Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изучение фаголизосомы биогенеза в живых макрофагов

13.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51201

⸱

10 марта 2014 г.

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

В этой статье

Аннотация

Фагоциты играют важную роль в системе врожденного иммунитета путем удаления и ликвидации вторжения микроорганизмов в их фагосом. Фагосомы созревание является сложным и жестко регулируется процесс, при котором зарождается Фагосомы претерпевает радикальные преобразования с помощью хорошо организованных взаимодействий с различных клеточных органелл и отсеков в цитоплазме. Этот процесс, который имеет важное значение для физиологической функции фагоцитирующих клеток по наделяя фагосом с их литических и бактерицидными свойствами, достигает кульминации в слиянии фагосом с лизосом и биогенеза фаголизосомах который считается последним и критический этап созревания для фагосом. В этом докладе мы описываем метод, основанный изображений живых клеток для качественного и количественного анализа динамического процесса лизосом в фагосомы Content Delivery, который является отличительной чертой фаголизосомы биогенеза. Этот подход использует микрошарики IgG-покрытые качестве модели для phagocytosis и флуорофорные-сопряженных декстрана молекулы как просвета лизосом грузов зонда, для того, чтобы следить за динамический доставки контента lysosmal к фагосом в режиме реального времени в живых макрофагов с помощью покадровой обработки изображений и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Здесь мы подробно описать фон, подготовительные шаги и шаг за шагом экспериментальную установку для включения легко и точно развертывание этого метода в других лабораториях. Наша Описанный метод является простой, надежный, а главное, может быть легко адаптирована для изучения phagosomal взаимодействия и созревание в разных системах и при различных экспериментальных условиях, таких как использование различных типов фагоциты, с потерей функции экспериментов, различных датчиков, а фагоцитарные частиц.

Введение

Профессиональные фагоциты, включая макрофаги, играют решающую роль в иммунной системе. Помимо того, что первая линия обороны в врожденной иммунной системы, они также играют важную роль в активации адаптивного иммунитета через их сигнализации и антигенпредставляющих роль 1-3. В то время как функция профессиональных фагоцитов многогранна, Фагосомы созревания является критическим основой бактерицидного и антигена функции обработки профессиональных фагоцитов 4,5. После опосредованного рецептором охвате и поглощения в фагоцитарной цели, такие как бактерии, возникающий Фагосомы проходит через сложную и хорошо организованной последовательности взаимодействия и обменов с отсеках эндоцитотического сети и нескольких других клеточных органелл 6. Характер соединений обменялись с этими клеточными лиц, а также регулирования и сроки событий слияния определяет просвета phagosomal среду и фагоМембрана состав OMAL и, таким образом, 7, судьба созревания фагосомы 8.

Физиологическое значение фагосомы созревания иллюстрируется разнообразными стратегиями, используемыми различными внутриклеточных патогенов вырваться из, ареста или подорвать фагосомы созревание 9. Большинство из этих стратегий прямо или косвенно предотвратить окончательное и критическую стадию процесса созревания фагосомы: слияние фагосомы с конца эндосомный / лизосомальных отсеков, которые придают им основной массы гидролитических ферментов и антибактериальными факторов зрелой фагосомы 7 , 8,10. Анализ этой заключительной и важный шаг, следовательно, может предоставить нам сильных показателей о состоянии созревания фагосом и если естественное физиологическое состояние положительно или отрицательно быть затронуты в конкретных экспериментальных условиях, что в настоящее время используются.

Покойный эндосомный / лизосомные отсекс, как правило, рассматривается как терминал отсеки эндоцитотического пути, определенные и отличающиеся от ранних эндоцитотических отсеков наличием различных, Стадия конкретных, молекулы-маркеры. Например гидролитических ферментов или мембранные компоненты, такие как Лизосомные связанных мембранных белков (ламп) среди других 11. Терминал эндоцитотический отсеки-отныне называют просто лизосом-также служить в качестве основного места для заключительных этапах пищеварения в конце фагоцитарной / эндоцитотический пути 12. Таким образом, неперевариваемые зонды могут быть загружены через эндоцитоз и макропиноцитозом из внеклеточной среды и транспортируется через эндоцитоза пути к лизосом, где она накапливается 13,14 после выполнения определенного цикла поглощения и охоты. Флуорофора, конъюгированным зонды для флуоресцентной микроскопии, такие как органического полимера неперевариваемые декстрана обычно используются в качестве endocyticprobes 15-17.

