Цитотоксическая Эффективность фотодинамической терапии в клетках остеосаркомы<em&gt; Экстракорпоральное</em

Краткое содержание

Протокол сообщил здесь позволяет оценка эффективности фотодинамической терапии (PDT) в клеточных линиях и оптимизации настроек PDT перед нанесением терапии на животных моделях.

Аннотация

В последние годы наблюдается трудность в нахождении более эффективные терапии против рака с меньшим количеством системных побочных эффектов. Поэтому фотодинамическая терапия является подход роман для более опухоли селективной очистки.

Фотодинамическая терапия (PDT), что делает использование нетоксичного фотосенсибилизатора (PS), который, при активации светом определенной длины волны в присутствии кислорода, генерирует радикалы кислорода, которые вызывают цитотоксический ответ ^1. Несмотря на утверждения почти двадцать лет назад FDA, PDT ныне используется только для лечения ограниченное количество типов рака (кожи, мочевого пузыря) и nononcological заболеваний (псориаз, старческий кератоз) ^2.

Основное преимущество использования ФДТ является возможность выполнить местное лечение, которое предотвращает системные побочные эффекты. Кроме того, она позволяет лечение опухолей в деликатных участках (например вокруг нервов или кровеносных сосудов). Здесь intraoperatПриложение ив ФДТ рассматривается в остеосаркома (ОС), опухоль кости, целевой первичных спутников опухолевые остались в опухоли окружающие ткани после хирургического удаления опухоли. Лечение направлено на уменьшение количества рецидивов и на снижение риска для (послеоперационном) метастазов.

В настоящем исследовании мы представляем в пробирке процедуры PDT установить оптимальные настройки PDT для эффективного лечения широко используемых клеточных линий ОС, которые используются для воспроизведения заболевания человека в хорошо зарекомендовавших себя intratibial моделей ОС мыши. Поглощение ПС mTHPC был рассмотрен с помощью спектрофотометра и фототоксичность был спровоцирован лазерным светом возбуждения mTHPC на 652 нм, чтобы вызвать гибель клеток оценена с WST-1 анализа и подсчета выживших клеток. Установленные методы позволяют определить оптимальные настройки PDT для будущих исследований на животных моделях. Они легко и быстро инструментом для оценки эффективности PDT в естественных условиях.

Введение

Сегодняшнее состояние лечения искусства остеосаркомы (ОС), первичная опухоль кости, охватывает комбинацию нео адъювантной химиотерапии и хирургии. Это схема лечения выявлено увеличение выживаемости пациентов с локализованным заболеванием от примерно 20% до использования химиотерапии, чтобы в настоящее время между 60-70% ^{3, 4.} Тем не менее, в последние два десятилетия, общая выживаемость больных ОС с местным заболевания плато ^{4, 5.} Кроме того, 30-40% этих пациентов рецидив в течение 3 лет после постановки диагноза и пациентов с метастазами по-прежнему имеют плохую выживание 20-30% ^{4, 6, 7.} Чтобы улучшить результат этих пациентов, новые терапевтические стратегии должны быть разработаны.

Фотодинамическая терапия (PDT), а роман противоопухолевая терапия, использует свет определенной длины волны для возбуждения PhotosensiТизер (PS), который накапливается в опухолевых клетках после его инъекции в кровоток. Лазерный свет возбуждения генерирует PS кислородных радикалов в присутствии кислорода, которые вызывают цитотоксическую реакцию в опухолевых клеток и гибели клеток. Кроме этого основного механизма, два дополнительных PDT вызвали биологические процессы способствовать уменьшению роста опухоли: PDT вызывает сужение сосудов и образование тромбов в микроциркуляторном опухоли и, следовательно местные гипоксию и аноксию внутри опухоли, что приводит к опухоли миокарда. Наконец, PDT ранены и умирают клетки опухоли вызвать локальный иммунный ответ, довольно уникальную особенность PDT. Это включает в себя систему комплемента и активацию антиген-представляющих дендритных клеток ^8. Таким образом, создаются условия для презентации опухолевых антигенов с последующей активацией лимфоидных клеток, что приводит к опухоли специфического иммунитета.

До сих пор, PDT был использован для лечения нескольких типов опухолей мягких тканей и hyperplАзии, таких как светочувствительный кератоз, пищевода Барретта, эндобронхиальных опухолей, рака мочевого пузыря, рака базальных клеток, и паллиативного лечения рака головы и шеи ^2. Лечение, как известно, индуцируют некроз, местный крупномасштабное с только небольшими побочными эффектами, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы выборочно искоренить опухолевой ткани. Несмотря на эти преимущества, применение ФДТ остается технически более сложным, чем введения химиотерапевтических препаратов. Для достижения максимальной эффективности, концентрацию PS, время воздействия света и общую передачу световой энергии должны быть оптимизированы. Это может быть сделано в естественных экспериментов в, но, из-за относительного большого числа параметров, которые должны быть оптимизированы, он является более эффективным для первоначально определить оптимальные условия в пробирке.

