Измерение изменений в тактильной чувствительности в задней лапы мышей с использованием устройства Электронные фон Фрея

Краткое содержание

Электронные измерения фон Фрея являются эффективной и улучшенной альтернативой классическим нитям фон Фрея, поскольку они позволяют быстро и точно измерять изменения механических порогов отхода грызунов, реагирующих на непрерывно применяемые раздражители до и после воспалительного события.

Аннотация

Измерение воспаления, вызванной изменения в порогах задней лапы выхода из механического давления является полезным методом для оценки изменений в восприятии боли у грызунов. Пороги Снятие может быть измерена первая в начале исследования, а затем следующие наркотиков, яд, травмы, аллерген, или иным образом Вызванные воспаление, применяя точный силы на очень специфических областях кожи. Электронная аппаратура фон Фрея позволяет точную оценку мыши задних порогов отдергивания лапы, которые не ограничены доступных размеров накаливания в отличие от классических измерений фон Фрея. Легкость и быстрота измерений позволяют для включения оценки тактильных результатов чувствительности в разнообразных моделей быстрым началом воспалительного и невропатической боли, как многократные измерения может быть принято в течение короткого периода времени. Экспериментальные измерения для отдельных субъектов грызунов можно внутренне контролируется против отдельных исходных ответов и критериев исключения легкосоздана для стандартизации исходных ответов внутри и между экспериментальными группами. Таким образом, измерения с использованием электронного устройства фон Фрея представляют полезную модификацию хорошо известных классических накаливания на основе анализов фон Фрея для грызунов механической аллодинии, которые также могут быть применены к другим нечеловеческих млекопитающих моделей.

Введение

Хронические неинфекционные заболевания ответственны за непропорционально большую долю бремени смертности и заболеваемости человека¹. Хроническая боль все чаще признается в качестве важного компонента глобального бремени болезней². Это дало большой толчок инновациям в области профилактики, контроля и лечения боли. В то же время существует множество доказательств того, что биология, лежащая в основе боли^{, является сложной} 3. Механизмы, лежащие в основе защитной, а также дезадаптивной и хронической боли, указывают на сложное взаимодействие между иммунной и нервной системами^3,4. Выяснение этих механизмов требует строгих количественных, воспроизводимых экспериментальных подходов от молекулярного препарирования до поведенческого анализа.

Модели грызунов оказали неоценимое влияние на характеристику молекулярных участников воспалительной и нейропатической боли⁵. Сокращение времени и интенсивности ранее определенных реакций на вредные стимулы используется для измерения болевых состояний у этих животных, поскольку в противном случае грызуны не могут сообщить об ощущении^боли. Измененные реакции на температуру и давление обычно используются в качестве показателей чувствительности тканей в моделях воспалительной ноцицепции у грызунов, которая может быть вызвана инфекцией^7,8, химическим^{воздействием 6, 9,10}, хирургическим разрезом¹¹, а также нейропатической болью, вызванной перевязкой нерва¹².

Механическая чувствительность, или реакция на раздражители давления, часто измеряется с помощью классических нитей фон Фрея (CvF) - серии (например, 0,4-15 г¹³) взвешенных наконечников, вручную наносимых на тестовую ткань последовательными шагами до тех пор, пока не будет вызвано болевое поведение у контрольной группы по сравнению с экспериментальными субъектами. Существуют различные методы использования этих наконечников или волосков для оценки механической чувствительности^6,13; Наиболее часто используемый метод заключается в следующем. Наконечник с определенным давлением (в серии; (например, 2 g¹³) выбирают в качестве отправной точки, а 50%-ный порог изъятия у крысы или мыши (интенсивность стимула, необходимая для возникновения ответной реакции в 50% случаев, когда кончик прикладывается к ткани) определяют путем перемещения вверх и вниз по весу кончика на основе отображения ранее заданного поведения реакции¹³. Затем сравниваются абсолютные 50% пороги отмены для групп лечения между исходным уровнем и временными точками после лечения. Эта ручная техника довольно трудоемка. В дополнение к увеличению времени, проводимого каждым испытуемым в камере фон Фрея, это также увеличивает количество раз, когда тестовые наконечники различной степени тяжести наносятся на воспаленные ткани, вызывая больший дискомфорт у грызунов в исследовании. Кроме того, рассчитываются 50% пороги абстиненции и сравниваются между группами грызунов; Индивидуальные реакции испытуемых, как правило, не нормализованы по отношению к их индивидуальным необработанным базовым реакциям, за^{одним исключением}, насколько нам известно. Как следствие, субъекты из грызунов обычно не классифицируются как распределенные по группам лечения на основе последовательных исходных ответов в ранее определенном диапазоне, а отдельные субъекты также не оцениваются на основе последовательно применяемого набора критериев исключения, которые позволяют стандартизировать исходные ответы для любого конкретного набора исследований и анализов.