В этом методе, описаны использование микросфер, покрытых IgG-фагоцитарной как груза для исследования фагосомы созревание путем анализа доставку контента лизосом просвета в фагосом. С помощью флуорофора-сопряженных декстрана зонд как легко выявляемого маркера лизосом в прямом эфире костного мозга, полученных макрофагов (BMM) и покадровой видео изображения с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, мы следуем динамический процесс доставки грузов в фагосом с высоким временное разрешение. Затем мы опишем, как собранные данные покадровой обработки изображений можно оценить с помощью с открытым исходным кодом и свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений, Фиджи (или ImageJ), статистически проанализированы с помощью Microsoft Excel и представлены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 14,18.

После описания нашего метода, аналогичные эксперименты могут быть разработаны с использованием модифицированных параметров и факторов, чтобы исследовать их влияние на фагосомы созревания; практически любой OTее тип прикрепленных первичных или клеточных линий клеток фагоцитов, генетическая потеря экспериментов функциональных включая ген нокаут и нокдаун, мутанты или выражение слитых белков, фагоцитарных-мишеней, соединений Microbead покрытия, эндосомный / лизосомальных зондов и факторов такого цитокины, химические ингибиторы или миРНК среди других все переменные, которые могут быть применены к основной подход, предусмотренный этим методом.

Определим цели и основные требования этого метода следующим образом:

  • Цель метода: для прямого, количественный и качественный наблюдение и анализ фагосомы созревания с высоким временным разрешением в живых фагоцитарные клетки.
  • Фагоцитарная грузов: надлежащим покрытием микрочастиц или биологической мишенью. Здесь мы используем IgG покрытием микрочастиц сферической полистирола 3 мкм, которые легко усвоенные через Fc-γ рецепторов опосредованного фагоцитоза. Кроме того, любой микроорганизм или микрофона с покрытиемroparticle для которых фагоцитарная рецептор присутствует в клетках могут быть использованы.
  • Фагоциты: Приверженец фагоциты, выражающие соответствующие фагоцитарные рецепторы. Здесь мы используем мыши первичные BMMs которые обильно выразить FC-γ рецепторы. В качестве альтернативы, можно использовать дендритные клетки (DC), моноциты или фагоцитирующих эпителиальные клетки или их генетические мутанты или нокаут-варианта.
  • Лизосомные грузов: флуоресцентно меченных лизосомные зонд. Здесь, Texas Red-конъюгированные 70000 кДа декстран (Dex70kD) используется в качестве просвета грузом лизосомах. Кроме того, любой флуоресцентно детектируемый маркер клеточной органеллы, или отсека, или соответствующего зонда для phagosomal свойств, таких как кислотность или деструктивного мощности, может быть использован для изучения прогрессирования фагосомы созревания.
  • Влияние факторов: Например, сигнальных молекул, химических соединений, генной нокдаун или временную экспрессию мутантных белков может. Здесь мы Forgодин использование такого фактора для простоты, но для недавнего примера с мутантной экспрессии белка и бросовым влияющих факторов размещается на Kasmapour др.. 18 Любой фактор, который может повлиять на фагоцитоз или обстоятельства и мобильность фагосом и / или отсеки, которые взаимодействуют с погашением фагосом потенциально могут быть использованы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Уход за животными и все процедуры в этом протоколе следуйте институциональных и национальных руководящих принципов.

Подготовьте препараты, которые указаны на "Π-" заранее.

