Методическая статья

Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51193

⸱

22 января 2014 г.

 , 
1UMR 144, Institut Curie

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись представляет технику применять или освободить силы на прикрепленных клеток или тканей с использованием однонаправленной растяжения.

Аннотация

Механические силы, действующие на клетки и / или ткани играют важную роль в многочисленных процессов. Мы разработали устройство, чтобы растянуть клетки высевают на полидиметилсилоксан (PDMS) мембраны, совместимый с изображениями. Эта техника является воспроизводимым и универсальным. PDMS мембрана может быть micropatterned для того, чтобы ограничить клеток или тканей с определенным геометрии. Первым шагом является печать micropatterns на мембране PDMS с глубоким техники УФ. PDMS мембраны затем монтируется на механическом носилках. Камера связан в верхней части мембраны с биосовместимым смазки, чтобы позволить скольжения во время растяжения. Клетки высевают и давали возможность распространяться в течение нескольких часов на micropatterns. Образец может быть растянут и растяжений несколько раз с использованием микрометрического винта. Это займет меньше минуты, чтобы применить на участке в полном объеме (около 30%). Техника, представленная здесь не включает моторизованный устройство, которое необходимо дляpplying повторяющихся циклов растяжения быстро и / или управляется компьютером растяжения, но это может быть осуществлено. Растяжение клеток или тканей может представлять интерес для вопросов, связанных с сотовых сил, клеточного ответа к механическим воздействиям или ткани формообразования. Это видео презентация покажет, как избежать типичных проблем, которые могут возникнуть при выполнении этого типа, казалось бы, простого эксперимента.

Введение

Клетки, составляющие ткань у высших организмов подвержены механическим напряженности и растягивающих сил ближайшие либо из внешней среды или от окружающих клеток 1,2. Клетки должны адаптироваться и противостоять эти силы для поддержания целостности тканей. Такие силы также важны для тканей формообразования во время разработки 3,4. Применение механических сил на культивируемых клетках это способ имитировать то, что может произойти в ткани, но с количественным и независимого управления формы клеток и деформации клеток 5,6. Для этого несколько методов могут быть использованы. Можно нажать на клетках (вся клетка или ее часть), например с помощью АСМ или производные 7,8 или растянуть подложки клетки, растущие на.

Метод, описанный в этой статье показано, как растянуть плоскости подложки, покрытая клетками. Этот метод был первоначально разработан для оценки роли сил, действующих на мitotic клетки млекопитающих 9. Митотических клеток оставаться на связи с подложкой через отвода волокон и растяжения мембрану, оказываемое усилие на тех волокон, которые, в свою очередь, спровоцированных вращение митотического веретена. Интерес объединения клейкие micropatterns и растяжения является достижение независимый контроль сил и формы отдельных клеток. Это, например, можно протянуть овально клетки в совершенно изотропной круглой формы, в то время как одноосное растяжение применены. Если клетки не свили на micropatterns, одноосное растяжение результаты в удлинения клеток, при этом большинство клеток, имеющих длинную ось совмещена с осью растяжения. Это то трудно отделить эффект длинной оси выравнивания и эффекта на участке, приложенного к клеткам.

Устройство подходит для любого живого изображения клеток, в том числе давно промежуток флуоресцентной микроскопии, и наркотики могут быть добавлены в течение эксперимента. Глубокий метод UVs micropatterning 10был подробно описан в Azioune соавт. был описан 11 Patterning на PDMS в Azioune др. 12. Настоящий растяжения протокол является видео версия Карпи и др. 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Пассивация PDMS

  1. Отрежьте кусок PDMS примерно 35 мм х 20 мм из предварительно сделанного листа (например, GelPak, как указано в таблице материалов).
  2. Снимите верхнюю и нижние защитные слои пластика (при необходимости) и использовать пинцет, чтобы поместить PDMS в пластиковом (не клеточной культуре лечение) чашки Петри.
  3. Промыть PDMS с 70% этанолом в течение 5 мин на ротатор на 30 колебаний / мин.
  4. Сушат поверхность на потоке воздуха на нем.
  5. Освещать с глубокой УФ (λ = 180 нм) в течение 5 мин на расстоянии от УФ луковицы около 5 см (см. материалы лист для ведения лампы; параметры будут отличаться в зависимости от ламп).
  6. Подготовка 200 мкл EDC / NHS решение для каждого PDMS кусок (это должны быть готовы непосредственно перед использованием, так как реакционная способность решения распадается в течение нескольких часов). Для 1 мл 0,05 М MES +0,5 буферных М NaCl при рН 6.0, добавить 11,5 мг сульфо-NHS ​​и 19,2 мг EDC.
  7. ТрансферPDMS листов из чашки Петри на крышке чашки Петри, которые не были освещенной. Это гарантирует, что Окрестности PDMS очень гидрофобным и облегчить следующий шаг.
  8. Добавить раствор EDC / NHS и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  9. Промыть EDC / NHS водой.
  10. Добавить раствор PLL-G-ПЭГ (0,5 мг / мл в 10 мМ HEPES рН 8,6) и инкубируют с 3 часов до в течение ночи при комнатной температуре.
  11. Промойте PLL-G-ПЭГ с водой. Пассивируется PDMS (функционализированные с PLL-п-ПЭГ) могут быть сохранены в течение нескольких дней при 4 ° С.

