Оценивая развитие мышей плазмацитоидных дендритных клеток в пейеровых бляшках Использование приемных передачи гемопоэтических прародителей

Краткое содержание

Этот протокол описывает экспериментальные процедуры для оценки дифференциации плазмацитоидных дендритных клеток в патче Пейера от общих дендритных клеток-предшественников, с использованием методов, связанных с СУИМ-опосредованного выделения клеток, передача гидродинамической гена, и анализ потока иммунных множеств в патче Пейера.

Аннотация

Этот протокол детали метод для анализа способность очищенных гемопоэтических клеток-предшественников для создания плазмацитоидных дендритных клеток (PDC) в патче кишечного Пейера (PP). Общие предшественники дендритных клеток (CDPS, Lin ^- с-Kit ^ло CD115 ^{+ +} Flt3) очищали из костного мозга мышей C57BL6 по FACS и переносили в мышей-реципиентов, которые не имеют значительное население PDC в ПП, в этом случае, IFNAR ^{- / -} мыши были использованы в качестве получателей переводов. В некоторых мышей, избыточная экспрессия дендритных фактора роста клеток Flt3 лиганда (FLT3L) было приведено в исполнение до приемным передачу ОГТ, используя гидродинамический перенос генов (ХАГАТ) из Flt3L-кодирования плазмиды. Flt3L избыточная экспрессия расширяет населения DC, происходящих из переданных (или эндогенных) кроветворных клеток-предшественников. На 7-10 день после передачи предшественников, PDCS, которые возникают от адаптивно переданных предшественников отличались от клеток-реципиентов наОсновой CD45 маркера выражения, с PDCS от переданные CDPs быть CD45.1 ⁺ и получатели быть CD45.2 ^+. Способность переданных ОГТ внести свой вклад в популяции PDC в ПП и реагировать на FLT3L оценивали с помощью проточной цитометрии ПП одноклеточных суспензий из мышей-реципиентов. Этот метод может быть использован для тестирования, могут ли другие группы населения предшественники способны генерировать PP PDCS. Кроме того, этот подход может быть использован для изучения роли факторов, которые, по прогнозам, влияют PDC развитие в ПП, путем перечисления подмножества предшественников с соответствующим бросовой, нокаутом или избыточной экспрессии предполагаемого фактора развития и / или путем манипулирования циркулирующих цитокинов через тушки . Этот метод также может позволить анализ того, как PP PDCS влияет на частоту или функцию других иммунных подмножеств в ПЗ. Уникальной особенностью этого метода является использование IFNAR ^{- / -} мышей, которые показывают сильно истощены ПП PDCS относительно дикого типа животных, таким образом, allowiнг восстановление ПП PDCS при отсутствии мешающих эффектов от летального облучения.

Введение

Здесь мы демонстрируем протокол оценить, насколько общие дендритных клеток предшественники (ОГТ) способны порождать в плазмацитоидных дендритных клеток (PDC) населения в патче Пейера (PP). Общая цель использования этого метода в том, чтобы оценить регулирование процесса развития как PDCS в патче Пейера (ПП PDCS). Причиной этого является важным является то, ПП PDCS отличаться от PDCS найденных в других тканях, в том числе костного мозга, крови и селезенки, и поэтому неясно, являются ли умственно и / или функционально связаны PP PDCS и других групп населения PDC. В частности, PDCS широко известен как основной тип интерферона (IFN) производители в кроветворной системы, отвечая на Toll-подобный рецептор 7 и 9 (TLR7 / 9) стимуляции быстрого IFN секреции ^1-3. Тем не менее, PP PDCS испытывают дефицит в производстве IFN типа I в ответ на TLR агонистом стимуляции ^4,5. Кроме того, ПП PDCS также отличаются от PDCS найденных в костном мозге и селезенке втребуя сигналы от типа интерферона (IFN) рецептор (IFNAR1) или ИФН сигнализации STAT1 молекулы для их развития и / или накопления ^5. Эти данные предполагают, возможность того, что различные механизмы регулирования управления PP PDCS против PDCS в других органах (например, костного мозга, селезенки) ^5.