1. Подготовка BMMs

  1. Выполнение отбраковывать мышей путем смещени шейных позвонков.
  2. Удалить бедра и голени кости, бесплатные кости из ткани и отделка оба конца для доступности костном мозге.
  3. Хранить кости в ледяной PBS или ледяной DMEM среде (не содержащей 100 Е / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, на льду до следующей стадии.
    Примечание: Провести следующие шаги под шкафом класс II биобезопасности, чтобы минимизировать риск заражения.
  4. Флеш медуллярной полости с холодным PBS + пенициллина / стрептомицина с использованием 26 г (0,45 мм) иглы, прикрепленный к 1 мл шприц.
  5. Гранул клетки осторожным центрифугированием при 350 х г в течение 10 мин, ресуспендируют осадок в BMM Medду, а пластина в стерильной микробиологии непокрытыми чашки Петри.
    1. Приготовление среды BMM
      • Игла в модификации Орлы Средний DMEM
      • 10% инактивированной ФТС
      • 20% фибробластов мыши L929 клеточной линии культуральный супернатант (источник макрофагального колониестимулирующего фактора, M-CSF)
      • 5% лошадиной сыворотки
      • 2 мМ глутамина
    2. Получение клеточной линии L929 культуральной среде;
      • RPMI (Мемориал Институт Roswell Park) 1640
      • 10% инактивированной ФТС
      • 2 мМ глутамина
    3. Подготовка фибробластов мышей L929 клеточной линии супернатанта культуры;
      • Сливной L929 клетки были разделены 1:04, культивировали в 175 см 2 колбы в течение 2 дней с использованием 20 мл L929 среду и культуральный супернатант собирали через 48 часов, фильтруют и добавляют к BMM-среде
  6. Инкубируйте клетки удаляется избедренная кость в инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  7. После каждого 48 часов (максимум 72 ч) инкубации, аспирация среду и заменить свежим ВММ среды, на срок до 10 дней. Более 95% клеток были положительны для CD14 как проверено с помощью проточной цитометрии. CD14 является рецептором распознавания выразил основном макрофагами. Определяя процент клеток, позитивных по этим рецептором, чистую культуру адгезивных BMMs был сформирован.

Примечание: подготовить и культура клеток соответственно, если используются другие типы клеток.

2. Покрытие микросферы как фагоцитарной Cargo

  1. Для приготовления 1 мл борта подвески, используйте 400 мкл 2,5% микрочастиц 3 мкм карбоксилированные полистирол, или альтернативные микрочастиц.
  2. Перенести шарик суспензии в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, промыть 3 раза с PBS и добавьте 100 мкл 500 мМ 2 - (N-морфолино) этановсоль ulfonic натрия кислота, MES буфер при рН 6,7 на бортовое гранул.
  3. Растворить 50 мкг мыши IgG (поликлональные антитела IgG) в 50 мкл стерильной DDH 2 O и добавляют к суспензии борта.
  4. Заполните суспензии до 1 мл стерильной DDH 2 O (450 мкл).
  5. Инкубируйте раствор в течение 15 мин на вращающемся колесе при комнатной температуре.
  6. Подготовка EDAC сшивающий агент, N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида в концентрации 10 мг / мл и добавляют 14 мкл на бортовое суспензии.
    Примечание: EDAC поперечные связи аминогруппами IgG с карбоксильными группами на поверхности гранул и облегчает иммобилизацию IgG на поверхности шарика. Это очень важно для поглощения борта и, следовательно, решение должно быть подготовлено недавно.
  7. Инкубировать суспензии на вращающемся колесе в течение 1 часа при комнатной температуре.
  8. Добавить 14 мкл EDAC сшивающего агента и инкубировать суспензии на вращающемся колесе в течение 1 часа при комнатной температуре.
  9. Центрифуга суспензии при 10000 х г в течение 2 мин в микроцентрифуге.
  10. Мыть шарики 3x в стоп-буфера (1% Triton X-100 в 10 мМ Трис, рН 9,4), чтобы остановить реакции сшивки, путем ресуспендирования осадка в стоп-буфера и вращающийся раствора при 10000 х г в течение 2 мин.
  11. Вымойте бисером 3x в PBS и ресуспендируют осадок в 1 мл PBS.
    Дополнительно: Подготовка рабочих аликвоты 30-50 мкл.
  12. не хранить IgG покрытием шарик суспензии при 4 ° С в течение не более 4 недель и никогда не дать суспензии быть заморожены.

