите гермафродитов на свежем РНК-интерференции пластины).
   3. Для негAtive контроль, место червей на РНК-интерференции пластины затравку HT115 балансовой пустой вектор L4440. Примечание: Эти эмбрионы не должны иметь никаких фенотипы.
   4. Для положительного контроля, место червей на RNAi пластины, экспрессирующих дцРНК, предназначенного ген с хорошо охарактеризованных фенотипов. Примечание: Для ро-1 (Y51H4A.3), эмбрионы 100% летальным после 24 часа в сутки и гермафродиты бесплодны после 48 часов.
2. РНК-интерференции Эффективность
   Уровни нокдаун по РНК-интерференции должны быть проверены, в частности, так как некоторые ткани могут быть более устойчивы, чем другие. В начале середине эмбриогенеза, большинство ткани RNAi-чувствительным, но в конце эмбриона или личинки, нейроны RNAi устойчивостью. Различные штаммы могут быть использованы для повышения чувствительности RNAi (например СБР-3), или для получения тканеспецифической RNAi (например, SID-1 в сочетании с трансгена, выраженной нервной промотора UNC-119).
   1. Вестерн блот
      Иммуноблоттинг помощью C. Элеганс белки могут бытьвыполнены согласно стандартному протоколу ^22.
      1. После выполнения RNAi, собирать ~ 10 беременных (наполненный эмбрионов) гермафродитов в микроцентрифужных трубки, добавить 20-30 мкл 1x SDS-PAGE буфер выборки и Lyse кипячением в течение ~ 2 мин. Аналогично, собирать N2 червей в отдельную пробирку для образца управления. Примечание: количество гермафродитов может изменяться в зависимости от чувствительности первичных антител.
      2. Создание разведений контрольного образца (например, 3-100%) в буфере для образцов. Загрузить контроль и образцы RNAi и запустить в ДСН-ПААГ в соответствии со стандартным протоколом (% гель будет варьироваться в зависимости от размера интересующего белка).
      3. Перенесите гель с мембраной и выполнять иммуноблоттинга в соответствии со стандартным протоколом. Примечание: Используйте различные первичные и вторичные антитела разведения в соответствии с рекомендациями для каждого антитела.
      4. Разработка (например, если с помощью хемилюминесценции) или сканировать (например, если с помощью флуоресценции) иммуноблоте и сравнить тыс.э плотность полос в N2 полос против переулка РНК-интерференции, и определить уровень нокдауна (например, плотность переулка РНК-интерференции соответствует управления переулок 12%, это говорит о том, что белок снижается на 88%). Примечание: Чтобы увидеть эффективность АНИ-1 нокдаун, см. Мэддокс и др. ^23.
   2. Иммуноокрашивание
      Иммуноокрашивание в С. Элеганс может быть выполнена согласно стандартному протоколу ^22.
      1. После выполнения RNAi, собирать беременных гермафродитов и эмбрионов урожая, используя один из двух методов. Для одного из методов, место гермафродитов в M9 буфера (рецепт в таблице реагентов / материалов) в 1,5 мл силицированного микроцентрифужных пробирок и осадок путем центрифугирования (1000-4000 мкг). Примечание: Точно собирать N2 беременных гермафродитов.
      2. Снимите решение M9.
      3. Извергните эмбрионов путем добавления 1 мл отбеливающего раствора (1 М NaOH, 5% отбеливатель) в микроцентрифужных трубки в течение 3 мин. Точно так же, отбеливатель N2 онrmaphrodites сделать контрольные слайды.
      4. Vortex мягко, то сразу осаждения эмбрионов с помощью центрифугирования (4,000-8,000 мкг) и снимите отбеливающий раствор. Примечание: общее время, что черви инкубируют с отбеливателем, не должна превышать 5 мин.
      5. Промыть эмбрионы 3x с забуференным трис физиологическим раствором (TBS, 50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl) и эмбрионов передачи с использованием пипетки Пастера стекло на поли-L-лизин покрытием предметное стекло микроскопа. Примечание: Для пальто стеклышко с поли-L-лизин, сначала протрите слайд, а затем добавить каплю (~ 20-30 мкл) поли-L-лизина и равномерно распределите по всей поверхности и дайте высохнуть. Для получения оптимальных результатов пальто слайдах еще два раза. Альтернативный метод для сбора эмбрионов (см. разделы 3.2.2.1-3.2.2.5) является поместить каплю M9 на поли-L-лизин покрытием предметное стекло и забрать ~ 10 беременных гермафродитов в каплю.
