Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

Mariana G. Bego; Édouard A. Côté; Éric A. Cohen

doi:10.3791/51207

Методическая статья

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51207

⸱

1 сентября 2015 г.

Mariana G. Bego¹ , Édouard A. Côté¹ , Éric A. Cohen¹^,²

¹Laboratory of Human Retrovirology, Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), ²Department of Microbiology, Infectiology, and Immunology, Université de Montréal

В этой статье

Краткое содержание

В отличие от ВИЧ-1 частиц бесклеточных инфицированных ^CD4 + Т-клетки эффективно воспринимается плазмоцитов дендритных клеток (PDCs). Эта рукопись описывает способ, где мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или изолированные PDCs являются совместно культивировали с инфицированных ВИЧ-1 клеток Т оценить врожденную зондирование с помощью PDCs по оценке выпуска типа I IFN.

Аннотация

ВИЧ-1 врожденное зондирования требует прямого контакта инфицированных ^CD4 + Т-клеток с плазмоцитов дендритных клеток (PDCs). С целью изучения этого процесса, протоколы, описанные здесь, используют свежеизолированных человека мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) или плазмоцитов дендритные клетки (PDCs) ощутить инфекции в любом Т-клеточной линии (MT4) или гетерологичных первичных ^CD4 + Т-клеток. Для того чтобы обеспечить правильное определение, необходимо, чтобы РВМС выделяли сразу после сбора и что оптимальное процент инфицированных Т-клеток используются в крови. Кроме того, многопараметрического окрашивание проточной цитометрии могут быть использованы для подтверждения того, что образцы РВМС содержать дифференцировки различных клеток, при физиологических соотношениях. Ряд элементов управления также могут быть включены, чтобы оценить жизнеспособность и функциональность PDCs. Они включают в себя, наличие специфических поверхностных маркеров, оценке клеточные ответы известному агониста Toll-подобные рецепторы (TLR) путей и подтверждающие отсутствие Sponспонтанного типа я интерферона (ИФН) производство. В этой системе, свежевыделенные РВМС или PDCs являются совместно культивировали с ВИЧ-1-инфицированных клеток в 96-луночных планшетах для 18-22 часов. Супернатанты от этих совместных культурах затем используются для определения уровней биологически активных интерферонов типа I. путем мониторинга активацию ISGF3 пути в НЕК-голубых интерферона-альфа / бета-клеток. До и во время условий совместного культивирования клетки-мишени могут быть подвергнуты анализа проточной цитометрии, чтобы определить ряд параметров, в том числе процент инфицированных клеток, уровней специфических поверхностных маркеров, и дифференциального убийство инфицированных клеток. Хотя, эти протоколы были первоначально разработаны, чтобы следовать типа я ИФН производства, они потенциально могут быть использованы для изучения других молекул imuno-модулирующие выпущенные из PDCs и получить дальнейшее понимание молекулярных механизмов, регулирующих ВИЧ-1 врожденное зондирования.

Введение

Типа I IFN-продуцирующих PDCs представляют собой первую линию обороны от вирусных инфекций, и, таким образом служить важным звеном между врожденным и адаптивного иммунитета ^1. В то время как ВИЧ-1 частицы бесклеточных плохо обнаружить врожденной иммунной системы, ВИЧ-1-инфицированных ^CD4 + Т-клетки эффективно воспринимается PDCs ^2. Механизм зондирования требует первоначального контакта между вирусной оболочки гликопротеина gp120 () на поверхности инфицированной клетки и Т молекул CD4 на PDC, который затем следуют захвата и интернализации вирус по PDC. После признания переданного ВИЧ-1 РНК TLR7 вызывает активацию MyD88 / irf7 пути и в конечном итоге приводит к типу-я ИФН производства ^3. Важно отметить, что второй датчик пути присутствуют в PDCs, который опосредован TLR9, ингибируется при взаимодействии вирусного гликопротеина gp120, с PDC-специфического маркера BDCA2 поверхность ^4.