Примечание: консервантом, таким как азид натрия в конечной концентрации 0,02% (вес / объем) могут быть добавлены к суспензии для предотвращения роста бактерий и загрязнений. В этом случае стиральная шариков перед его использованием должна быть выполнена, чтобы избежать цитотоксическое действие консерванта. Центрифуга аликвоты суспензии при 10000 х г в течение 2 мин и мыть шарики по ресуспендированием осадка в PBS. Повторите стиральная 3x.

3. Приготовление зонда Декстран исходного раствора

  1. Растворите Texas Red 70000 килодальтонах декстран (Dex70kD) в PBS при 20 мг / мл и хранят при температуре -20 ° С, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Держите акции при -20 ° С в течение нескольких месяцев, или при температуре 4 ° С в течение нескольких недель, обратитесь к документации производителей.
  2. Подготовьте декстрана решение для эксперимента со склада разбавлением ее в полной среде DMEM клеточной культуральной среды (DMEM, 10% FCS, 2 мМ L-глутамина) на приблизительно 1 мг / мл (в несколько раз, что концентрированный раствор будет разбавлен до Окончательный рабочий концентрация 20 мкг / мл перед добавлением к клеткам).
  3. Используйте водяной бани ультразвуковое чтобы разрушать ультразвуком декстрана аликвоты в течение 5 мин для гомогенизации раствора и растворяют агрегаты, которые в дальнейшем могут привести к артефактов поколения во время съемки.
  4. Центрифуга на максимальной гв течение 5 мин в микроцентрифуге, чтобы удалить любые нерастворенные комочки или загрязняющие вещества из раствора.
  5. Тщательно перемещать супернатант в чистую пробирку, избегая при этом осадок на дне пробирки и разбавить раствор до конечного рабочего концентрации 20 мкг / мл в полной среде DMEM среде для культивирования клеток.
  6. Фильтр-стерильный раствор с помощью 0,2 мкм шприц, установленный фильтр с.

4. Декстран Предварительная загрузка

  1. Семенной клеток в живом изображений клеток со стеклянным дном блюда и инкубировать в течение не менее 12 часов (при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы) для обеспечения привязанность и акклиматизацию.
    Примечание: Есть сегментированный стеклянным дном блюда, доступные, которые позволяют выполнять несколько экспериментов (до четырех отсеков) за блюдо.
  2. Подготовьте декстран в растворе DMEM, как описано в Протоколе 3. Прогреть подготовленный декстран в растворе DMEM, с использованием водяной бани при температуре 37 ° С.
  3. Аспирируйте среднегой добавить декстрана решение к клеткам тщательно и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы для 2-8 ч в течение поглощения.
    Примечание: План и оптимизации протокола в зависимости от типа зонда и клеток, который используется и строго поддерживать на эту продолжительность при повторении эксперимента. Это очень важно для профиля декстрана накопления в эндоцитотического пути и, таким образом воспроизводимости экспериментов.
  4. Вымойте клеток 3x с нагретого полной DMEM среда; аспирации средних и тщательно промыть клетки свежей средой.
  5. Инкубируйте клетки с полной DMEM среде в течение 4-12 ч при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
  6. Вымойте клеток один раз нагретого полной фильтруется фенола красного без DMEM среде.
  7. Для получения оптимальных результатов обработки изображений, изменение нагретого полной фильтруется фенола красного без DMEM среде, по крайней мере 30 минут до начала съемки. Фенол красный может вызвать тушение флуоресцентных сигналов, увеличивая фоновый шум итаким образом, уменьшить контрастность и четкость изображения.

Примечание: Настройте микроскоп и настройки визуализации заранее, в соответствии с запланированного и оптимизированного протокола в зависимости от типа зонда и клеток, которые используются.