Обоснование, что привело к развитию этого метода был основан на последних достижениях в понимании дендритных клеток (ДК) биологии. Большинство, если не все, подмножества DC вытекают из гемопоэтических клеток-предшественников, которые экспрессируют FMS-подобной тирозинкиназы рецептора 3 (Flt3) ^6-10, однако разработка DC не ограничивается классической миелоидных и лимфоидных путей. Например, Flt3 ⁺ идеальные миелоидного предшественники (CMPS, линь ^- Ил-7R ^- SCA-1 ^- с-Kit ⁺ CD34 ⁺ FcγR ^{вот / -)} порождают ОГТ (Lin ^- с-комплект ^вот CD115 ⁺ Flt3 ^·), whicч дальнейшей дифференциации в ЦПК и обычных РС (CDCs) ^9,10. Напротив, Flt3 ⁺ идеальные предшественники лимфоидных клеток (CLPS, Лин ^- Ил-7R ⁺ SCA-1 ^вот с-комплект ^LO) разработать в первую очередь в PDCS ^11. Таким образом, предыдущие исследования показали, PDCS возникают, по крайней мере 2 различных гемопоэтических населения предшественников под регулирование FLT3L, хотя типичный анализ был ограничен костного мозга, селезенки и / или PDC крови подмножеств. Таким образом, население (ы) прародитель, который генерирует PP PDCS требуется расследование. Понимание происхождения PP PDCS прольет свет на, разделяют ли они общие пути развития с другими популяциями PDC, или используют разные механизмы во время их генерации в ПП.

Уникальное преимущество подхода, описанного здесь является использование мышей, которые показывают тяжелую недостаточность PP PDCS как получателям на приемных передачи гемопоэтических клеток-предшественников. Мыши с геномкрестики удаление в гене, кодирующем IFNAR1 (IFNAR ^{- / -} мыши) или STAT1 (Stat1 ^{- / -)} показало поразительное истощение в ПП PDCS ^5. Таким образом, эти штаммы обеспечить среду, в которой PP PDCS сокращаются, позволяя приемные исследования передачи должны быть выполнены в отсутствие мощных режимов клеток абляции, таких как летального облучения. Дополнительным Сила метода, изложенного здесь является использование гидродинамического переноса генов (ХАГАТ), чтобы стимулировать повышенный циркулирующие количество FLT3L. Это обеспечивает экономически эффективный подход, чтобы вызвать FLT3L в естественных условиях, по сравнению с инъекцией рекомбинантного белка. Результаты многочисленных исследований, в том числе в нашей лаборатории, использовали ХАГАТ, чтобы вызвать цитокинов суммы в различных экспериментальных условиях ^5,12,13.

Разделение труда и точных иммунных функций для РС представляет большой интерес в области иммунологии. В частности, PDCS являются важными медиаторами оральной толерантности и системная противовируснаяответы, но они также, кажется, свой ​​вклад в развитие и настойчивости аутоиммунных и рака ^14-17. Протокол, описанный здесь позволит механизмы развития, регулирующие PP PDCS быть более полностью изучены. Кроме того, такой подход может позволить исследования для оценки функции ПП PDC, и может быть продлен до понимания регулирование и функции других иммунных популяций в пределах ПЗ.

Протокол

Институциональная утверждение должно быть получено заранее для всех экспериментальных манипуляций, описанных здесь, с участием мышей. Они включают использование мышей C57BL6 для выделения клеток-предшественников костного мозга, IFNAR ^{- / -} мышей в качестве реципиентов для приемных передачи гемопоэтических клеток-предшественников и использования тушки для сверхэкспрессии цитокинов в естественных условиях. Надлежащее жилье и уход за животными также должна быть предоставлена ​​следователем или учреждения. Кроме того, институциональная утверждение может потребоваться для плазмид, используемые при передаче гидродинамического гена (т.е. рекомбинантный утверждения ДНК). Исследования, описанные здесь были утверждены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в UT MD Anderson Cancer Center по.

1. Гидродинамическая Перенос генов (тушка)

Этот шаг должен быть выполнен за 2 дня до приемной передачи ОГТ, чтобы вызвать циркуляцию FLT3L для расширения постоянного тока в естественных условиях ^5. Prepare по крайней мере, 5 получатель мышей / группа.

1. Для достижения эффективного ХАГАТ, кровеносные сосуды получателя IFNAR ^{- / -} мышей (CD45.2 ⁺⁾ должны расширяться, подвергая мышей нагревательного лампы в течение 5-10 мин.
2. Место мыши в Restrainer устройства и дезинфицировать свой хвост с 70% этанола.
3. Введите 5 мкг плазмиды, кодирующей FLT3L в 2 мл стерильной PBS в хвостовую вену с использованием 27 G иглу. В контрольной группе, вводят 5 мкг пустым вектором (pORF) через хвостовую вену, как указано.
4. Монитор мышей в течение 15-30 мин, чтобы обеспечить нет вредные эффекты инъекции в хвостовую вену. Вернуться мышей объекта жилья в течение 2 дней.