Чувствительного пути TLR7 и TLR9 на PDC может потенциально негативно модулируется участия BST2 (также назначенный Tetherin или CD317) с другой PDC-удельной поверхностной ингибирующий рецептор под названием ILT7 ^5. BST2 экспрессируется на высоком уровне на поверхности PDCs и некоторых раковых клеток, но при относительно низких уровнях в других типах клеток, таких как В-клеток, макрофагов и Т-клеток. Важно отметить, что BST2 может быть вызвано типа I IFN в ряде трансформированных клеточных линий, а также в первичных клеточных культур от человека и мыши происхождения ^6. Помимо своей иммунной функции регулирования, BST2 недавно обнаружено, ингибируют высвобождение ВИЧ-1 и других оболочечных вирусных частиц с помощью сшивающих формирующихся вирусных частиц на поверхности клетки инфицированной ^7. В случае ВИЧ-1, вирус кодированный белок аксессуар U (Vpu) было показано, действуют в качестве антагониста BST2. Считается, что Vpu подавляет BST2 от клеточной поверхности ВИЧ-1-инфицированных клеток, сайт его тросаING деятельность, и в результате повышает вирусный выпуск и распространение ^7, хотя это понятие было оспорено ^8,9. При отсутствии VPU, большое количество полностью сформирован и зрелый потомство ВИЧ-1 частицы удерживаются на поверхности клетки. Будут ли эти частицы привязные может представлять эффективные цели для иммунной зондирования до сих пор остается открытым. Кроме того, неясно, можно ли Vpu dysregulate типа-я ИФН производства от PDCs путем модуляции поверхности BST2 уровней.

Ранние исследования, предназначенные для оценки ВИЧ-1 зондирования проводились с использованием ВИЧ-1 частицы клеток без, которые, как правило, считаются бедными индукторов типа I IFN ^3,10-12. Учитывая, что последние исследования показывают, что МНПК и PDCs эффективно ощутить ВИЧ-инфицированных CD4 + Т-лимфоциты ^2,13,14, мы описываем здесь простой метод для измерения врожденные ответов запускаемые PDCs после признания ВИЧ-1-инфицированных клеток в пробирке.

Протокол

Общие замечания

Важно, чтобы держать клеток в культуре без антибиотика, так как даже контролируемые бактериальные инфекции может воспринимать РВМС. Такой чувствительный бактериальных компонентов будет вызывать продукцию интерферона фона, что не может быть отличимо от вызваны конкретной ВИЧ-1 зондирования. Кроме того, все клетки должны регулярно проверяться на отсутствие загрязнения микоплазмой.

Всегда используйте эндотоксина решения, когда это возможно.

Проточной цитометрии характеристика различных клеток, которые будут использоваться в совместных культурах (РВМС, PDCs, МТ4 и CD4 ^{+ Т-клетки)} является необязательным этапом, но настоятельно рекомендуется, так как это может дать ценную информацию, необходимую для правильной интерпретации данного эксперимента.

1. Подготовка инфицированных клеток-мишеней

Поддержание клеток человека линии ^CD4 + T MT4 в RPMI 1640 Mediс добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), называемый с этого момента, как RPMI-1640 полной среде.
Выделение первичных ^CD4 + Т-клеток.
1. Изолировать мононуклеарных клеток из периферической крови человека центрифугированием в градиенте плотности.
2. Изолировать ^CD4 + Т-лимфоциты, используя ^CD4 + Т-клеток негативный отбор комплект, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
3. Активация ^CD4 + Т-лимфоцитов PHA-L (5 мкг / мл) в течение 48 ч, а затем поддерживать клетки в RPMI-1640 среде, дополненной полного рекомбинантным IL-2 (100 ед / мл). Инфекция первичный Т-клетки 5 дней после изоляции.
Заражение клеток-мишеней (МТ4 T клеточной линии или гетерологичных первичных ^CD4 + Т-клеток).
1. За два дня до совместного культивирования, заражают Т-клеток ВИЧ-1 вируса. В конкретном примере, описанном здесь были использованы pNL4.3-GFP_ires_Nef дикого типа (WT) или pNL4.3-GFP_ires_Nef дельта ВПУ (dVpu) вирусы. Эти штаммы представляют вирусные GREан флуоресцентный белок (GFP), отмеченные звёздочкой изогенные инфекционных молекулярные клоны, отличающиеся только в их способности выражать ВПУ.
2. Используйте различные кратности инфекции (MÕIS) и выберите культур с аналогичными уровнями инфекции для сокультурах. В день совместного культивирования, определить процент GFP + клеток с помощью проточной цитометрии в качестве маркера инфекции. Используйте только культуры с диапазоном 20-50% инфицированных клеток для совместного культур.