      6. Добавить покровное на верхней части каждой стекло микроскопа (в район, где расположено большинство эмбрионов) и местослайды в жидком азоте. Примечание: Для гермафродитов размещенных непосредственно в каплю, оказать давление на покровное взломать гермафродиты и изгнать эмбрионов.
      7. Freeze-трещина эмбрионов, щелкая от покровные сразу после их замораживания в жидком азоте.
      8. Поместите слайды в ледяной метанола в течение 20 мин, чтобы исправить эмбрионов. Примечание: Для некоторых антигенов, сшивающий фиксатор, такой как параформальдегид может быть предпочтительным. См. протокол из Дюрр ^22.
      9. Увлажняет и проницаемыми эмбрионов промыванием слайдов 4x с Трис-солевой буфер, содержащий твин-20 (TBST; 50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20) в течение 10 мин каждый.
      10. Высушите каждого слайда в районе, где расположено большинство эмбрионов и нарисуйте круг вокруг эмбрионов с использованием жидкого блокирующий ручку (например PAP пера).
      11. Добавить ~ 100 мкл TBST 5% нормальной осла сыворотки (NDS; блок) к каждому слайду (кружил область) и инкубировать20 мин при комнатной температуре. Примечание: Поместите слайды в «мокрой камеры '(например блюдо с крышкой, содержащей влажные бумажные полотенца).
      12. Удаление блока, добавьте ~ 50-100 мкл первичных антител (разбавленный в TBST), чтобы каждого слайда (обведено область) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Примечание: В зависимости от антитела, разбавление и времени инкубации может изменяться. Для обнаружения GFP, мы используем антимышиного анти-GFP первичного антитела в разведении 1/200. Для обнаружения ANI-1, мы используем против кроличьего анти-АОН-1 первичного антитела в разведении 1/1600 (любезно предоставленный Эми Шауб Мэддокс, UNC Chapel Hill). Для более длинных периодов инкубации поместите слайды при 4 ° С.
      13. Удалить первичных антител (если это возможно, сохранить для будущего использования) и мыть слайды 3x с TBS в течение 5 минут каждый.
      14. Удалить последнюю промывку и добавить ~ 50-100 мкл вторичных антител (разбавленный в TBST), чтобы каждого слайда (обведено область) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Примечание: В зависимости от антитела, разбавление может изменяться. Для обнаружения GFP, мы используем такое аNTI-мышь Alexa Fluor 488 вторичные антитела в разведении 1/250. Для обнаружения ANI-1, мы используем против кроличьего Alexa Fluor 568 вторичного антитела в разведении 1/250.
      15. Удалить вторичные антитела и мыть слайды 3x с TBS в течение 5 мин каждый. Примечание: для окрашивания ДНК, добавьте ~ 50-100 мкл DAPI (4 ',6-диамидино-2-фенилиндол, 1 мг / мл) при 1/500 разбавление в TBST в течение 5 мин.
      16. Удалить DAPI и мыть слайды 2x с TBS в течение 5 минут каждый. Примечание: Если окрашивание DAPI не выполняется, то пропустите этот дополнительный шаг стирки.
      17. Выполните одно быстрое мытье 0,1 М Трис (рН 9), удалить и добавить ~ 15 мкл крепежных средств массовой информации, предварительно нагретую до 37 ° C (4% н-пропил-3.4.5 trihydroxybenzoate (пропилгаллат), 50 мМ Трис, рН 9 в 50% глицерина) к каждому слайду (кружил область).
      18. Добавить покровное к каждому слайду (в верхней части монтажной СМИ в кружил области), фитиль от лишней жидкости и запечатать слайды с лаком для ногтей. Примечание: Слайды можно хранить при температуре -20 ° С.
      19. Соблюдайте эмбрионов наслайды, используя широким полем зрения флуоресцентного микроскопа или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Важно отметить, что настройки параметров для сбора образы оптимальной интенсивности пикселей с использованием контроля (N2 или не RNAi) эмбрионов. Тогда, собирать изображения с эмбрионами РНК-интерференции, используя те же настройки. Примеры изображений, собранных для управления против Ани-1 эмбрионы RNAi показаны на рисунке 2B.