5. Добавление бисер IgG-покрытием

  1. Равновесие аликвоты preprepared 1% шарик суспензии до комнатной температуры и разрушать ультразвуком в водяной бане ультразвука в течение 2-3 мин.
  2. Добавить 1-6 мкл 1% суспензии борта к полной фильтрованной фенол-красный свободный DMEM среде в шкафу биологической безопасности класс II свести к минимуму риск загрязнения (хорошей отправной концентрации 1 мкл / 2 см2 поверхности тарелки).
    Примечание: Здесь BMMs высевали при 25000 клеток / лунку и через 6 мкл 1% запас шарик суспензии добавляли к среде в чашке. Это примерно равно отношение шарик / клеток 15:01. Отношение должно быть отрегулировано с типом клеток, которые используются и в шарик материала; я.э. латексные шарики имеют низкую плотность и не опускаются на дно быстро, в то время как полистирольные гранулы раковиной и вступают в контакт с адгезивными клетками гораздо быстрее и, таким образом, в больших количествах.
    Примечание: В зависимости от эксперимента, это может быть преимуществом, чтобы выбрать область, которая будет наблюдаться в заранее. Бисера подвеска может быть добавлена ​​только к этой конкретной области со стеклянным дном блюдо, что увеличивает вероятность наблюдения благоприятные поглощения фотохимических окислителей события.
  3. Плотное облако из бисера может быть распространено, осторожно пипеткой подвеску в стекло нижней блюдо.
  4. Подождите, пока шарики не опускаются на дно стакана нижней блюдо и примерно в одной плоскости с прилипшие фагоцитов.
  5. Сосредоточьтесь на интересующей области (ROI) и начать покадровой обработки изображений.

Примечание: Это может быть необходимо, чтобы тонкая настройка фокуса в то время как изображения в прогресс, в зависимости от системы формирования изображения, которая используется, его станцииность и мобильность наблюдаемых клеток. Тем не менее, обратите внимание, что это может вывести невозможно, надлежащего анализа фагосом, что сильно отклоняются от плоскости фокуса в результате переориентации.

6. Изображений

Следуйте общие рекомендации ниже, обеспечивающие оптимальное качество изображения;

  1. С помощью конфокальной системы визуализации, таких как система лазерного сканирования или вращающегося диска.
    Примечание: Leica TCS SP5 AOBS лазерной сканирующей конфокальной микроскопии управляет программное обеспечение Leica LAS AF и оснащен экологического контроля камере используется здесь для видео покадровой обработки изображений.
  2. Оптимизация настроек визуализации, такие как скорость сканирования, увеличения, разрешение и т.д.. таким образом, чтобы обеспечить скоростью кадра в каждом 7-20 сек, в зависимости от используемой системы.
    Примечание: Здесь скорость 200 сканирования Гц, 2x зум сканер и линия усреднение 2-3x с разрешением 512 х 512 пикселей RESUlted в времени записи между 3-5 сек / Раме. Скорость кадра в каждом 10 сек был использован для записи покадровой фильмы с длительностью не менее 120 мин.
  3. Используйте соответствующие параметры возбуждения / выбросов, основанные на используемой системе формирования и зонда (ов).
    1. Оптимизация настроек для предотвращения чрезмерного фото-отбеливание.
      Примечание: Здесь Texas Red Декстран 70kD был взволнован использованием DPSS (561 нм) лазера и излучение света была обнаружена с помощью Leica гибридного детектора (гидравлические) на 600-650 нм с пиком излучения на длине волны 610 нм. Интенсивность лазера должна быть адаптирована к интенсивности сигнала и настолько низким, насколько возможно, чтобы минимизировать фото-отбеливание флуорофора (ов) и токсичности фото действием лазерного излучения на клетки. Как правило, важно, чтобы сбалансировать скорость сканирования, линии усреднение, разрешение сканирования, интервал кадров и продолжительность обработки изображений, чтобы получить правильное и устойчивое интенсивности сигнала и захватить полную длительность захвата шарика и фагосомы созревания проналог.
  4. Включите светлого поля (BF) канал для наблюдения за бусы, если они не сопряжен с флуорофором.
    Примечание: Кроме Красного канала Техас, BF канал был использован для визуализации шарики, то же самое DPSS лазер был использован в качестве источника света и сигнал был обнаружен с фотографией умножитель (ФЭУ) детектора.
    Примечание: Убедитесь, чтобы применить одинаковые параметры записи при приобретении данных, которые должны быть собраны. Наиболее важные параметры: лазерные возбуждения интенсивности, настройка детектора, настройки приобретение, увеличение и интервалы кадров. Не используя идентичные интервалы кадров потребует шаг кривая усреднения как точки данных наблюдений не будут пересекаться (например, собирать наблюдение с кадрами, приобретенных на каждом 7 сек с другим набором с кадрами на всех 12 сек). Это приведет к увеличению шаги, необходимые для оценки данных и требует дополнительного программного обеспечения с функцией кривой усреднения, например OriginLab 'с Происхождение Pro Статистика программное обеспечение ( http://www.originlab.com/ ).
  5. Предпочтительно, сохранить длительная запись на родном файл-формате используемой системы формирования изображения и избежать экспорта в сжатых форматах.