Здесь мы представляем альтернативный метод измерения тактильной чувствительности задней лапы мыши после воздействия яда Bothrops jararaca с помощью электронного аппарата фон Фрея (EvF). Кунья и коллеги⁶ стали пионерами в использовании методов EvF на грызунах и систематически сравнивали эффективность CvF и EvF, чтобы продемонстрировать, что EvF обеспечивает «более чувствительную, объективную и количественную» меру тактильной чувствительности в моделях воспалительной боли у грызунов. Вкратце, при измерениях EvF негигроскопичный полипропиленовый наконечник фон Фрея одинакового диаметра (0,8 мм) подходящей жесткости для испытуемой ткани прикрепляется к электронному зонду и считывает, отображая силу/вес, с которой грызун втягивается от наконечника. Существует несколько важных различий между измерениями CvF и EvF. Во-первых, процесс измерения как исходных, так и экспериментальных реакций с использованием EvF значительно упрощается, поскольку давление на заднюю лапу может быть приложено с возрастающей силой до тех пор, пока не произойдет реакция и нет необходимости менять кончики, как при CvF; Животные проводят меньше времени взаперти в пробирных камерах и, следовательно, испытывают меньший стресс и более комфортные условия во время эксперимента. Во-вторых, EvF позволяет относительно легко реализовать критерии рационального исключения для испытуемых в виде диапазонов допустимых исходных пороговых значений. Это позволяет стандартизировать исходные ответы внутри и между группами лечения. В-третьих, реакция субъекта после экспериментального лечения всегда сравнивается с его индивидуальной исходной реакцией, что создает важный внутренний контроль для измерений. В-четвертых, точность порогов изъятия регистрируется на более высоком уровне разрешения, поскольку давление может прикладываться непрерывно, а не с приращениями, доступными в виде весов ручных нитей. Как и в случае с хорошо спроектированными анализами CvF, эксперименты на основе EvF также проводятся с одним и тем же исследователем (слепым к лечению), который применяет силу и записывает поведение реакции. Важно отметить, что этот метод требует времени и усилий со стороны исследователей для установления внутренней согласованности измерений и требует планирования экспериментов таким образом, чтобы были сделаны соответствующие поправки на мышей, которые, возможно, придется исключить из-за несогласованных исходных ответов.

Простая в реализации, эффективная, хорошо контролируемая оценка механической чувствительности облегчает добавление поведенческой оценки к моделям воспалительных событий, таких как отравление - пример, который мы использовали здесь, чтобы проиллюстрировать возможности и силу измерений EvF в измерении изменений тактильной чувствительности. Мы обнаружили, что самцы швейцарских мышей ND4 показали повышенную механическую чувствительность после введения яда южноамериканской гадюки Bothrops jararaca в заднюю лапу. Поведенческие реакции сопровождались отеком, притоком нейтрофилов и дегрануляцией тучных клеток в пораженной ткани.

Протокол

Комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) колледжа Макалестер утвердил все протоколы. Для этих экспериментов использовались 8-12-недельные самцы швейцарских мышей ND4

.

1. Приготовление и инъекции яда Bothrops jararaca

1. ВНИМАНИЕ: Яд B. jararaca токсичен. Надевайте перчатки, маску и средства защиты глаз при работе с порошком и приготовлении растворов.
2. Вводите 45 мкг/кг яда B. jararaca (схема, определенная по более ранним экспериментам «доза-ответ») или 0,9% физиологического раствора (10 мкл) путем внутриподошвенной инъекции в обе задние лапы с использованием инсулиновых шприцев по 3/10 мл с концентрацией 29 г x 1/2 в иглах. Примечание: В зависимости от плана эксперимента, лечебные и контрольные растворы могут вводиться отдельно в каждую заднюю лапу соответственно для обеспечения внутреннего контроля у каждого субъекта.