2. Выделение гематопоэтических предшественников из костного мозга мыши

Этот шаг должен быть выполнен через 2 дня после тушки. Использование конгенных CD45.1 ⁺ мышей в качестве источника предшественников костного мозга для приемных передачи в получателе IFNAR ^{- /}- животные (CD45.2 ^+). В этом протоколе конгенные штаммы должны различать донора и реципиента, полученных ДК, а также чтобы избежать истощение иммунной опосредованного из-за несоответствия МНС. Приблизительно 10-20 мышей будут обязаны предоставлять достаточное количество гемопоэтических клеток-предшественников (10 ⁵ клеток / мышь получатель) для экспериментов по передаче.

1. Усыпить 10 конгенных CD45.1 ⁺ мышей по CO ₂ удушья и смещения шейных позвонков.
2. Поместите каждый тушу на рассечение лоток и стерилизовать живот и ноги с 70% этанола.
3. Сделайте надрез на середине живота и прорезать кожу от живота к каждой ноге, резки кожу по всей длине ноги.
4. Аккуратно снимите кожу от каждой ноге, и вырезать и удалить ножки от туши на тазобедренном суставе, используя острые ножницы.
5. Осторожно снимите мышцы от бедра и голени каждой ноги, используя острое лезвие.
6. Удалятьоба конца бедра и голени с острым скальпелем и поместить кости в культуральную чашку, содержащую полную RPMI (RMPI с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкМ β-меркаптоэтанола) .
7. Подготовьте шприц, содержащий 1 мл полной RPMI, подключенных к 27 G иглы.
8. Вставьте иглу 27 G в один конец бедренной кости или кости. Промойте костный мозг из бедренной кости или кости, осторожно вводя полный RPMI в кость. Убедитесь, что клетки костного мозга удаляются от кости; это может быть достигнуто путем визуального определения исключен СМИ, что появляется снег.
9. Повторите промывки каждый бедра и голени 3 раза, чтобы полностью удалить клетки костного мозга.
10. Подготовка суспензии отдельных клеток, осторожно пипеткой клетки вверх и вниз 3-5x в культуральной чашке.
11. Удалите мусор пропусканием клетки костного мозга через 40 мкм ячейки фильтра, размещение излучал клеток в новый культурное блюдо. Разрушить все сотовые комки, которые появляются на сито, осторожно давления с концом стерильного поршень шприца.
12. Lyse эритроциты (RBC), присутствующие в общей клеточной суспензии костного мозга с коммерческой РБК буфера для лизиса в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте 2 мл РБК лизис buffer/4-6 х 10 ⁷ клеток (обычно клеток из одной мыши) и времени инкубации 5 мин при комнатной температуре.
13. Промывают клетки костного мозга с помощью гранулирования клеток путем центрифугирования в течение 4 мин при 500 х г, осторожно аспирации культуральной среды, ресуспендирования в 10 мл FACS буфера (PBS 1x + 2 мМ ЭДТА + 1% FBS), гранулирования клетки центрифугированием и осторожно мыть аспирационных буфера.
14. Повторите мыть, как описано в шаге 2.13, в общей сложности 2 стирок.

3. Флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) изолировать CDPs

Этот шаг необходим доступ к сепаратора MidiMACS и столбцов MACS LD на первоначальный отрицательный процедуры отбора,а также машина FACS с по крайней мере 3 лазеров, чтобы очистить многоцветный подмножество предшественников после окрашивания флуоресцентно конъюгированных антител.