Дополнительные шаги: Выполните окрашивание цитометрический потока в этой точке, чтобы оценить поверхностную экспрессию молекул / лигандов интерес, таких как BST2 и CD4. Для окрашивания клеточной поверхности, ресуспендируют 0,5 х 10 ⁶ Т-клеток в 100 мкл промывочного раствора, добавить 1 мкл анти-CD4_PerCP / Cy5.5 и 1 мкл анти-BST2_A660. Инкубируйте пробирки в течение 45 мин при 4 ° С, а затем промывали проточной цитометрии промывочного раствора. Если исследования направлены на оценку роли ВПУ-опосредованной BST2 антагонизма, выполнить ВИЧ-1 частицырелиз анализа в это время, как описано выше ^15.

2. Выделение и Обогащение Чувствуя клеток (цельная МНПК или обогащенным PDCs)

Примечание: При МНПК используются для зондирования, начать изоляцию в течение получаса после сбора час крови и провести его своевременно. Использовать немедленно МНПК для сокультурах или PDC обогащения.

Изолировать мононуклеарных клеток из периферической крови человека центрифугированием в градиенте плотности.
Необязательный шаг: Выполнение нескольких параметрического окрашивание проточной цитометрии, чтобы подтвердить, что свежевыделенных МНПК содержать различные клеточные клоны при физиологических соотношениях. Для окрашивания клеточной поверхности, ресуспендируют 10 ⁶ РВМС в 100 мкл блокирующего раствора Fc, и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С. После блокирования добавляют 1 мкл анти-CD3_Pacific синий (для Т-клеток), 1 мкл анти-CD14-PE_Texas красный (для миелоидных клеток), 4 мкл анти-BDCA2_APC и 1 мкл анти-ILT7_PE (для PDCs). ВысиживатьТрубы для 45 мин при 4 ° С, а затем промывали проточной цитометрии промывочного раствора.
Пополните PDCs помощью PDC негативный отбор комплект, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Рекомендуется работать быстро, сохранить клетки холодно, и использовать предварительно охлаждают решения. Это позволит предотвратить укупорки антител на поверхности клеток и неспецифической маркировки клеток, а также обеспечения максимальной активности PDC.
1. Выполнение нескольких параметрический анализ проточной цитометрии из свежеизолированных PDCs, чтобы подтвердить чистоту, процент обогащения, и относительные количества pDC- конкретных поверхностных маркеров (например, ILT7 и BDCA2). Для окрашивания клеточной поверхности, ресуспендируют 10 ⁴ PDCs в 100 мкл блокирующего раствора Fc, и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С. После блокирования добавляют 1 мкл анти-CD3_Pacific синий, 1 мкл анти-CD14_PE_Texas красный, 4 мкл анти-BDCA2_APC и 1 мкл анти-ILT7_PE. Инкубируйте пробирки в течение 45 мин при 4 ° С, а затем промывали проточной цитометрии промывочного раствора (PBS, 5мМ ЭДТА, 5% FBS). Минимум 40% PDC чистоты рекомендуется (если исходный материал имеет 0,4% PDC, это было бы эквивалентно 100-кратному обогащению).

3. Совместное культивирование инфицированных ^CD4 + Т-клеток и клеток зондирования (Whole МНПК или обогащенным PDCs)