2. Настройка и эксплуатация электронного аппарата фон Фрея

1. Поместите электронный блок фон Фрея на подставку для зонда. Убедитесь, что щуп и кабель правильно подключены к дисплею, и включите прибор. Установите индикацию на ноль (0,00 г) в режиме настройки и аккуратно поместите предоставленный тестовый груз (5,00 г) на конус датчика фон Фрея.
2. Запишите показания в лабораторный блокнот и повторите эту процедуру по окончании сеанса тестирования. Если разница между показаниями контрольного груза до и после сеанса тестирования превышает 0,20 г, или если показания колеблются после нанесения контрольного груза, может потребоваться повторная калибровка устройства (производителем).
3. Для оценки порога отвода задней лапы мыши используйте соответствующий полипропиленовый наконечник из числа тех, что поставляются в комплекте с зондом. Выбор наконечника зависит от исследуемой ткани. Жесткие кончики хорошо подходят для менее чувствительной и жесткой ткани задней лапы, в то время как полугибкие кончики могут быть лучшим выбором для более нежной области, такой как аногенитальный гребень (Chatterjea, не опубликовано). Аккуратно установите жесткий наконечник на конус щупа.
4. Чтобы записать максимальное приложенное давление, переключите режим работы с настройки на режим работы таким образом, чтобы максимальное приложенное давление было зарегистрировано на дисплее. В этом режиме показания максимального приложенного давления будут сохраняться на экране дисплея при втягивании зонда.

3. Общие соображения по оценке порога отвода задней лапы

1. В идеале для измерения порога отведения задней лапы (механической чувствительности) с помощью прибора EvF необходимы два исследователя - один для работы с аппаратом и проведения измерений, а другой для расшифровки записанных измерений и работы с мышами.
2. Чтобы уменьшить систематическую ошибку, исследователь, работающий с аппаратом, должен быть слеп к лечению и зарегистрированным значениям порога отмены. Кроме того, чтобы обеспечить согласованность между измерениями, один и тот же человек должен оценить все исходные и экспериментальные пороги отмены.
3. Выполняйте все измерения в тихом помещении с контролируемой температурой, и в одно и то же время^{дня 14}.
4. Экспериментатор, записывающий измерения, должен поместить каждую мышь в отдельные камеры с многокомпонентным корпусом из полиметилметакрилата (ПММА), установленным на сетчатой подставке для пола. Накройте камеры перфорированными крышками из ПММА, а сверху положите тяжелый предмет, чтобы мыши не смогли сбежать. Поместите абсорбирующий материал под подставку для поглощения/сбора выделяемых отходов. Дайте мышам акклиматизироваться в течение 15 минут в камерах до исходной или экспериментальной оценки порога выведения ^6,7,10.
5. Задние лапы мышей должны быть легко доступны через отверстия сетчатого пола, поэтому размещайте сетчатый пол на удобной высоте на тележке с тормозами или на устойчивой скамейке, доступной со всех сторон.
6. Во время измерений мышей может потребоваться отвлечь с помощью пищевой гранулы¹⁵, расположенной непосредственно за измерительной камерой, или очень слабого шума, производимого постукиванием или проведением загоном по проволочной сетке пола камеры до, но не во время измерения. Это заставляет мышь оставаться неподвижной, что облегчает экспериментатору начало измерения.