Примечание: Здесь, покадровой фильмы были сохранены в собственном формате Leica LAS AF файлы, которые были затем непосредственно импортного открыть в Фиджи (LIF.). Фиджи является возможность читать родных форматов файлов от большинства производителей микроскопов с помощью входящего в Bio форматы импортера плагин. Экспорт файла покадровой фильм в серии изображений с JPG или TIFF или в виде видеофайла в формате контейнера AVI не требуется и не рекомендуется. В дополнение к сохранению наилучшее качество изображения от первоначального наблюдения, избегая потерями алгоритмы сжатия (например, JPEG), используя родной формат микроскоп файл гарантирует, что мета-данные файла (штампы времени, увеличение, лазерные и приобретение интенсивности, Настройки детектора и т.д.) сохраняется и доступна для Фиджи. Однако, если по какой-либо причине, покадровой видео файлы должны быть экспортированы в другом формате для анализа, не забудьте использовать несжатых форматов, таких как серии TIFF изображений и отдельным цветом RGB (красный, зеленый, синий) каналов уже на этом шаг, как Фиджи, часто не могут успешно отделить BF канал из других цветовых каналов в экспортируемых файлов. Кроме того, убедитесь, чтобы сохранить оригинальные файлы микроскопа в качестве эталона.

7. Анализ покадровой Фильмы

  1. Используйте ImageJ, Фиджи или любое другое программное обеспечение, которое обеспечивает возможность анализа ассоциации сигнал аналоги.
    Примечание: Здесь, Фиджи был использован для анализа покадровой фильмов. Фиджи является распределение ImageJ содержащий пакет обработки изображения с реорганизованных меню инструмента и дополнительных родных плагинов, доступных для свободного скачивания на http://fiji.sc . Способ, описанный в этой сектыион изображен на рисунке 2.
  2. Откройте файл в Фиджи, нажав кнопку "Файл", "Открыть" и выбрать файл, или с помощью перетаскивания файла на Фиджи.
  3. Выберите следующие параметры;
    1. Стек осмотр: Посмотреть суммируется с HyperStack,
    2. Варианты цвета: цветной режим Раскрашенная,
    3. Сплит каналов в отдельных окнах: Сплит каналов (для каждого RGB цветовой канал, который был записан откроется отдельное окно).
  4. В случае серии изображение, которые будут использоваться, загрузить серию Фиджи, перейдя в "Файл", "Импорт", "Изображение Последовательность" и выбрать любой файл изображения в папке, содержащей ряд изображения целевой.
    1. Настройка фильтров и условия для загрузки выбранных изображений в серии, например;
      1. Количество изображений: сколько кадров должны быть загружены.
      2. Начиная изображение: какой образ является отправной кадров в серии.
      3. Увеличение объема: приращение междукадры должны быть загружены (каждый кадр, каждый второй кадр и т.д.)..
      4. Имя файла содержит: фильтрацию для определенного канала, используя имя файла (например, установив "C001", которая является, как правило, изображения с "Канал 1" помечены после цветовой разделения многоканального покадровой видео).
  5. Удалить масштабирование, перейдя в "Анализ", "Установить масштаб ...", установив флажок "Глобальный" и нажать кнопку "Нажмите, чтобы удалить масштаб".
    Примечание: Этот шаг позволяет пиксель на основе анализа изображений в случае разные увеличения были использованы для различных экспериментальных наборов, которые должны быть оценены. Если настройки увеличения всегда остается постоянной и файл родной микроскоп был напрямую импортированы в страну Фиджи, этот шаг можно пропустить, как Фиджи могут понять и использовать увеличение и масштабные данные из метаданных файла микроскопа.
  6. Настройте параметр измеренияс, перейдя в "Анализ", "Set Измерения" и следующие флажки: "Площадь", "Стандартное отклонение", "Комплексная плотность", "ярлык Изображение" и "Среднее значение серого".