1. После второй промывки в шаге 2.14, подсчет клеток костного мозга. Гранул клетки центрифугированием, как описано в шаге 2,13 и ресуспендируют в буфере FACS для достижения конечной концентрации 4 × 10 ⁷ клеток на 30 мкл FACS буфера.
2. Для подготовки клеток для FACS, Lineage-отрицательных клетки сначала обогащается отрицательного техники отбора, который удаляет Lineage-позитивных клеток из смеси костного мозга с помощью магнитного шарика колоночной хроматографии. Для отрицательного процедуры отбора, добавить 1 мкг каждого из следующих коммерческих крысы антител мыши (ABS), которые распознают гемопоэтические маркеры клональные: CD3, CD19, CD11c, CD11b, и Тер-119 Абс. АБС должна быть добавлена ​​в объеме 2 мкл / AB к суспензии 30 мкл клеток в FACS буфере.
3. Инкубируйте клеточной суспензии при 4 ° С в течение 30минимум После инкубации промыть клетки дважды с 10 мл FACS буфера, как описано в шаге 2,13.
4. Ресуспендируют клеток для достижения конечной концентрации 4 х 10 ⁷ cells/40 мкл FACS буфера. Добавить 20 мкл козьих против крысиного IgG магнитных микросфер на каждые 40 мкл клеточной суспензии. Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Промыть клетки с 10 мл FACS буфера, как описано в шаге 2,13.
5. Ресуспендируют до 10 клеток костного мозга ⁸ в 500 мкл FACS буфера.
6. Загрузите столбец MACS LD на сепаратора клеток MidiMACS в соответствии с инструкциями изготовителя и prerinse колонку 2 мл FACS буфера.
7. Применить подвеску клеток костного мозга в колонну, загрузка до 5 х 10 ⁸ клеток в 2,5 мл FACS буфера. Обеспечить сбор трубку (15 мл коническую трубку) помещается в столбце. Промыть колонку с 3-кратным 2 мл FACS буфера / стирки, и сбора клеток, которые проходят через колонку, которая будет обогащенаLineage-отрицательный клетки. Граф клеток в материале элюированные (мыть через) из столбца.
8. Для выполнения положительный выбор гемопоэтических подмножеств предшественников по СУИМ, пятно клетки со следующим флуоресцентной сопряженного ABS: Ил-7R (Pacific Blue), Flt3 (ПЭ), SCA-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), с-комплект (APC.Cy7) Абс, плюс смесь клона маркерных Абс, направленных против CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 и Ter119 (все помечены PerCP Cy5.5). Использование 0,5-1 мкл каждого Ab в общем объеме 100 мкл. Инкубируйте клеточной суспензии при 4 ° С в течение 20-30 мин.
9. Промыть клеток, как указано в шаге 2,13 и ресуспендируют в FACS буфере при концентрации 2-3 х 10 ⁷ клеток / мл. Фильтр клетки через 35 мкМ клеток Пробка фильтра трубки для удаления клеток комки. Этот последний шаг имеет решающее значение, чтобы избежать засорения машину FACS.
10. Поместите клеточной суспензии в FACS трубы на сцене FACS и сортировать ОГТ (Lin ^- с-комплект ^вот CD115 ⁺ Flt3 ⁺⁾ наОсновой указанным профилем маркера. Сбор очищенные клетки в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл полной среды RPMI.
11. Запись абсолютное число отсортированных клеток в конце прогона FACS. Гранул клеток путем центрифугирования, как указано в пункте 2.13 и ресуспендируют в стерильной PBS для приемных экспериментов по передаче.

4. Приемные передача ОГТ

Этот шаг, как правило, делается в виварии, где мышей-реципиентов размещаются. В зависимости от расположения машины FACS, оно может включать транспортировку очищенных популяций клеток-предшественников в виварии до приемных передачи. Клеток-предшественников суспензии должны быть стерильными и транспортируется на льду.

1. Подготовка клеточных суспензий для инъекций путем разбавления 10 ⁵ очищенные CDPS в общем объеме 100 мкл стерильной PBS. Поместите клеточной суспензии в шприц, прикрепленной к 27 G иглу.
2. Expose получателя IFNAR ^{- / -} мышей (CD45.2 ⁺⁾ к нагревательной лампой в течение 5-10 мин для достижения эффективного инъекции через хвостовую вену.
3. Место мыши в Restrainer устройства и дезинфицировать свой хвост с 70% этанола.
4. Введите 10 ⁵ FACS-очищенные ОГТ в 100 мкл PBS в хвостовую вену с использованием 27 г иглы.
5. Монитор мышей в течение 15-30 мин, чтобы обеспечить нет вредные эффекты инъекции в хвостовую вену. Вернуться мышей объекта жилья.