4. Подготовка Слайды для живых изображений и уборки эмбрионов

1. Подготовка агарозном колодки для живого изображения
   1. Место чистое, предварительно подогретое предметное стекло между двумя другими горками, каждый с 1-2 полосами ленты на них.
   2. Использование стекло пипетки Пастера, добавить одну каплю 2% вес / объем агарозы (с подогревом, растворенного в дистиллированной воде) до слайда.
   3. Быстро разместить второй, чистое предметное стекло поверх первого слайда в перпендикулярном образом, чтобы сгладить агарозном капли. Примечание: ленты на соседних скользнулES обеспечивает толщину для прокладки.
   4. Пусть агарозном сухой прокладки для 1-2 мин, прежде чем снимать верхнюю слайд. Сдвиньте верхнюю слайд тщательно, чтобы избежать нарушения агарозы площадку внизу. Примечание: Иногда колодки передается на верхнем слайде и может быть использован, пока оно остается неизменным.
   5. Передача эмбрионов на агарозном площадку в течение нескольких минут после его приготовления, как описано ниже (см. шаг 4.2). Примечание: площадка должна иметь непрозрачный внешний вид; сразу понятно, что это слишком сухой, чтобы использовать.
2. Эмбрионы Сбор
   1. Используйте следующую протокол для сбора эмбрионов для живого изображения, который является производным от Салстон др. ^24.
   2. Возьмите приблизительно 4-6 беременных взрослых (не голодали) из NGM или РНК-интерференции пластин и поместите их в 20-30 мкл M9 буфера в хорошо на депрессии слайда.
   3. С помощью стерилизованного скальпель, чтобы сократить червей на обе стороны от сперматекой (или, альтернативно около вульвы) ввыпустить эмбрионы в раствор.
   4. Используйте резиновый шланг с мундштуком, подключенного к стеклянной капиллярной / пипетки вытащил иметь небольшой отверстие и всасывания эмбрионов в рот пипеткой. Кроме того, собирать эмбрионов с капиллярной стеклянной трубке, которая крепится к пипетки Пастера резиновой груши.
   5. Перенесите всасывается эмбрионов на второй, содержащей также M9 буфера, чтобы помочь отделить их от червя мусора.
   6. Затем всасывания эмбрионы на свежеприготовленного агарозном площадку (см. шаг 4.1).
   7. Эмбрионы слипаются, использующие глазом (приклеены к киркой зуба), чтобы увеличить количество эмбрионов, которые могут быть сняты в одном плоскости х, у. Примечание: Во избежание кислородное голодание, не слипаются более 10 эмбрионов вместе.
   8. Затем покрыть слайд с покровным и частично запечатать его с предварительно нагретая жидкость VALAP (вазелин, ланолин и парафин; плавится и в сочетании 1:01:01), чтобы предотвратить обезвоживание эмбрионов во время съемки. Примечание: Дополнительная M9 буфера окн быть добавлены к панели, чтобы гарантировать, что эмбрионы имеют достаточную жидкость для обработки изображений. На месте VALAP, вазелин может использоваться для частичного уплотнения покровные, но это менее жестким в результате чего покровные скользить и могли бы получить на микрообъективов.