  7. Перенаправление на цветовой канал, который содержит сигнал от зонда, который должен быть измерен и подтвердите "OK".
  8. Перейти в кадре, в котором измерения должен быть начат и выберите окно BF канала, нажав на верхней кромке окна.
  9. Используйте "овальное выделение функции", чтобы выбрать интересующую область (ROI), т.е. круговой ROI на интернализованной шарик. Убедитесь, что выбор плотно подогнаны к внешнему краю борта, как в видимой BF канала.
    Примечание: При использовании ПК, держите Shift-ключ, используя инструмент выделения, чтобы обеспечить круговую ROI.
  10. Начать измерение оптимально несколько кадров перед полном охвате борта выполнены и отметитькадр, в котором полностью сформирован возникающий шарик-Фагосомы формируется и фагоцитарной чашка закрыт. Это должно быть относительно четко распознаваемы в BF канала.
  11. К "Анализ" и нажмите "Измерить" для выполнения измерений; результат будет отображаться в отдельном окне под названием "Результаты".
  12. Перейти к следующему кадру, отрегулируйте положение ROI в случае шарик переехал, и повторите измерение. Результат будет добавлен в список в окне результатов, каждый проанализированы кадр может быть идентифицирован на основе значения в колонке "Метка".
    Примечание: Используя сочетания клавиш (например, "M" для измерения) может значительно ускорить процесс оценки, см. список ярлыков и назначить костюм них в меню "Плагины".
  13. После завершения измерения всех соответствующих кадров, результаты могут быть скопированы в электронных таблицах, таких как MS Excel. В столбце "IntDen" изображает intensitieс выбранной области в канале, что измерение был перенаправлен в.

8. Отбеливание Исправление

В зависимости от используемого зонда и настройки изображений, фото-отбеливание может произойти. В зависимости от его степени, это может сильно повлиять на исход оценки. Тем не менее, этот эффект может быть частично исправлены путем применения равное, но противоположное скорость изменения к измеренным значениям. Если присутствует, коэффициент фото-отбеливание может быть рассчитана путем измерения нестационарного снижение интенсивности сигнала во всем кадре, или специально обрезанной область кадра, в течение времени пролета, имеющие отношение к анализу каждого фагосомы. Этот процесс изображен на фиг.3 и 4.

  1. В меню "Плагины" Фиджи, использовать "Время анализатор серии" подключаемый модуль для определения общее снижение всей рамы, или ROI конкретный интенсивность сигнала датчика с течением времени (рис. 3).
    Примечание: серии Time Analyzer плагин доступен для скачивания на http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , в случае уже нет в меню Плагины.
  2. Участок измерение против времени (в секундах) в MS Excel, только для кадров, которые соответствуют рамках анализируемого фагосомы.
  3. Применить линейный тренд-линии (рис. 4А) с участком; отрицательный наклон для уменьшения сигнала указывает на наличие фото-отбеливающий эффект.
  4. Примените обратную склону до значений от анализируемого фагосомы (рис. 4В и 4С): Исправлено интенсивность сигнала (SI) = сырой С.И. + (время в секундах * обратный наклон)

Примечание: каждый отдельный проанализированы Фагосомы будет иметь определенный временной промежуток (начиная с полного поглощения кадра) во время записанного покадровой фильма; фото-bleacХин должен быть пересчитан для этого конкретного диапазона и будет действовать только для коррекции измеренных значений от этой конкретной фагосомы.

9. Оценка данных

  1. Подборка данных и рассчитать среднее и статистическую погрешность значений отбеливающих коррекцией в соответствующее программное обеспечение.
  2. Участок оцененные данные в соответствующей форме.