4. Базовая оценка порога отвода задней лапы

1. Первый набор исходных измерений должен быть выполнен за 48 часов до начала лечения. Обнулите щуп после установки жесткого наконечника. Двумя руками медленно поднимите зонд, чтобы стимулировать середину (область подушечки лапы) левой или правой задней лапы (если обе лапы подвергались одинаковому лечению).
2. Постепенно увеличивайте давление до тех пор, пока не будут наблюдаться определенные ноцицептивные реакции, такие как втягивание задней лапы, облизывание задней лапы или прыжки с четырьмя лапами^6,10. Поручите другому исследователю расшифровать давление, вызвавшее наблюдаемое поведение.
3. Измерьте порог отвода мыши, расположенной в соседней камере. Продолжайте до тех пор, пока не оцените пороги вывода каждой мыши по одному разу. Повторите еще четыре раза, чтобы каждая мышь была измерена в 5 раз, как описано^{ранее 10}.
4. Для каждой мыши вычислите медианное значение 5 измерений, а затем вычислите, насколько каждое значение отклоняется от медианы. Выберите 3 значения, которые отклоняются наименьшим образом, и усредните их, чтобы получить базовый порог снятия средств, как описано ранее¹⁰. В этой демонстрации измерения были стандартизированы с использованием 3 из 5 значений; Несмотря на то, что конкретное количество измерений может варьироваться в зависимости от плана эксперимента, важно убедиться, что все мыши были пронуты одинаковое количество раз для оценки исходных показателей.
5. Повторите исходные измерения через 24 часа. Сделайте 5 измерений для каждой мыши и усредните 3 измерения, которые ближе всего к медиане, чтобы получить базовый порог вывода.
6. Чтобы рассчитать средний исходный порог абстиненции мыши, усредните ее исходные пороги абстиненции, измеренные за 48 и 24 часа до лечения. Если средний исходный порог абстиненции ниже 3,50 г или если два исходных порога отличаются на 2,00 г или более, исключите мышь из эксперимента. Эти критерии гарантируют, что все мыши в эксперименте имеют стабильные исходные ответы и достаточно высокие исходные пороги отмены, которые позволяют наблюдать более низкие пороги после лечения.
7. Примечание: Порог исключения будет зависеть от исследуемой ткани, штамма изучаемых животных и типа используемого наконечника. Например, мы обнаружили, что 3,5 г является полезным ориентиром для ткани задних лап ND4, но более чувствительные участки, такие как аногенитальный гребень, требуют более низкого порога исключения (Chatterjea, не опубликовано).
8. Распределите мышей по группам лечения таким образом, чтобы средний исходный уровень выбывания, полученный в экспериментальных группах, был как можно более схожим до начала лечения.

Примечание: Базовые измерения могут быть выполнены за 48 часов до эксперимента. Тем не менее, следует провести не менее 2 серий исходных измерений через равные промежутки времени до начала лечения.

5. Экспериментальная оценка порога отвода задней лапы

1. Оцените порог отведения задней лапы (механическую чувствительность) после лечения в соответствующие моменты времени, определенные планом эксперимента. Возвращайте мышей в клетки с доступом к пище и воде сразу после завершения измерений.
2. Следуйте шагам, описанным выше; сделайте 3 вместо 5 измерений, чтобы уменьшить вероятность чрезмерной стимуляции (обработанной) ткани задней лапы, особенно если чувствительность должна оцениваться в несколько временных точек. Если любые два измерения из трех отличаются более чем на 2,00 g, выполните четвертое измерение.
3. Вычислите среднее значение 3 измерений, чтобы получить экспериментальный порог вывода для каждой мыши. Для любых мышей, для которых было проведено 4 измерения, вычислите среднее значение трех, которые меньше всего отклоняются от медианы, чтобы получить экспериментальный порог отмены.
4. Чтобы получить дельта-порог вывода для каждой мыши в определенный момент времени, вычтите базовый уровень из экспериментального порога вывода. Повторите для всех мышей и всех экспериментальных временных точек⁹.
5. Проведение соответствующего статистического анализа собранных данных. Здесь мы использовали JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) для проведения одностороннего анализа ANOVA и Tukey HSD.

Результаты

Локальное введение яда B. jararaca вызывает изменения тактильной чувствительности задней лапы и отек тканей у самцов мышей линии ND4 Swiss.