Смешайте 220 мкл РВМС (разбавленный на 850000 клеток / мл) или 220 мкл PDCs (при концентрации в диапазоне от 100000 до 500000 клеток / мл) с 30 мкл инфицированных Т-клеток (разбавленный в 10 ⁶ клеток / мл) на лунку в П-96 также нижняя пластина.
1. В качестве контроля, пластины МНПК или PDCs и Т-клеток в одиночку. Регулировка громкости в хорошо до 250 мкл с RPMI 1640 полной среде.
2. Оценка клеточные ответы на известной агониста путей TLR7 и TLR9. С этой целью пластина 220 мкл РВМС (разбавленного до 850000 клеток / мл) или 200 мкл PDCs (при концентрации в диапазоне от 100000 до 500000 клеток / мл) на лунку в U-нижней 96-луночный планшет и добавить агонист TLR7 ( Имиquimod, конечная концентрация: 2,5 мкг / мл) или агонист TLR9 (ODN 2 216 CpG-A, конечная концентрация: 5 мкМ). Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% _СО 2 в течение 18-22 ч и обрабатывать их аналогично совместного культивировани, описанных ниже.
Выдержите сопутствующих культур при 37 ° С и 5% _СО 2 в течение 18-22 ч, а затем передавать их на V-дно 96-луночного планшета. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г в.
1. Перевести супернатантами к луночного планшета с плоским дном 96. Супернатанты можно хранить при -80 ° С или используется для обнаружения типа I IFN немедленно.
2. Ресуспендируют совместном культивировании клеток в 2% параформальдегида и анализировать их с помощью проточной цитометрии. Из-за различий в размерах и грануляции, клетки МТ4 легко отличить от МНПК или PDCs на основе их боковой разброс (СС) в сравнении с прямого рассеяния (FS) профилей. Если первичные Т-клетки используются в качестве целевых клеток, инфицированных, они могут быть окрашены в любой следящей клеток красителем, таким как CSFE, до совместного культивирования.
Измерение биологически активного типа-I IFN с помощью НЕК-синий ИФН-альфа / бета репортер клетки.
Примечание: Эти клетки были получены с помощью стабильной трансфекции клеток НЕК293 с STAT2 и irf9 генов человека, чтобы получить полностью активный IFN типа I сигнального пути. Они также содержат секретируется щелочной фосфатазы (SEAP) ген-репортер под контролем интерферона-альфа / бета индуцируемый промотор ISG54. Стимуляция этих клеток типа I IFN активирует JAK / STAT / ISGF3 путь и индуцирует выработку SEAP.
1. Поддержание НЕК-синий IFN-α / -клеток в DMEM с добавлением 10% FBS. Пластина их при плотности 50000 клеток на лунку в луночный планшет с плоским дном 96, в конечном объеме 180 мкл.
2. Добавьте 20 мкл совместно культурального супернатанта в каждую лунку в двух повторностях. Каждая пластина также требует набора стандартных элементов управления внутренних (человек IFN &, конечная концентрация от 100 ед / мл до 2500 ед / мл). Инкубируйте пластин при 37 ° С и _5% СО 2 в течение 18-22 Ч.
3. Определить уровни активности щелочной фосфатазы с использованием количественно-синий раствор, который изменяет цвет от розового до фиолетового / синего в присутствии фермента. Подготовка количественно-синий в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Добавить 180 мкл этого раствора в каждую лунку луночный планшет с плоским дном 96. В каждую лунку добавить 20 мкл индуцированных НЕК-синий ИФН-α / -клеток супернатантах, и инкубировать пластины в 37 ° C инкубаторе до цвета не развивается в стандартных контрольных скважин ИФН.
4. Оценка уровней SEAP с помощью спектрофотометра при 620-655 нм и определяют концентрацию типа I IFN путем экстраполяции линейной части калибровочной кривой IFN.

Результаты

Система совместного культивирования описано на фиг.1, позволяет контролируемом исследовании ВИЧ-1 врожденной зондирования. В связи с переменной природы первичных клеток, важно, что нормальные отношения миелоидных и Т-клеток (CD14 ^{+ и CD3} + соответственно) наблюдаются, например, в примере, показанном на фиг.2А. Кроме того, только небольшое число активированных Т-клеток (высших ФС и более высоких уровнях CD3 по сравнению с не-активированных Т-клеток) желательно в свежевыделенных PBMCs культур. РВМС с аномальными соотношений между различными типов клеток часто неспособны монтажа надлежащего врожденный иммунный ответ в пробирке, вероятно из-за уже активированного фенотипа вследствие постоянной инфекции. Самое главное, относительная доля PDCs должна быть оценена, как показано на рисунке 2В. Хотя этот процент может варьироваться от 0,2 до 1,2%, ненормальное фенотип зондирования наблюдается с обоими экстремумаМОН в этом диапазоне. Обогащение PDCs использованием негативной селекции часто приводит к 50-95% PDC чистоту, как показано на двух примерах из на фиг.2В (92% и 72%). Типичного примера для всего эксперимента показан на фиг.3 и 4. В этом примере, МТ4 клетки инфицировали pNL4.3-GFP_ires_Nef WT или дельта VPU достичь 30% инфекции во время совместного культивирования (фиг.3А). Как описано выше, только инфекции с вирусом дикого типа привело к значительному понижающей регуляции поверхности BST2 (фиг.3В). Из-за их различий в размерах и степени детализации, Клетки МТ4 может быть легко отличить от РВМС с помощью проточной цитометрии (4А). После совместного культивирования инкубации РВМС только в контакте с известным TLR7 или TLR9 агониста и РВМС в контакте с ВИЧ-1 инфицированных клеток высвобождали значительные количества типа I IFN (фиг.4В). Нет ИФН не был обнаружен в МНПК в одиночку, МНПК сотрудничества кубltured с ложно-инфицированных клеток МТ4, или в инфицированных клетках МТ4 только (Рис 4б). В примере, представленном здесь, врожденная зондирование ВИЧ-1-инфицированных клеток МТ4 по РВМС было установлено, что значительно снижается в присутствии VPU.