5. Выделение ПП и измерению PDC Суммы

1. На 7-10 день следующих приемных передачи, усыпить мышей-реципиентов. Аккуратно откройте мышь путем рассечения и выставить в кишечник.
2. Удалить весь кишечник и поместите его на PBS-пропитанных бумажных полотенец. Соберите все видимые PPs вдоль стенки тонкой кишки с помощью тонких щипцов и ножниц. C57BL6 и IFNAR ^{- / -} мышей, как правило, имеют 5-10 PP / мышь, которая отличается от изолированных лимфоидных фолликулов найденныхвдоль тонкой кишки ^18. Обратите внимание, что УП часто структурно отличаются даже в пределах одного мыши, так тщательно убедиться, что все ПП были выявлены и расчленены.
3. Наведите PPs в чашке Петри, содержащей PBS, и использовать щипцы для удаления фекалий. Повторите эту процедуру дважды, чтобы очистить PPs.
4. Дайджест ПП с 1 мг / мл коллагеназы IV в 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса 1x (HBSS) в колбу на 50 мл при энергичном перемешивании в течение 1 часа при 37 ° С.
5. Поместите усваивается PP в верхнем отсеке ячейки сетчатого фильтра и силовых ячеек 40 мкм через сито со стерильным поршень шприца. Сбор клеточной суспензии PP в 15 мл коническую трубку.
6. Гранул напряженные PP клетки центрифугированием при 500 х г в течение 5 мин и ресуспендируют в 6 мл 37%-ного раствора Перколла (37% Percoll в RPMI среде). Аккуратно 6 мл 70%-ного раствора Перколла (70% Percoll в RPMI среде) под клеточной суспензии, чтобы сформировать Перколла ступенчатый градиент.
7. Центрифуга клетки в течение 20 мин аT 800 XG с центрифуга разорвать. Мононуклеарные клетки будут мигрировать к 37/70% интерфейса. После центрифугирования мононуклеарных клеток население должны быть собраны путем тщательного пипетки в области интерфейса. Гранулы собирают клетки центрифугированием и дважды мыть в 50 мл полной среды RPMI / стирки. Большой объем используется для обеспечения полного удаления Перколла.
8. Пятно собранные клетки PP со следующими антител для обнаружения мышиных PDCS, производные от адаптивно переданных предшественников (CD45.1 ⁺⁾ или мышей-реципиентов (CD45.2 ^+): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-Н (ПЭ) и PDCA-1 (FITC) Абс. Выполните проточной цитометрии анализа клеток ПП, как указано в пунктах 3.9 и 3.10. Определить PDCS их CD11c ⁺ CD11b ^- В220 ⁺ Siglec-H ⁺ PDCA-1 ⁺ фенотип. Абсолютные PDC может быть определена по следующей формуле:% PDCS х доТаль ПП количество клеток = ПП PDCS.

Результаты

Наши результаты показывают, стратегию стробирования для изоляции ОГТ от мыши клеток костного мозга (рис. 1), как описано в Протоколах 2 и 3. CDPs составляют около 0,1% от общего количества клеток костного мозга, и примерно 4-6 × 10 ⁴ CDPs могут быть выделены из одной мыши. По приемных передачи, CDPs дифференцироваться в ЦПК и CDCs ^10.

Обсуждение

Техника адоптивный перенос описано здесь оценил вклад ОГТ для населения ПП PDC в мышей-реципиентов, которые дефицитны по ПП PDCS (например IFNAR ^{- / -} мышей). В будущих экспериментах, это будет важно оценить потенциал других подмножеств предшественников в создании ПП PDCS, в частности ли вывести PP PDCS от Flt3 ⁺ CLPS. Этот вопрос имеет большое значение, так как остается непонятным, почему PP PDCS однозначно чувствительны к IFNAR-Stat1 сигналов для ПП начисления ^5, и если ПП PDC...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6J	JAX	664
B6. SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
15 мл Конические пробирки	BD Biosciences	352095
50 мл Конические пробирки	BD Biosciences	352070
Стерильные хирургические пинцеты
Стерильные ножницы
Стерильные ножницы большой пары
40 μ m клеточный фильтр	BD Biosciences	352340
35 μ m пробирки с крышкой фильтра	BD Biosciences	352235
лизирующий буфер RBC	Sigma	R7757
FACS буфер			PBS, 2 мМ ЭДТА, 1% FCS, фильтр стерилизованный
Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Козий антикрысиный IgG микрошарики	Milteyni Biotec	130-048-501
LD колонка	Milteyni Biotec	130-042-901
Крыса анти-D3	BD Biosciences	555273
крыса анти-CD19	BD Biosciences	553783
крыса анти-CD11b	BD Biosciences	553308
крыса анти-CD11c	BD Biosciences
Крыса анти-Ter119	BD Biosciences	553671
Anti-CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
Anti-CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
Anti-CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
Anti-CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
Anti-F4/80 ( PerCP)	eBiosciences	45-4801
Anti-Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
Anti-Sca-1 (PE. Cy7)	eBiosciences	25-5981
Anti-CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
Anti-c-kit (APC. Cy7)	eBiosciences	47-1171
Anti-IL-7R (Pacific Blue)	eBiosciences	48-1271
Anti-Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
Anti-CD45.1 (APC. Cy7)	BD Biosciences	560579
Anti-CD45.2 (PE. Cy7)	Biolegend	109830
Anti-CD11c (Pacific Blue)	eBiosciences	48-0114
Anti-B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
Anti-Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
Сортировщик клеток	BD Biosciences		например, BD Fortessa
Heat lamp
Удерживатель
1 мл Шприцы	Becton Dickinson	309602
27½ Иглы G (стерильные)	Becton Dickinson	305109