Через 1,5 ч после введения 45 µg/kg яда B. jararaca самцы мышей линии ND4 Swiss отдергивали задние лапы при давлении на 3,0 g ниже базового уровня (Figure 1A). Базовый порог отдергивания для всех групп составлял ~4,5 g приложенного давления; после воздействия яда подопытные мыши отдергивали задние лапы при давлении 1-1,5 g (данные не представлены). У контрольных мышей, получавших физиологический раствор, практически не наблюдалось снижения реакции на давление по сравнению с базовым уровнем во всех исследованных временных точках. Снижение порогов реакции у treated-мышей отчетливо сохранялось через 3 и 6 ч после введения яда (Figure 1B) и стало неотличимым от контрольной группы к 24 ч (данные не представлены). На задних лапах мышей после введения яда наблюдался отек тканей, характерный для воспаления. Через 1,5 ч после введения яда толщина задних лап treated-группы, измеренная согласно ранее описанному методу¹⁰, была на 1,5 mm больше, чем при базовом уровне; отек сохранялся в течение 3 и 6 ч (Figure 1B). Напротив, на лапах, которым вводили физиологический раствор, не наблюдалось ни припухлости, ни изменения толщины на протяжении всего периода эксперимента. В представленном репрезентативном эксперименте для базовых измерений было использовано в общей сложности 21 мышь, из которых 14 были отобраны для включения в опыт. Они были распределены по группам лечения таким образом, чтобы средние показатели реакции отдергивания на базовом уровне составляли около 4,5 g для каждой группы в целом.

Изменения тактильной чувствительности, вызванные ядом B. jararaca, сопровождаются дегрануляцией тучных клеток и притоком нейтрофилов в задние лапы самцов мышей линии ND4 Swiss.

Помимо повышенной тактильной чувствительности и отека тканей, мы также оценивали приток нейтрофилов (Рисунки 2A-B) и дегрануляцию тучных клеток (Рисунки 2C-D) в задних лапах мышей, подвергшихся воздействию яда, по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Нейтрофилы являются первыми воспалительными клетками, привлекаемыми из кровотока в очаг поражения, и, как известно, опосредуют воспалительные ноцицептивные реакции^10,16,17. Тучные клетки представляют собой резидентные в тканях клетки-сентинели¹⁸, а их дегрануляция была связана с ноцицептивными реакциями в задней лапе мышей¹⁰ и твердой мозговой оболочке крыс¹⁹.

В данном исследовании мы обнаружили, что приток нейтрофилов в задние лапы после введения яда увеличился почти в 1 000 раз по сравнению с лапами, обработанными физиологическим раствором (Рисунок 3A), что было определено путем подсчета клеток в сагиттальных срезах тканей подошвы толщиной 4 µm, залитых в парафин и окрашенных гематоксилином и эозином¹⁰, которые были получены от эвтаназированных мышей через 1,5 ч после введения яда.

В лапах, обработанных физиологическим раствором, подошвенные тучные клетки тканей задней лапы были в основном сохранны или проявляли признаки слабой дегрануляции (Рисунок 3B). Напротив, в задних лапах после введения яда наблюдалась умеренная и выраженная дегрануляция 15-20% тучных клеток (Рисунок 3B). Описанные выше срезы тканей окрашивали толуидиновым синим, а количество видимых гранул в каждой тучной клетке подсчитывали для определения статуса дегрануляции, как было описано ранее¹⁰.

Рисунок 1. Местное введение яда B. jararaca вызывает изменения механической чувствительности задней лапы и отек тканей у самцов мышей линии ND4 Swiss. Исходные пороги отдергивания и исходная ширина лапы оценивались за 48 и 24 ч до интраплантарного введения яда B. jararaca (Bjv; 45 µg/kg) или плацебо (физиологический раствор) (10 µl). Пороги отдергивания оценивались через 1.5, 3 и 6 ч после обработки (A). Средняя ширина лапы (средняя ширина левой и правой лапы мыши) в срединной подошвенной области оценивалась с помощью цифрового штангенциркуля в исходном состоянии, а затем через 1.5, 3 и 6 ч после обработки для определения отека тканей, как было описано ранее¹⁰ (B). Значимость определялась по сравнению с мышами, получавшими Sal (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 соответственно). n = 10-11 мышей в каждой группе обработки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в большем размере.

Рисунок 2. Индуцированная ядом B. jararaca механическая чувствительность сопровождается дегрануляцией тучных клеток и притоком нейтрофилов в задние лапы самцов мышей линии ND4 Swiss. 3 мыши на каждую группу лечения были подвергнуты эвтаназии с помощью CO₂ через 1,5 ч после обработки , их задние лапы были иссечены, хранились в 10% формалине в течение 24 ч, затем перенесены в 70% этанол, декальцинированы в течение 1–2 недель в 15% EDTA и залиты в парафин. Сагиттальные срезы толщиной 4 µm были окрашены гематоксилином и эозином (A-B) и толуидиновым синим (C-D) для визуализации нейтрофилов (A-B) и тучных клеток (C-D) соответственно. Изображения были получены при 400X и 1,000X, как указано на рисунке. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение в более крупном размере. 