5. Живая съемка

1. Для визуализации нейробласты, получить червя нагрузку, которая выражает нейробластов конкретных белок, прикрепленный к флуоресцентного белка (например HAM-1: GFP, штамм ID в CGC OP102). Для обнаружения клеточных мембран, использовать червя штамм, который также выражает домен белка, который признает липиды, подключенный к другой флуоресцентного белка (например mCherry:. PH, штамм ID в CGC OD70).
2. Эмбрионы Добывается из люминесцентных гермафродитов продолжал управления или Ани-1 РНК-интерференции пластин (см. Протоколы 3 и 4), а также подготовить слайды, как описано выше (см. Протокол 4).
3. Эмбрионы изображения в 4D (х, у, г и покадровой) по эпифлуоресцентной микроскопии. Используйте либо WiСистема defield [автоматизированная флуоресцентный микроскоп с фильтрами для GFP и TexasRed, задач до 60X или 100X, с высоким разрешением ПЗС (прибор с зарядовой связью) камеры, высоко моторизованных этап (например,. Piezo Z) и специализированное программное обеспечение приобретения] или LiveScan прокатилась поле конфокальной микроскопии [автоматизированная флуоресцентного сканирующего микроскопа с 488 нм и 561 нм лазеров, целей до 100x, в EMCCD (электрон умножения CCD) камеры, высоко моторизованных этап (например, пьезо Z) и специализированное программное обеспечение приобретения]. Примечание: Для системы Widefield, с использованием светодиодов и EMCCD камеру ограничит фототоксичность. Кроме того, вращающийся диск конфокальной микроскопии может быть использован вместо стреловидного полевой системы.
4. Для разделения изображений нейробласта клеток по обе системы, найти X, Y рамы эмбрионов с использованием целей 10X или 20X, и выбрать оптимальный X, Y кадр, где эмбрионы переживает спинной интеркаляцию (этап перед брюшной Enclosure; Рисунок 1A) или являются на ранних стадияхвентральной корпуса (~ 350 мин после первого деления клеток; рис. 1А).
5. На охватила поле микроскопа, используя 488 нм и 561 нм 100 мВт лазеры на 40% мощности со щелью 50. О системе Widefield, использовать фильтры GFP и TexasRed с интенсивностью низкой среды света (если управляемый). Примечание: Для системы Widefield, светодиоды имеют низкую фототоксичность и являются предпочтительными.
6. По обе системы используйте целей масло погружения 60X или 100X и собрать 20 Z-стеки 0,2 мкм каждые 2 мин в общей сложности 10 минут. Примечание: Несмотря на то, НАМ-1: GFP и mCherry: PH зонды выразить на относительно высоком уровне, время экспозиции для каждого зонда должны быть оптимизированы для различных микроскопов. Примечание: Для системы Widefield, меньше Z-стеки рекомендуется ограничивать фототоксичность и для работы с изображениями в течение длительных периодов времени, использовать меньше времени.
7. Чтобы свести к минимуму фототоксичность вызванного воздействием эмбрионов ультрафиолетового света в системе Widefield (при использовании наемниковУри лампа), закройте диафрагму до 30% и уменьшить интенсивность света (с помощью регулируемого систему освещения). Примечание: Хотя усиления не требуется, используя либо систему, другие микроскопы могут иметь источники света с более низкой интенсивности или целей с различными численными отверстий, которые могут потребовать использования прибыли для получения изображения оптимального интенсивности пикселей. Проверьте условия с помощью управляющего эмбрион обеспечить, чтобы любые наблюдаемые фенотипы не связаны с артефактом фототоксичности.

6. Анализ микроскопии данных

1. Для анализа изображений, экспорта файлов как TIFFs и открыть ссоры как стек с помощью специализированного программного обеспечения, такие как на основе Java программы для обработки изображений (например ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Примечание: В зависимости от программного обеспечения сбора, используемой для сбора изображений, файлы могут быть сохранены в первоначальном виде и открыт в ImageJ. Это предпочтительнее, так как метаданные сохраняются вместе с файлами.
2. Отделите стекв «образов» и точек Выберите время и Z-плоскостей по желанию. Примечание: Хотя стопка 20 Z-плоскостей берется, многие из нейробластов являются <1 мкм в течение середины позднего эмбриогенеза и только несколько Z-плоскостей необходимы.
3. Сложите в пачку выбранные Z самолеты для каждого момента времени и делать отдельные прогнозы Z-Stack. Затем укладывают прогнозы на каждый момент времени вместе, чтобы сделать временную последовательность.
4. Внесите изменения в яркости / и или контраста для каждого канала.
5. Затем выберите интересующую область, урожая (и вращать при необходимости) в регионе.
6. Создание объединенных изображений с помощью функции "объединены Каналы 'и выберите другой цвет для каждого канала. Преобразование объединенные изображения в RGB.
7. Обратить изображений в градациях серого для каждого канала от шагов 6,3 или 6,4 (используйте 'Инверсия' функциональных под "Изменить") для визуализации изображения более четко.
8. Сохраните все окончательные изображения в 8-битных TIFFs сделать цифры в векторном основе программное обеявляются программы или как Quicktime файлы снимать фильмы.
9. Если измерения размера пикселя необходимы (например, включить масштабную линейку с изображениями), используйте ImageJ, или другое программное обеспечение для обработки изображений, чтобы измерить размер эмбриона. Примечание: Изображения, собранные с использованием различных целей будут иметь различные размеры в пикселях.