figure-results-1
Рисунок 1:. Принципиальная обзор экспериментального проектирования СУП: супернатант Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

figure-results-2
Рисунок 2: Фенотипическая характеристика свежевыделенных МНПК и ENRiched PDCs. (A) Нормальное распределение миелоидных клеток и Т-клеток, наблюдаемых в РВМС, выделенных от здорового донора (в процентах от миелоидных клеток должна быть в пределах 10-20%, а Т-клетки между 55-65%). Образец МНПК окрашивали флуорофорные-сопряженных антитела, которые распознают поверхности CD14 (миелоидной маркер) и CD3 (Т-клеток маркера). (Б) Фенотипическая характеристика PDCs. Перед обогащением PDCs составляют от 0,2-1,2% от общего числа клеток в РВМС (0,99% в показанном примере). Эти клетки могут быть идентифицированы на основе экспрессии специфических маркеров, таких как BDCA2 и ILT7, присутствующих на поверхности клеток. Отрицательный отбор может быть использован для обогащения значительно числа PDCs и устранить вредные потенциально загрязнения, такие как CD14 ⁺ клеток (миелоидных обогащение идущих 92% и 72% в двух примерах показаны). Клиск здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

figure-results-3
Рисунок 3:. Характеристика ВИЧ-1-инфицированных клеток-мишеней МТ4 (А) Процент инфицированных клеток в культурах MT4, зараженных pNL4.3-GFP_ires_Nef WT или dVpu как определено процент GFP-положительных клеток. Выражение (В) BST2 с клеточной поверхностью в инфицированных клетках оценивали после окрашивания поверхности. Серые гистограммы представляют заполнено макет-инфицированные клетки, окрашенные неиммунной сыворотки кролика (неокрашенных контроль); остальные гистограммы представляют клеток, окрашенных анти-BST2 поликлональные сыворотки кролика. Гистограммы с сплошными линиями представляют управления GFP отрицательные (NEG) клетки; в то время как гистограммы с пунктирными линиями соответствуют инфицированных GFP положительных (POS) клеток. Средняя гриппИнтенсивность ценции (MFI) значения указаны для каждого образца. Проточной цитометрии проводили и анализировали, как описано на рисунке 2. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

figure-results-4
Рисунок 4: CO. Культуры свежевыделенных МНПК и инфицированных клеток МТ4 Т (А) Сравнение проточной цитометрии FS / SS профилей, наблюдаемых для одних МТ4 Т-клеток, только МНПК, или сокультурах между МНПК и МТ4 Т-клеток. Из-за различий в размерах и степени детализации, МТ4 Т-клетки могут быть легко отличить от МНПК в совместных культурах с использованием проточной цитометрии. (Б) типичный пример сумме типа I IFN опубликованном после стимуляции МКПК с TLR7 или TLR9 агонист (назад), или после сокультурах с притворным или указанных MT4 клетках, инфицированных pNL4.3-GFP_ires_Nef WT или dVpu. Исходные данные показали, как ОД ₆₅₀ значений и их соответствующее converseion для типа I концентрацию IFN, выраженное в U / мл. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Обсуждение

Протоколы, описанные здесь измерения зондирования Т-клеток, инфицированных GFP-тегами ВИЧ-1 вирусов, которые отличаются только в их способности выражать ВПУ, как описано в нашей последнего доклада ^18. Тем не менее, эти методы можно легко модифицировать для изучения зондирование непомеченных вирусов, а также вирусов, не имеющих других вирусных генов, которые потенциально могут модулировать врожденный зондирования. Если вирусы, используемые не экспрессируют GFP, процент инфицированных клеток-мишеней должна быть определена другими способами предшествующих со-культуры, такие как р24 (капсида) внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии, или р24 ELISA. Кроме того, эти протоколы могут быть использованы с различными целевыми Т-клеток, в том числе различных доступных клеточных линий и первичных клеток.