Рисунок 3. Механическая чувствительность, индуцированная ядом B. jararaca, сопровождается значительным увеличением уровней дегрануляции тучных клеток и притока нейтрофилов в задние лапы самцов мышей линии ND4 Swiss. Нейтрофилы и тучные клетки на окрашенных срезах тканей подсчитывали с помощью микроскопа Olympus CX21LED. Нейтрофилы подсчитывали в 3 задних лапах на каждую группу обработки от пятки до пальцев в соседних полях зрения при увеличении 400X (A). Тучные клетки подсчитывали в 3 подушечках лап на группу обработки, и степень их дегрануляции оценивали по количеству видимых гранул вне границ клетки: интактные (0), слабая (0-10), умеренная (10-20), выраженная (21+), как было описано ранее¹⁰ (B).  Чтобы избежать повторного подсчета одних и тех же клеток, исследователи, оценивавшие количество нейтрофилов и уровни дегрануляции тучных клеток в срезах задних лап, использовали сетку, нанесенную на окулярную сетку. Исследователи не знали, какая обработка применялась к животнымs. Статистическая значимость определена по сравнению с мышами, получавшими Sal (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 соответственно). n = 3 мыши в каждой группе обработки.  Нажмите здесь, чтобы посмотреть изображение в большем размере.

Обсуждение

Измерение изменений в реакциях отмены является важным инструментом, используемым для оценки изменений тактильной чувствительности в моделях боли и воспаления у грызунов. Здесь мы демонстрируем полезность электронного аппарата фон Фрея для выполнения этой оценки. У этого метода есть несколько преимуществ: 1) мы можем быстро оценить реакцию отмены на приложенное давление у нескольких мышей в нескольких временных точках, которые находятся довольно близко друг к другу, 2) мы можем использовать один наконечник для приложения непрерывного и специфического давления к небольшому участку ткани, 3) мы можем точно измерить точное давление, приложенное для получения реакции отмены, и iv) мы можем легко внедрить надежные базовые пороговые значения, критерии исключения и внутренний контроль, чтобы гарантировать, что поведенческие оценки являются как можно более точными и объективными.

Важнейшими шагами для обеспечения наилучших результатов анализа EvF являются предварительная калибровка прибора и последовательные методы измерения. Как подробно описано в разделе протокола, с прибором необходимо обращаться бережно, а до и во время использования обеспечить надлежащую калибровку. Перед проведением каких-либо измерений необходимо подтвердить показания испытательного груза, чтобы обеспечить оптимальную работу машины. Если показания значительно колеблются или если показания испытательного груза неточны, следует незамедлительно связаться с производителем для калибровки устройства. Учитывая это, по возможности рекомендуется иметь резервный электронный аппарат фон Фрея, чтобы не ставить под угрозу чувствительные ко времени эксперименты из-за неожиданной необходимости калибровки прибора. Кроме того, один, хорошо обученный исследователь должен провести все исходные и экспериментальные измерения для данного исследования или серии экспериментов, оставаясь при этом слепым к группам лечения. Мышей следует оценивать в тихой комнате, при постоянной температуре, акклиматизировать в камерах EvF в течение не менее 15 минут, но не удерживать в камере дольше, чем это необходимо (особенно если несколько измерений проводится в течение одного дня), чтобы свести к минимуму изменения в поведении, вызванные стрессом и дискомфортом.

