Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51202

⸱

27 января 2014 г.

 , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, College Station, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center, Texas A&M University, College Station

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем синтез сплит-интеин опосредованного белка гидрогеля. Строительные блоки этом гидрогель две белковые Сополимеры каждая из которых содержит субъединицу тримерного белка, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Смешивание двух сополимеров белка вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок, объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель весьма рН и температуры стабильной, совместимый с органическими растворителями, и легко включает в себя функциональные глобулярных белков.

Аннотация

Мы представляем синтез высокостабильного гидрогеля белка при посредничестве сплит-интеин катализируемой белком реакции транс-сплайсинга. Строительные блоки этом гидрогель две белковые блок-сополимеры, содержащие каждый субъединицу тримерного белок, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Высоко гидрофильный статистического клубка вставлен в один из блок-сополимеров для удержания воды. Смешение двух блочных белок сополимеров вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок с сшивателей с обоих концов, что быстро объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель является очень стабильным при обеих кислотных и основных условиях, при температурах до 50 ° C, и в органических растворителях. Гидрогелевые быстро реформы после разрыва сдвига, вызванных. Включение в "Док-станция для пептида" в гидрогель строительного блока позволяет удобно включение «стыковки белка"-меченых белков-мишеней.Гидрогель совместим с роста среды культуры ткани, поддерживает диффузию молекул 20 кДа, и дает возможность иммобилизации биологически активных глобулярных белков. Применение интеин-опосредованного белком гидрогеля в качестве органического растворителя, совместимого биокатализатора была продемонстрирована путем инкапсуляции пероксидаза хрена фермента и подтверждающих его активность.

Введение

Гидрогели, сделанные полностью из белков нести потенциал, чтобы значительно продвинуться таких различных областях, как тканевой инженерии, доставки лекарств и biofabrication 1. Они предлагают преимущества перед традиционными синтетические полимерные гидрогели включая биосовместимости и потенциал для неинвазивного поддержки включения биологически активных глобулярных белков.

В этой работе мы описываем развитие нового белка гидрогеля, образованного с помощью сплит-интеин опосредованного белка реакции транс-сплайсинга и его применение в качестве белка иммобилизации эшафот (рис. 1). Строительные блоки для этой гидрогеля два белка блок-сополимеры каждая из которых включает N-или С-концевой фрагмент раскола интеин (в и IC) и субъединицы мультимерного белка сшивателя. DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ) использовали в качестве раскола интеина 2,3 и небольшой тримера белка (12 кДа) CutA от Pyrococcus horikoshii </ EM> был использован в качестве сшивающего агента белка 4,5. Различные сшивающие агенты соединены через интеин катализируемой реакции транс-сплайсинга, что приводит к образованию высоко сшитого белкового (гидрогель). НПУ интеин был выбран из-за его быстро кинетики реакции (T 1/2 = 63 сек) и высоким выходом транс-сплайсинга (близко к 80%) 2,3. Белок CutA был выбран в качестве сшивающего агента из-за его высокой стабильности. CutA тримеры иметь температуру денатурации ближайшем 150 ° С и удерживать тримерную структуру четвертичного в растворах, содержащих целых 5 М гуанидина гидрохлорид 4,6. С субъединицы обмен между различными сшивателей является одной из основных причин физического гидрогеля эрозии поверхности 7, очень сильное взаимодействие взаимодействие субъединицы в CutA должны препятствовать такие обмены субъединиц, что приводит к более стабильной гидрогеля. Один из этих блоков содержит также высоко гидрофильный пептид S-фрагмент в качестве середине блока, чтобы облегчить водуУдержание 8.

Смешивание двух строительных блоков гидрогель инициирует реакцию транс-сплайсинга между IN и IC интеин фрагментов, создавая более длительный полипептидную цепь с сшивающими агентами на обоих терминалах. Сшивающие агенты из нескольких таких молекулярных единиц взаимодействуют друг с другом, образуя высоко сшитого сети гидрогеля (рис. 1А). Конкретный "док-станцией пептид" (DSP) включен в один из гидрогеля строительных блоков для облегчения стабильного иммобилизации "док" белка (DP)-меченый белок-мишень в гидрогеле. Использование раскола интеин опосредовать сборку гидрогеля не только обеспечивает дополнительную гибкость для синтеза белка гидрогель, но также обеспечивает высокую плотность, равномерную загрузку целевого белка в течение всего гидрогеля, как целевые белки загружены до образования гидрогеля.