Методы, описанные в этой рукописи имеют ряд преимуществ по сравнению с ранних методик, используемых для исследования ВИЧ-1 зондирования. В первую очередь он был создан ряд групп, которые бесклеточный ВИЧ-1 рстатьи бедные индукторы типа I IFN ^2,13,14. Кроме того, ранние исследования опирались на старые методы IFN & ИФА на основе количественной оценки количества типа I IFN производится. Ограничение этого метода обнаружения, что большинство старых комплектов IFN & ELISA измерять только один тип alpha; -IFN, в то время как с видом на другие типы & alpha; -IFN и IFNβ. Применение описанных линий клеток репортерных преодолевает это ограничение, так как концентрация всех биологически активных форм интерферонов типа I. человека может быть измерен за один раз. Методика очень чувствительна, дешевле, чем новое поколение ИФН ELISA комплекта и в течение многих доноров большие количества типа I IFN могут быть легко обнаружены. Тем не менее, этот протокол может быть легко адаптирована для использования с другими типа-я ИФН методов чтения из таких, как ИФА.

Критические шаги: Важно, что качество всех клеточных компонентов (Обе цели и эффекторов) быть жестко контролируется. Потенциал загрязнения, даже когда asymptomatic, нужно контролировать и управлять. Как упоминалось ранее, антибиотик управлением бессимптомной бактериальное заражение, и, возможно, другие внутриклеточных возбудителей, таких как микоплазмы, может генерировать подобные иммунные ответы на те наблюдаемые после инфекции ВИЧ-1, а именно производства типа I IFN. Кроме того, все реагенты должны быть свободны от ЛПС или других потенциальных эндотоксинов. Точно так же, мониторинг МНПК и PDCs также важно, так как образцы человека часто может быть загрунтованы с помощью основных текущих инфекций, которые могут повлиять на нормальное зондирование. Мы рекомендуем всегда включать предлагаемые отрицательных контролей, такой отсутствие клеток-мишеней, а также сопутствующих культур с ложно инфицированных клеток. Жизнеспособность инфицированных клеток также имеет важное значение для правильного PDC зондирования, поскольку типа I IFN не производится после совместного культивирования с апоптотических клеток ^2,14.

Одним из важных ограничение метода является необходимость свежевыделенных первичных клеток. Эта процедура непротестированы с использованием МНПК или PDCs, которые были либо ранее замороженные или хранятся в культуре. Изоляция МНПК является трудоемким и эти клетки имеют очень ограниченный срок службы. Кроме того, стандартные протоколы для защиты от через кровь возбудителя следует использовать при работе с кровью человека. Есть часто несколько источников изменчивости, связанные с работой с участием Свежевыделенные клетки человека. Среди них различные процедуры, осуществляемые изолировать эти клетки, и унаследовал изменчивость встречающиеся из донора-на-донора. В то время как это невозможно, чтобы избежать вариабельность донора, использование предложенных положительного контроля, таких как измерения ответ на известных агонистов TLR7 и TLR9 путей, обеспечит важную внутреннего контроля для этих экспериментов. Мы заметили, что надежный ответ на агонисты TLR9 пути может быть связано со здоровым PDC ответ, в то время отзывчивый TLR7 путь необходим для правильного ответа против ВИЧ-1 ^3.

На основании наблюдений, сделанных нами и другими ^2, обогащение PDCs от МНПК часто не нужны. Однако, если опытно-конструкторских требует (например, в условиях, когда истощение конкретных PDC поверхностных маркеров необходимо) негативной селекции является более предпочтительным, чем позитивной селекции, а клетки остаются свободными антител после отбора. Изолированные PDCs подвергаются быстрому апоптоза в культуре. Для экспериментов, которые требуют эти клетки культивировали в течение быть длительного периода времени, питательные среды может быть дополнена IL-3. Этот цитокин индуцирует пролиферацию PDC и ингибирует их апоптоз ^16. Тем не менее, Ил-3 использование должно быть жестко контролируется, так как это может привести к PDC созревания или дифференциации.