Измерения EvF обеспечивают значительные улучшения по сравнению с существующими методами CvF. Исследователи могут оказывать постоянное давление и не должны переключаться между наконечниками разного веса, как это делается в экспериментах с нитью CvF⁶. Это приводит к меньшему количеству тычков в ткани, что особенно актуально в случае воспаленных или травмированных тканей. Точное давление, при котором происходит отбор, может быть измерено по сравнению с использованием 50% измерений отбора, которые также ограничены доступной массой нити, используемой при измерениях CvF¹³. Поскольку могут быть реализованы рациональные и единые критерии исключения (как обсуждалось выше), мыши могут быть распределены по экспериментальным группам таким образом, чтобы все группы имели одинаковые средние исходные уровни в начале эксперимента. Измерения EvF оценивают изменения в поведенческой реакции на данный стимул, а не сами абсолютные реакции. Таким образом, изменение ноцицептивного ответа у каждой мыши измеряется как разница между ее индивидуальным, экспериментальным и исходным уровнем изъятия, что обеспечивает внутренний контроль для каждого проведенного измерения.

Возможно, наиболее существенным ограничением EvF является то, что, как и его ручной аналог, один и тот же исследователь должен проводить все измерения для определенной серии исходных и экспериментальных измерений. Это делает масштабирование техники сложной задачей с точки зрения времени, персонала и оборудования. Мы обнаружили, что ~20 мышей за один раз (в зависимости от конфигурации пробирных камер) могут быть измерены за 30-45 минут или меньше в нескольких временных точках при условии, что между измерениями проходит не менее 45 минут. В связи с этим следует учитывать кривую обучения отдельных экспериментаторов. Внутренняя согласованность должна быть установлена до того, как отдельный исследователь сможет приступить к полномасштабному эксперименту, а это требует многих часов целенаправленной практики, включающей повторные измерения исходного отклика до тех пор, пока не будет достигнута желаемая согласованность. Кроме того, использование базовых пороговых значений подразумевает, что не все мыши, подлежащие базовому уровню для эксперимента, могут быть включены; Мы обнаружили, что 25-30% мышей, обследованных в эксперименте, обычно исключаются.

С точки зрения модификаций и будущих применений, поведенческие измерения EvF добавляют мощное измерение к широкому спектру моделей воспаления для анализа сопутствующей острой и/или хронической боли, которая может лежать в основе воспалительных патологий. При отравлении мы обнаружили, что выраженные, быстро происходящие изменения тактильной чувствительности сопровождались ожидаемыми исходами отека тканей, пополнения лейкоцитов и дегрануляции тучных клеток в задних лапах самцов мышей ND4. Эти результаты подтверждают предыдущие наблюдения о вкладе медиаторов тучных клеток в тепловую чувствительность у крыс²⁰ и механическую чувствительность, индуцированную ядом B. jararaca у швейцарских мышей ND4, измеренных с использованием CvF²¹. Протокол EvF может быть легко модифицирован для использования на тканях, отличных от задней лапы , например, на брюшной полости⁷ и аногенитальном гребне⁸ , где в настоящее время используется CvF. Модели аллергии, заживления ран, невропатии и других патологий на грызунах могут быть легко адаптированы для включения измерений механической чувствительности в тканях, включая заднюю лапу и за ее пределами.

Таким образом, EvF является полезным и эффективным методом, который обновляет классический подход к измерению ноцицепции у грызунов и является важным новым инструментом в исследовании сложных основных механизмов боли в широком спектре моделей заболеваний.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Швейцарские мыши-самцы ND4	Harlan	0-32	используемые здесь, были в возрасте 8-12 недель и содержались и использовались в соответствии с рекомендациями IACUC колледжа Макалетер.
3 мл/100 Инсулиновый шприц с 29 г 1/2 в игле	BD	BD309301	После каждого использования утилизируйте в соответствующую емкость.
B. jararaca ядовитый яд	Sigma	V5625	ВНИМАНИЕ: Токсичное вещество. Надевайте средства защиты для глаз и кожи. Растворить в стерильном 0,9% физрастворе.
Электронный аппарат фон Фрея; зонд = 90 g диапазон	IITC	2394	Двигайтесь осторожно и следите за тем, чтобы он всегда находился горизонтально. Для обнуления щупа нажмите «Программа» и «Очистить». Для переключения из режима настройки в рабочий нажмите "Function" (для индикации "MH") или "MAX".
Сетчатая подставка + камеры из ПММА	IITC	410	Поместите на устойчивую столешницу или тележку с четырьмя колесами для доступа со всех сторон.
Только электронные жесткие наконечники фон Фрея, диапазон 90 г	IITC	2390	н/д

,