Белок гидрогель интеин опосредованного весьма станцииBLE в водном растворе с небольшим до исключения любых эрозии после 3 месяцев при комнатной температуре. Стабильность сохраняется в широком диапазоне рН (6-10) и температурах (4-50 ° С), а гидрогель также совместим с органическими растворителями. Этот гидрогель используется для иммобилизации двух глобулярных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) и пероксидазы хрена (HRP). Гидрогель улавливания последний белок используется для выполнения Биокатализ в органическом растворителе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Плазмиды Строительство

ПРИМЕЧАНИЕ: Все гены были усилены при стандартных реакций ПЦР с использованием Phusion High-Fidelity ДНК-полимеразы согласно спецификациям изготовителя. Праймеры, используемые для клонирования были описаны ранее 9. Все конструкции приведены в таблице 1.

  1. Для генерации CutA-NpuN (N, Таблица 1):
    1. ПЦР-амплификации CutA и NpuN гены от плазмид pET30-CutA-Tip1 10 и KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, соответственно, с использованием соответствующих праймеров.
    2. Дайджест эти фрагменты с соответствующими ферментами рестрикции и последовательно вставить эти фрагменты в вектор pET26b между промотором Т7 и С-концевой 6xHistidine тега, чтобы генерировать N (рис. 2а).
  2. Для генерации NpuC-S-CutA (С, Таблица 1):
    1. ПЦР-амплификации NpuC, CutA и S фрагментацият [AG 3 (ПЭГ)] 10 из плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CutA-Tip1 10 и 10 переменного тока pQE9 РППА 12, соответственно, с использованием соответствующих праймеров.
    2. Дайджест эти фрагменты с соответствующими ферментами рестрикции и последовательно вставить эти фрагменты в вектор pET26b между промотором Т7 и С-концевой 6xHistidine, чтобы генерировать C (фиг.2В).
  3. Для генерации NpuC-S-SH3 Лига-CutA (С-SH3 Лига, таблица 1):
    1. ПЦР-амплификации CutA с использованием праймеров, содержащих SH3 Лига (PPPALPPKRRR) и гибкий линкер (GGGGS) 2 генерировать фрагмент SH3 Лига-CutA.
    2. Замените ген CutA от C с фрагмент SH3 маяк-CutA.
  4. Для генерации SH3-GFP (табл. 1):
    1. Амплификации гена SH3 из плазмиды pJD757 13, используясоответствующие грунтовки.
    2. Предохранитель этот фрагмент с геном GFP и вставьте ее в вектор pET26b между промотором Т7 (рис. 2С) и С-концевой 6xHistidine тега.

2. Экспрессия белка

  1. Преобразование 50 мкл компетентного химически кишечной палочки BL21 (DE3) с соответствующей экспрессионной плазмиды.
  2. После трансформации серийно разбавленных эти клетки, и пластины их на Лурии-Бертани (LB) / агаровые пластинки, содержащие 50 мкг / мл канамицина.
  3. Инкубируют планшеты, содержащие трансформированные клетки при 37 ° С в течение ~ 15 часов.
  4. После инкубации выбрать пластину, содержащую 50-100 колоний и ресуспендируют всех колоний в 5 мл LB бульоне.
  5. Передача подвеска на 1 л LB бульоне, содержащем канамицин (50 мкг / мл) и клетки расти при 37 ° С при встряхивании при 250 оборотах в минуту. Монитор оптической плотности при 600 нм (OD 600). не расти культуру, пока OD 600 ~ 0,8.
    1. Для C и C-SH3 LIG, индуцируют экспрессию белка добавлением изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в культуре (1 мМ конечной концентрации) и инкубируют культуры при 37 ° С в течение 4 часов при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
    2. Для N и SH3-GFP, охладить культуру ~ 18 ° C путем погружения культуральной колбы на бане с ледяной водой для ~ 5 мин. Индуцируют экспрессию белка путем добавления IPTG к культуре (1 мМ конечной концентрации) и инкубируют культуры при 18 ° С в течение 14-18 часов при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
  6. После экспрессии белка, центрифуге культуры в 6000 х г в течение 20 мин при 4 ° С, чтобы собрать осадок. Магазин клеточный осадок при -80 ° С до использования.