2. Паттерна PDMS

  1. Возьмите PDMS лист и поместить его на синтетической кварцевого фотошаблонов, хранящим microfeatures для паттерна (см. рисунок 1). Разместите сторону PDMS подшипник PLL-г-ПЭГ перед хром сторону фотошаблонов.
  2. Гореть в течение 7 мин через фотошаблон на расстоянии от УФ-ламп около 5 см.
  3. Добавить воду на маску + PDMS и почистить PDMS медленно с маски.
  4. Инкубировать с фибронектином раствора при 50 мг / мл в HEPES буфере при рН 8,6 в течение 1 часа при комнатной температуре. Можно использовать другие ECM белков, но они не были протестированы с этим протоколом.
  5. Промыть PBS.

3. Монтаж устройства

  1. Установите ранее пассивированы PDMS на растяжение устройства (см. Обсуждение для устранения неисправностей).
    1. Прикрепите одну сторону из PDMS фиксированной части носилках.
    2. Закрепите другую сторону подвижной части носилок без зажима слишком много листа PDMS.
  2. Вырежьте прямоугольник PDMS (22 мм х 19 мм) в толстом PDMS колото-вырезать еще один прямоугольник внутри, чтобы иметь бассейн (или рамку), сохранит клетки и СМИ (см. рисунок 2).
  3. Добавить силиконовую смазку под этот PDMS бассейн и поместите его на верхней части листа PDMS, чтобы создать медий сохраняя бассейн. Смазка позволит скольжение бассейна над листом PDMS при растяжении.

4. Паттерна клеток

  1. Открепления клеток от 50% слияния культуральной колбы с версеном.
  2. Граф клеток и ресуспендируют их в концентрации 200000 клеток / мл.
  3. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в бассейне (см. обсуждение для получения дополнительной информации).
  4. Пусть клетки связываются с узорами в течение 10-30 минут (в зависимости от типа клеток, RPE-1 клетки займет 10 минут, а HeLa клетки 20 мин).
  5. Аккуратно промойте плавающие клетки с уравновешенной среде (равновесие среды в инкубаторе).
  6. Пусть клетки распространяются в течение нескольких часов на паттернов (РПЭ-1 потребуется не менее 2 ч; HeLa клетки понадобится 3 часа).
  7. Добавить покровное на вершине бассейна, чтобы избежать испарения и среднего утечку в случае, если PDMS перерывов.
  8. Поместите устройство на инвертированный микроскоп и начать визуализацию. Избегайте использования иммерсионным Обиjectives как это не будет работать в связи с упором проблемы.

5. Растягивание

  1. Поверните микрометрического винта при коррекции положения этап в X, Y-и Z-оси (в основном х). Положение этап должен быть исправлен, чтобы противодействовать расширению PDMS и потери фокуса. (См. "В ходе стрейч" пункта в обсуждении).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Техника представлена ​​в этом видео протокола позволило применение сил на отвода волокон митотических клетках млекопитающих. Действительно, во время деления клетки, в митотической стадии, клетки млекопитающих отказаться принять форму шара и оставить позади тонких актиновых кабелей, окруженных мембраной, которые прикреплены к субстрату. Эти кабели (отвода волокна), являются память о геометрии клеток перед входом в дивизионе. Создание micropatterns с глубокого УФ через фотошаблон на PDMS тонкой пленки (рис. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя этот метод был использован много раз и проходит тщательную проверку, есть несколько важных шагов, которые могут привести к неудачного эксперимента.

О PDMS:

За эту работу, GelPak, имеющийся в продаже тонкий PDMS лист, был использован. В качестве альтернативы PDMS листов может быть приведен непосредственно из PDMS смеси. Мы рекомендуем использовать GelPak, потому что это более воспроизводимым, и меньше шансов на перерыв по сравнению с на заказ PDMS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была основана Института Кюри, Париж, Франция. Механический носилки предназначены Дэмиена Cuvelier (Институт Кюри) и производится компанией Грэм (MECANIQUE-grem.com). Структурирование на PDMS был разработан Аммар Azioune (II Университета Бордо).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
GelPakGelPakPF-60-X4Доступны различные толщины/липкости. Одной из альтернатив может быть кастинг PDMS  себя.
Силиконовая смазкаGE Bayer SiliconesBaysilone-PasteЭто биосовместимое
устройство для растяженияGREM mé caniqueНосилки 2011 
EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимида гидрохлорид)Sigma3450Стабильный 6 месяцев при -20 °°; C
NHS (N-Гидроксисульфосукцинимид натриевая соль)Sigma56485Protect from moisture
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 мг)SurfaceSolutions (Zurich) 
Синтетическая кварцевая фотомаскаToppanВозьмите стандартную бинарную фотомаску в кварцевом
фибронектине из бычьей плазмыSigmaF1141 

Ссылки

  1. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  2. Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
  3. Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
  4. Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
  5. Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
  6. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
  7. Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
  8. Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
  9. Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
  10. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
  11. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
  12. Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
  13. Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
  14. Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

patterning

Похожие статьи