Результаты

Это экспериментальный протокол описывает, как разделения изображения клеток в С. Элеганс эмбрионов во время середине эмбриогенеза. В частности, он описывает, как изображения нейробластов, которые могут способствовать эпидермальный морфогенез. Эпидермального морфогенез происходит за счет комбинации изменения формы клеток эпидермиса, миграции и адгезии, но и опирается на химических или механических сигналов от основных нейробластах (рис. 1В). Нейробласты выделяют сигналы наведения, которые приним...

Обсуждение

Этот протокол описывает использование различных видов микроскопии в изображение клеточных делений в течение середине эмбриогенеза. В частности, этот протокол подчеркивает, как изображение разделение нейробластах, клетки, которые могут способствовать эпидермальный морфогенез. Межклеточных коммуникация важна для формирования тканей в процессе развития многоклеточных и С. Элеганс превосходная модель для изучения формирования тканей в естественных условиях. Один случай, который хорошо изображает взаимодейс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агар	БиоШоп Канада Инк.	#AGR001.1	Для изготовления пластин C. elegans NGM и RNAi plates
Agar	Bio Basic Inc.	#9002-18-0	Для изготовления бактерий LB агаровые пластины
Agarose	BioShop Canada Inc.	#AGA001.500
Антитело против мышей Alexa Fluor 488	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11029
Антитело против мышей против GFP	Roche Applied Science	#11814460001
Антитело против кролика Alexa Fluor 568	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11011
Ampicillin	BioShop Canada Inc.	#AMP201.5	Хранить порошок при температуре 4° С и растворенный ампициллин при -20°С; C
Bactopetone  (пептон-А)	Био Бейсик Инк.
CaCl2 (хлорид кальция)	BioShop Canada Inc.	#C302.1
Cholesterol	BioShop Canada Inc.	#CHL380.25	Растворить в этаноле
DAPI	Sigma-Aldrich	#D9542	Использование для окрашивания нуклеиновых кислот (ДНК)
Glycerol	BioShop Canada Inc.	#GLY001.1
IPTG (изопропилтио-&бета;-галактозид)	Bio Basic Inc.	#367-93-1	Хранить порошок и растворенный ИПТГ при -20° C
KH2PO4 (фосфат калия, моноосновный)	BioShop Canada Inc.	#PPM666.1
K2HPO4 (фосфат калия, двухосновный)	BioShop Canada Inc.	#PPD303.1
L4440  (вектор подачи)	Addgene	#1654	Хранить в виде запасов глицерина при -80 °°; C
MgSO4    (сульфат магния)	BioShop Canada Inc.	#MAG511.500
NaCl (хлорид натрия)	Bio Basic Inc.
Na2HPO4 (фосфат натрия, двухосновный)	Bio Basic Inc.	#7558-79-4
Сыворотка нормального осла (NDS)	Wisent Bioproducts	#035-110
n-Пропил-3,4,5-тригидроксибензоат (пропилгаллат)	Альфа Аэзар	#A10877
Поли-L-лизин	Сигма-Олдрич	#P8920	Для достижения оптимальных результатов покрытие микроскопа слайдами три раза
Стрептомицин	BioShop Canada Inc.	#STP101.50	Хранить порошок при 4°°С; С и растворенный стрептомицин при -20°С;
C Тетрациклин BioShop	Canada Inc.	#TET701.10	Хранить порошок при 4°С; С и растворенный тетрациклин при -20°С; C
Tween-20	Bio Basic Inc.	CAS#9005-64-5
Триптон	БиоШоп Канада Инк.	#TRP402.500
Дрожжевой экстракт	Bio Basic Inc.	#8013-01-2