3. Protein Purification

  1. Очистка N (денатурирующих условиях)
    1. Ресуспендируют осадок клеток в буфере А (табл. 2) при 10 мл / г влажного гранул.
    2. Иммерсе пеллет суспензии на лед ной бане и разрушать клетки путем обработки ультразвуком (Amp 10, с 1 сек импульса и паузы 6 сек в течение 1 мин).
    3. Центрифуга лизата при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
    4. Удалите супернатант. Ресуспендируют гранул в буфере DA (содержащий 8 М мочевину) и центрифуги суспензии при 16000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
    5. Pass супернатанта через колонку с 5 мл Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA), предварительно уравновешенную буфером DA.
    6. Столбец Промыть 30 мл буфера DA дополненной 45 мМ имидазола. Элюции очищенного белка с использованием 20 мл буфера с добавлением DA 150 мМ имидазола.
    7. Уменьшение концентрации мочевины в образце белка, чтобы <1 мм либо одним из следующих методов, указанных в 3.1.7.1 или 3.1.7.2:
      1. Диализировать белка в DPBS буфера (табл. 2) при 4 ° С в течение ночи с использованием трубки с <20 кДа отсечкой.
      2. Центрифуга очищенного белка в 30 & #160; кДа ультра-фильтрации колонка спин при 2800 х г, 4 ° С, пока объем не менее 1 мл. Добавить 14 мл DPBS буфера в колонну для разбавления образца белка. Повторите центрифугирования / разведение шаги еще три раза.
    8. После замены буфера добавить дитиотреитола (DTT) в очищенного белка (конечная 2 мм) и белкового концентрата до ~ 100 мг / мл центрифугированием через 30 кДа ультра-фильтрации колонку вращаются на 2800 мкг, 4 ° С.
    9. не Аликвотировать концентрированный белок и хранить при -80 ° С до использования.
  2. Очистка C и C-SH3 LIG (родной условие)
    1. Ресуспендируют осадок клеток в буфере B (рН 6,0) (табл. 2) с добавлением 1x коктейль ингибитора протеазы на 10 мл / г влажного гранул. С помощью кислотного буфера, чтобы минимизировать протеолитический распад белка-мишени.
    2. Лишить клеточной суспензии ультразвуком, как описано в п. 3.1.2. Центрифуга Lysели 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и сохранить супернатант.
    3. Пропускают растворимый лизат через 5-мл колонке Ni-NTA, предварительно уравновешенную буфером В.
    4. Wash колонка с буфером B с добавлением 45 мМ имидазола, и элюирования целевого белка в 20 мл буфера В с добавлением 150 мМ имидазола.
    5. Для C, перейдите к шагу 3.2.6. Для С-SH3 LIG, провести дополнительную ионообменной стадию очистки для удаления частично деградированных белок, как указано в пунктах 3.2.5.1 для 3.2.5.3
      1. Снизить концентрацию NaCl в С-SH3 LIG к <1 мм в соответствии с процедурой, описанной в п. 3.1.7.
      2. Загрузка целевого белка на мл анионит бисером агарозном колонке 5 матрицы, предварительно уравновешенную фосфатным буфером натрия (50 мМ, рН 7,0).
      3. Элюировать целевой белок из колонки с помощью градиента работает из раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0 bufféR к раствору, содержащему тот же буфер с добавлением 1 М NaCl. Отбирают образцы в течение белка элюирования и образцы бассейна с высокой чистоты на основе додецилсульфат полиакриламидного гель-электрофореза натрия (SDS-PAGE).
    6. Буферного обмена очищенного белка в DPBS буфера, как описано в 3.1.7.
    7. Добавить DTT к очищенного белка (конечная концентрация 2 мМ) и концентрат белка до ~ 100 мг / мл с использованием ультрафильтрации спин колонки 30 кДа, как описано в 3.1.8. Аликвоты и хранят концентрированного белкового при -80 ° С до использования.
  3. Очистка SH3-GFP
    1. Ресуспендируют осадок клеток с использованием буфера А при 10 мл / г влажного гранул.
    2. Лишить гранул подвеску с помощью ультразвука, как описано в п. 3.1.2.
    3. Центрифуга лизата при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и собирают супернатант.
    4. Pass супернатанта (растворимый лизат) с помощью 5-мл колонке Ni-NTA, предварительно уравновешеннуюБуфер А.
    5. Промывной колонны 30 мл буфера А с добавлением 45 мМ имидазола. Элюции очищенного белка с использованием 20 мл буфера А с добавкой 150 мМ имидазола.
    6. Буферного обмена очищенного белка в DPBS буфера, используя подход, аналогичный тому, который описан в 3.1.7 и концентрат белка до ~ 150 мг / мл с использованием ультрафильтрации спин колонки 30 кДа, как описано в 3.1.8.
    7. Аликвоты и хранят очищенный белок при -80 ° С до использования.
  4. Анализ с помощью ДСН-ПААГ очищенных образцов, содержащих CutA
    1. Развести каждый очищенного белка в дважды дистиллированной воды, чтобы уменьшить концентрацию NaCl до ~ 1 мМ. При этой концентрации NaCl, большинство белков CutA тримера работать в качестве мономеров на ПААГ с ДСН.
    2. Смешайте образцы с 2x SDS буфере для образцов (0,5 М Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 10% вес / объем ДСН, 0,1% вес / объем бром-фенола синий, 2% β-меркаптоэтанола), инкубировали при 95 ° С в течение 5 мин.
    3. Загрузите СэмаPles на 12% SDS-PAGE гель. Провести электрофорез при постоянном напряжении 200 В для ~ 50 мин.
    4. Заметим, белок в геле при окрашивании кумасси бриллиантовым голубым R250 следующие стандартные протоколы (рис. 1с).

