Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии

Summary

Конфокальной микроскопии Покадровый является мощным средством полезно для характеристики эмбрионального развития. Здесь мы описываем методологию и охарактеризовать черепно-лицевой морфогенез в дикого типа, а также PDGFRA, smad5 и SMO мутантные эмбрионы.

Abstract

Покадровой обработки изображений является метод, который позволяет для прямого наблюдения процесса формообразования, или генерация формы. Благодаря своей оптической прозрачности и аменабельности к генетической манипуляции, данио эмбрионов стал популярным модельным организмом, с которой для выполнения покадровой анализ формообразования в живых эмбрионов. Конфокальной визуализации живого данио эмбриона требует, чтобы ткань интерес упорно метили флуоресцентным маркером, таким как трансгена или вводили краситель. Процесс требует, чтобы эмбрион находится под наркозом и удерживается на месте таким образом, что здоровое развитие протекает нормально. Параметры для визуализации необходимо установить для учета для трехмерного роста и сбалансировать требования решении отдельных клеток при получении быстрые снимки развития. Наши результаты демонстрируют способность выполнять долгосрочный в естественных изображений флуоресцентных меченных эмбрионов данио и обнаруживать различные поведения тканей вчерепная нервного гребня, которые вызывают черепно-лицевые аномалии. Развивающие задержки, вызванные анестезией и монтажа минимальны, и эмбрионы невредимым процессом. Покадровый отображаемого эмбрионы могут быть возвращены в жидкой среде, а затем отображены или фиксированной на более поздних точек в развитии. С увеличением обилия трансгенных данио линий и хорошо характеризуется отображением судьбы и методов трансплантации, визуализации любого желаемого ткани можно. Таким образом, покадровой в естественных изображений сочетает мощно с данио генетических методов, в том числе анализа мутантных и микроинъекции эмбрионы.

Introduction

Черепно-лицевой морфогенез является сложным многоэтапным процессом, который требует скоординированных взаимодействий между несколькими типами клеток. Большинство черепно-скелета происходит от клеток нервного гребня, многие из которых должен мигрировать из дорсальной части нервной трубки в переходных структурах, называемых глоточных арки ^1. Как и во многих тканях, морфогенез черепно-лицевой скелет является более сложным, чем можно понять, статических изображений эмбрионов в конкретных развития времени. Хотя это занимает много времени для выполнения, в естественных условиях покадровой микроскопии обеспечивает непрерывный взгляд на клетки развивающег....

Protocol

1. Животноводство и мутантных аллелей

1. Поднимите и породы данио, как описано ^21.
2. Данио рерио мутантные аллели, используемые в этом исследовании, были PDGFRA ^{b1059 16,} smad5 ^{B1100 22,} и SMO ^{B577 23.} Источники для этих рыбок данио штаммов включают Zirc.

2. Приготовление растворов и реализует

Примечание: Все решения и реализует можно сделать заранее и хранить для будущего использования.

1. Сделать эмбриона СМИ (EM), как описано выше ^21.
2. Сделать 4 г / л MS-222 (Tricaine). Растворите 4 г динатрийфосфат (Na ₂

Results

В эмбрионов дикого типа, после нервной населения гребня, глоточные арки удлиненные вдоль передней / задней и спинной / вентральной осей при движении в ростральном направлении (Movie 1). В 30 часов после оплодотворения (ФВЧ), длина передней / задней первого глотки арки между 1,8-1,9 раза по сравнению спинной / вентральной высоте. Спинной / вентральной удлинение протекает стабильно, быстрее, чем расширение передней / задней до 36,5 после оплодотворения. Отсюда, спинные / брюшные плато высотой около 104 мк.......

Discussion

Покадровый конфокальной микроскопии является мощным инструментом для анализа развития. Здесь мы демонстрируем полезность метода в изучении глотки арки морфогенез у рыбок данио, которые мутант для важных сигнальных использованием трансгенных что помечает клетки нервного гребня. В дополнение к ткани уровне анализов, анализов промежутка времени, также применимы к анализу на клеточном уровне ^28. Многие широко используемые методы данио также могут быть включены в покадровой микроскопии экспериментов, в том числе м.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Тестовая монофиламентная леска	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Аргоновый лазер	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Хлорид кальция	Sigma-Aldrich	C8106
Капиллярная трубка, 100 мм, 0,9 мм ID	FHC	30-31-0
Гвоздичное масло	Hilltech Канада, Инк.	HB-102
Смазка для высокого вакуума	Dow Corning	2021846-0807
Инкубатор для сухой ванны Isotemp	Fisher Scientific	2050FS
Лазерный сканирующий микроскоп	Carl Zeiss AG	LSM 710
Сульфат магния гексагидрат	Sigma-Aldrich	230391
Крышка микроскопа, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Защитное стекло микроскопа, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Хлорид калия	Fisher Scientific	M-11321
Фосфат калия двухосновной	Sigma-Aldrich	P3786
Хлорид натрия	Fisher Scientific	M-11624
Фосфат натрия двухосновной	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.