Метод, описанный здесь сочетает в себе цель ВИЧ-1-инфицированных клеток с свежевыделенных МНПК или PDCs для того, чтобы воссоздать исходные этапы во врожденной зондирования. Этот метод, несомненно, будет полезна для Explorе ранние врожденной иммунной события, связанные с ВИЧ-инфекцией. Хотя связанные протоколы направлены на измерение типа I IFN, они легко могут быть изменены для измерения других биологически активных молекул, освобожденных из PDCs после признания инфицированных клеток. Они могут включать: типа III ИФН (ИФН-λ), провоспалительных цитокинов (таких как TNF-a и IL-6) и хемокинов, CXCL10 CCl4 и CCL5 ^17.

Благодарности

Мы благодарим Е. Massicotte и Дж Господа за квалифицированной технической помощи во время цитометрии потока и экспериментов сортировки клеток. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить сотрудников IRCM клиника и всех доноров за предоставление образцов крови. Периферийные образцы крови были получены от здоровых взрослых доноров, которые дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией по протоколам исследований, утвержденных по этике обзора совета Института де Recherches Cliniques Монреаля (IRCM). Следующие реагенты были получены через программу НИЗ СПИД реагента, Отдел СПИДа, NIAID, NIH: MT4 клеток от доктора Дугласа Рихман; и человека RIL-2 от доктора Мориса Гейтли, Hoffmann - La Roche Inc.

Доктор Коэн получатель Канада заведующая кафедрой в человеческий ретровирусологии. Эта работа была поддержана грантами от CIHR (CIHR 111226) к доктору Коэну и с Fonds де Recherche дю Квебек-Santé (Frq-S) сети на СПИД доктора Bego и д-р Коэн.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки MT4	NIH AIDS Reagent Program	120	Этот реагент был получен в рамках программы NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 от доктора Дугласа Ричмана.
HEK-Blu ИФН-α/β репортерные ячейки	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	Wisent	350-000-CL
DMEM	Wisent	319-005-CL
FBS	Wisent	080-150
Ficoll-Pâ que Plus	Myltenyi	17-1440-03
Набор для выделения CD4+ Т-клеток II	Myltenyi	130-091-155
Набор для выделения дендритных клеток алмазной плазмоцитоидной плазмоцитоидной клетки II	Мылтени	130-097-240
PHA-L	Сигма-Олдрич	O2769
Human rIL-2	NIH AIDS Reagent Program	136	Этот реагент был получен в рамках программы NIH AIDS Reagent, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 от доктора Мориса Гейтли, Hoffmann - La Roche Inc.
Имиквимод	Инвивоген	TLRL-IMQS
ODN 2216 CpG-A	Hycult Biotec	HC4037
Человеческий ИФН&альфа;	ПБЛ источник интерферона	11100-1
QUANTI-Blue	Cedarlane	REP-QB2
Проточная цитометрия (антитела/реагенты)
Раствор для блокировки Fc (состав ниже):			Примечание: сделать в растворе для стирки (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)
10% сыворотка от козы	Sigma-Aldrich	G 9023
10% Сыворотка кролика	Sigma-Aldrich	R 9133
10% Сыворотка для мышей	Sigma-Aldrich	M 5909
2,5 мг/мл IgG человека	Sigma-Aldrich	I 4506
анти-CD3_Pacific Blue	Biolegend	300417
anti-CD14_PE-TxRed	Life Technologie	MHCD1417
анти-BDCA2_APC	Мылтеньи	130-090-905
anti-ILT7_PE	Biolegend	326408
anti-CD4_PerCP/Cy5.5	Biolegend	317427
anti-BST2_Alexa 660	eBioscience	50-3179
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	6148
Сетчатый фильтр	BD Falcon	352340
Прибор Cyan ADP	Бекман Коултер	CY20030

Ссылки

Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells in immunity. Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).
Lepelley, A., et al. Innate sensing of HIV-infected cells. PLoS pathogens. 7, e1001284(2011).
Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299(2013).
Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024(2015).