4. Гидрогель Формирование

Примечание: Пример гидрогели, сделанные в этом исследовании содержится 1,6 мМ каждого из гидрогеля строительного блока, если не указано иное. Эта концентрация белка дает мягкий и стабильный гидрогель. ВНИМАНИЕ: азид натрия (NaN 3) добавляют в гидрогеле до конечной концентрации 0,5% вес / об, чтобы предотвратить бактериальное заражение. NaN 3 является высокотоксичным и должны быть обработаны с особой тщательностью, как указано в паспорте безопасности продукта.

  1. Рассчитать объем для каждого из сконцентрированных белков, необходимых для достижения конечной концентрации 1,6 мМ в 100 мкл образца гидрогеля. Например:
    Концентрация N:100 мг / мл
    Молекулярная масса N: 26,3 кДа (см. таблицу 1)
    Желаемый Объем: 100 мкл Желаемый Концентрация: 1,6 мм
    figure-protocol-1
  2. Чтобы сделать 100 мкл гидрогель (1,6 мм), перемешивают С (х мкл, объем рассчитывается по 4,1) с 5% NaN 3 (10 мкл), 100 мМ DTT (5 мкл) и N (Y мкл, объем вычисляются в соответствии с 4.1) внутри стеклянного флакона 2 мл.
  3. Добавить DPBS буфер ((85 - х - у) мкл) в пробирку для достижения конечного объема 100 мкл, и вручную смешивать все компоненты через вихревое движение с помощью пипетки. Примечание: раствор становится очень вязким при смешивании.
  4. Центрифуга смесь в течение 2 мин при 8000 мкг, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  5. Выдержите смесь при комнатнойТемпература ночь, чтобы реакция интеин транс-сплайсинга достичь к завершению. Подтвердите образование гидрогеля, повернув трубку с ног на голову. Белки не будет течь, если гидрогель образуется.
  6. Расчетный выход интеин транс-сплайсинга, проверяя образцы (0,5 мкл каждый), собранных перед стадией 4,2 и 4,5 после шага на SDS-PAGE геле, как описано в 3,4 (рис. 1в).

5. Иммобилизация GFP через док-белка (DP) и док-станции пептид (DSP) Взаимодействие

  1. Чтобы 50 мкл GFP функциональными гидрогель с (1.2 мм), объединить С-SH3 Лига (х мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) и SH3-GFP (у мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) в молярном соотношении 1:1 в 1,7 трубки микроцентрифужных мл и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Добавить 5% NaN 3 (5 мкл), 100 мМ DTT (2,5 мкл), (42.5 - х - у) мкл DPBS в той же пробирке. Добавить п (у мкл, рассчитанный в соответствии с 4.1) для достижения 1:01 молярное отношение N и С-SH3 LIG. Смешайте образец с помощью пипетки на вихревое движение.
  3. Центрифуга смеси при 8000 х г в течение 2 мин и инкубировать смеси при комнатной температуре в течение ночи в темноте. Гидрогель инкапсуляции SH3-GFP формы во время инкубации.