Примечание: Здесь, научные статистики и построения программного обеспечения GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ был использован). Призма программное обеспечение способно генерировать и сюжет среднюю кривую с соответствующими показателями ошибок тех пор, пока все данные имеют одинаковую частоту кадров (т.е. все были приобретены с той же периодичностью, например, один кадр каждые 10 сек).

Примечание: Широкие вариации абсолютных значений СИ в рамках повторов одного и того же ЭксперимЛОР набор познакомит очень большой статистической погрешности и сделать данные непригодными для использования. Это может быть в случае, если протокол, настройки например изображений, не проводятся строго идентичны между различными повторов эксперимента, которые должны быть собраны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Правильная подготовка клеток и бусы для визуализации имеет решающее значение. Рисунок 1 показывает схему посева, зонда-погрузки и первых шагов изображений в этом методе, основанном на нашем оптимизированного протокола для BMMs. Поэтому крайне важно, что параметры протокола быть проверены и оптимизированы в зависимости от типа клеток и зондов, которые должны быть использованы.

После добавления IgG, покрытых шариков к предварительно загруженных клеток, важно, что поле зрения в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В следующем разделе мы обсудим важные этапы предложенного метода и его ограничения. Кроме того, мы подключим некоторые из распространенных проблем, с их решениями, ввести возможные изменения и рассмотреть преимущества нашего метода, а также подходящие дополнительные методы для этого подхода.

Приготовление шариков, в том числе сочетания IgG к поверхности шарика, имеет решающее значение, и использование несвежий препаратов следует избегать. В добавок к этому, она также имеет важное значение, ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим членов биологической лаборатории фагосомы за критическое прочтение рукописи. Эта работа поддержана грантом Гельмгольца Молодая следователь (инициатива и Сетевые средств из Гельмгольца) и Программы Priority SPP1580 Грант немецкого исследовательского совета (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированная среда Dulbecco's Eagles (D-MEM)PAA, АвстрияE15-009
Модифицированная среда Dulbecco's Eagles без фенола красного (D-MEM)PAA, АвстрияE15-047
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)PAA, АвстрияA15-151
L-глутаминPAA, АвстрияM11-004
PBSPAA, АвстрияH15-002
Пенициллин/стрептомицинPAA, АвстрияP11-010
WillCo-dish® Тарелка со стеклянным дном (35 мм &пусто;, #1.5)WillCo Wells, НидерландыGWSt-3522
CELLviewTM, 35 ммGreiner Bio one, Германия627871Альтернатива: Доступны в виде сегментированных
карбоксилированных латексных микросферPolysciences, США#09850Доступны в разных диаметрах, мы использовали 3 μ m
Микрочастицы полистиролаKisker Biotech, ГерманияPPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, Германия305.1.3
мышь целая IgGRockland, США010-0102
EDAC сшивающий агентSigma-Aldrich, СШАE6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich,СШАT1503
1-мл шприц 1 мл Omnifix -FB.Braun, Германия9161406V
26  Игла G (0,45*25 мм)B.Baun, Германия4657683
RPMI 1640PAA, АвстрияE15-039
Сыворотка для лошадейGibco, США16050-122
MES гидратSigma-Aldrich, СШАM2933
0,2 μ М шприц монтажный фильтрSartorius, Германия83.1826.001
Тарелка со стеклянным дном

Ссылки

  1. Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
  2. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
  3. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  4. Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
  5. Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  7. Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
  8. Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
  9. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  10. Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
  11. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
  12. Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
  13. Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
  14. de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
  15. Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
  16. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  17. Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
  18. Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
  19. Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
  20. Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
  21. Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
  22. Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
  23. Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
  24. Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
  25. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
  26. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
  27. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
  28. Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  29. Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
  30. Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
  31. Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).
  32. Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
  33. Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  34. Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Созревание фагосомывизуализация живых клетокконфокальная микроскопиятаймлапс-визуализациядоставка лизосомального содержимогомикросферы с покрытием из IgGдекстрановый зондмакрофаги костного мозгафлуоресцентная микроскопия
Изучение фаголизосомы биогенеза в живых макрофагов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.