6. Использование 1,6 мм гидрогеля в качестве иммобилизации строительные леса для ферментативной реакции в органическом растворе

  1. Используйте HRP как модель фермента. Подготовка исходного раствора HRP (28 мг / мл или 0,63 мМ) в DPBS.
  2. Чтобы сделать 30 мкл гидрогель (1,6 мм) улавливания HRP, комбинат С (х мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) с HRP (2 мкл), 5% NaN 3 (3 мкл) и DVB-T (1,5 мкл 100 мМ) внутри 1,7 мл центрифужные пробирки.
  3. Добавить п (у </ EM> мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) и DPBS (23,5 - х - у) мкл. Смешайте с кончика пипетки с вихревое движение.
  4. Центрифуга смеси при 8000 х г в течение 2 мин и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи.
    ВНИМАНИЕ: регенты, используемые для следующей анализа активности являются высокотоксичными. Используйте конкретные рекомендации по обеспечению безопасности на соответствующие Сертификаты безопасности материалов.
  5. Для ферментативной реакции, погрузите гидрогель в 1 мл коктейля реакции, содержащих N, N-диметил-п-фенилендиамина (5,8 мм), фенол (5,8 мм) и трет-бутилгидропероксид (2,9 мм) в н-гептана 14. Вручную нарушить гель с использованием пипетки, чтобы увеличить площадь контактной поверхности гидрогеля и растворителя.
  6. Обнаружение HRP продукт, в индофеноле типа красителя, путем измерения оптической поглощение образцов, взятых в разное время при 546 нм в ридере (рис. 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема для интеин-опосредованного формирования белок гидрогель представлен на фиг.1А. Строительные блоки гидрогеля являются белок сополимеры CutA-NpuN (N) и NpuC-S-CutA (C) (рис. 1А, таблица 1). NpuN / C являются N-/C-fragments из естественно разделить DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ). CutA является стабильным тримерный белок из Pyrococcus horikoshii 4,5. Смешивание очищенного N и С в присутствии восстанавливающего агента DTT индуцирует образование третьей бело...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе мы показали, синтез высокостабильного интеин-опосредованной белка гидрогеля. Использование раскола интеин позволяет гидрогель быть условно образованный в ответ на смешении двух жидкофазных компонентов. В частности, раскол интеин ковалентно связывает два жидкофазных строительные блоки с помощью реакции транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок в окружении сшивания блоков, что, в свою очередь самоагрегируется в гидрогеля. Смешивание вызванной формирование гидрогеля обходит технические трудности в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Не существует конкурирующие между собой финансовые интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность д-р Дэвид Tirrell (Caltech) за его любезное дар плазмиды pQE9 переменного тока 10 ATRP 12, доктор Том Мьюир (Принстонский университет) за его любезное дар плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Доктор Такэхиса Мацуда (Канадзава технологический институт, Хакусан, Исикава, Япония) за его любезное дар плазмиды pET30-CutA-Tip1 10, и д-р Джей Д. Keasling (UC Berkley) за его любезную дар плазмиды pJD757 13 . Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом карьеры, ВВС США Ип и программы Норман Hackman Advanced Research.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии

Phusion High Fidelity DNA polymera

New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

New England BioLabs

C2527I

<		p>

Luria Bertani

VWRp>90003-350

Bacto Agar Media

VWR

Kanamycin sulfate

VWR

IPTG

VWRp>EM-5820

Imidazole

VWRp>EM-5720

 < >< / чел>
<>мочевина VWR>ЭМ-9510 <>
<>дитиотреитол (ДТТ) Фишер<>БП172-5 <>
<>коктейль ингибиторов протеазы Roche Applied Science<>11836153001 <>
<>ДПБС VWRp>82020-066

Brilliant Blue R

Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

Fisher

AC190380050

<		p>Caution, высокотоксичные
<>Хренпероксидаза Сигма<>П8125-5КУ <>
<>Н,N-диметил-><эм>-фенилендиаминФишер<>AC408460250 <>Внимание, высокотоксичный
<>фенол Фишер<>AC149340500 <>Осторожно, высокотоксичный
<>трет-бутилгидропероксидФишер<>AC180340050 <>Осторожно, высокотоксичный
<>н-гептан Acros Organics<>120340010 <>

[header]

Shaker/Incubator

Fisher Scientific

Max Q 6000

<		p>

Centrifuge

Sorvall

RC 6

Sonicator

QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

Amicon Ultra

UFC903024

  Колонка Ni Sepharose High Performance

GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ионообменная колонка

GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

 < >< / чел>
<<<<<

Ссылки

  1. Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
  2. Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
  3. Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
  4. Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
  5. Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
  6. Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
  7. Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
  8. McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
  9. Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
  10. Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
  11. Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
  12. Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
  13. Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
  14. Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
  15. Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
  16. Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
  17. Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
  18. Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
  19. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Интеин-опосредованный синтезтранс-сплайсинг расщепленных интеиновбелковые блок-сополимерыаффинная хроматографияформирование гидрогеляиммобилизация ферментастабильность в органических растворителяхпептид-док-станцияпероксидаза хрена
Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.