В экспериментах, описанных ниже, мы протестировали эффективность в пробирке ФДТ с использованием PS 5,10,15,20-тетракис (мета-гидроксифенил) CHLОрин, сокращенно mTHPC (рис. 1А). mTHPC является действующим веществом в лекарственного средства Foscan, который в настоящее время используется в клинике для паллиативного лечения рака головы и шеи. Это один из самых мощных ПС, вызывая массовые повреждения клеток уже при низких концентрациях, и было показано, что превосходит другой ПС с точки зрения проникновения в ткани ^{9, 10.} Его поглощения светового спектра (рис. 1В) показаны два выраженные пики, по одному 417 нм и второй на 652 нм, которые используются для тканевой локализации накопления PS и для индукции PDT, соответственно.

В настоящее время, липосомальный формулировка для mTHPC находится в стадии разработки. Здесь мы описываем процедуры количественной оценки поглощение этого липосомного препарата и выполнять PDT в две линии ОС клеток человека; низкую метастатического HOS и высокие метастатические клетки 143b. Некоторые из приведенных данных были сообщалось ранее ^11. Чтэ Описанный здесь подход позволяет изучать эффект метастатического фенотипа на PDT эффективности. 143B клетки, ортотопически вводится в задних конечностей иммунодефицитных SCID мышей вызвать intratibial метастазирования первичной опухоли, модель тесно имитируя человеческую болезнь метастазирования. Таким образом, эксперименты, предложенные в пробирке прекрасно подходят для оценки оптимальные настройки PDT быть позже использованы в естественных экспериментов в.

Протокол

1. Сравнение поглощения mTHPC в соответствующих Лоу и высокой метастатической поиска предметов и 143B ОС клеточных линий

1. Подготовить среду для культивирования клеток, содержащей DMEM, ветчина F12 и тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки в соотношении 4.5:4.5:1.
   Примечание: липосомной форме ПС mTHPC растворяли в воде при конечной концентрации 1,5 мг / мл mTHPC.
2. Пластина 0,2 × 10 ⁶ HOS и 143b клеток / лунку в 6-луночных планшетах (трех повторах для каждого условия), и пусть клетки придерживаться в течение ночи.
   Примечание: число должен быть отрегулирован на отдельные клеточные линии. Сплошности 80-90% является наиболее подходящим в момент эксперимента.
3. На следующий день, инкубировать клетки с фиксированной концентрации mTHPC в течение различных периодов времени (время зависимое поглощение), либо с увеличением концентраций mTHPC в течение фиксированного периода времени (в зависимости от дозы поглощения).
4. Инкубируйте клетки с mTHPC для конкретного времени рoints или концентрация mTHPC.
   Примечание: В этом исследовании, как HOS и клеточные линии 143b инкубировали с 0,6 мкг / мл для mTHPC 0, 2,5, 5 или 10 ч, или с 0, 0,6, 2,5 и 10 мкг / мл mTHPC в течение 5 час. Используемые периоды времени и дозировки могут изменяться в зависимости от клеточной линии, которая используется.
5. Помните всегда работать в темноте или в условиях приглушенного света, чтобы избежать прямого воздействия света клеток.
6. После инкубации клеток в указанных условиях, аспирации среды и промыть клетки три раза PBS. Затем отделить клетки с 0,5 мл трипсина / ЭДТА и считать клетки.
7. После отрыва, центрифуге клетки при 400 мкг в течение 5 мин, аспирации среды и ресуспендирования клеток в PBS до конечной концентрации 200000 клеток / мл.
8. Пипетка 100 мкл полученной суспензии клеток (т.е. 20000 клеток) в 96-луночный планшет и измеряют флуоресценцию этих клеток в флуоресцентном спектрофотометре. Установкас для флуоресцентных измерений mTHPC являются: 417 нм для возбуждения и 652 нм для излучения.
9. Для того чтобы вычислить количество интернализованной mTHPC на клетку, нормализуют относительно блока флуоресценции (RFU) на количество клеток и клеточного объема следующим образом:
10. Подготовка стандартную кривую с использованием различных концентраций mTHPC в ФБР от 0-4 мкг / мл (измерений использование трех экземплярах). Вносят по 100 мкл каждого разбавления в 96-луночный планшет и измеряют флуоресценцию в лунках с помощью параметров, описанных в шаге 1.6.
11. Разделите РФС (полученный на 20000 клеток) по наклону линейного стандартной кривой mTHPC, что дает концентрацию mTHPC (в мкг / мл) в скважине.
12. Разделите эту концентрацию mTHPC на 10, чтобы получить общее количество mTHPC в одной скважине (в мкг, что составляет 100 мкл клеточной суспензии) и разделить эту величину на объем 20 000 клеток.
13. Рассчитайте объем с формулой для сферы: (4/3 х π) хR ^3. Получение радиус г, измеряя диаметр 20 трипсином клетки под микроскопом, и деления этого значения на 2.
14. Наконец, нормализовать все значения с результатами, полученными для HOS клеток после 10 ч инкубации (дозозависимое поглощение) или обрабатывали 10 мкг / мл mTHPC (время зависимое поглощение), в котором были установлены на 100%.

2. Измерение фототоксичность PS в пробирке

1. Seed 3000 клеток / лунку в 96-луночный планшет (трех повторах для каждой концентрации использовали mTHPC) и позволить им следовать в течение ночи. Аналогично подготовить дополнительный пластину 96-а и лечить клетки, как описано ниже, но затем положить их в сторону для контрастного изображения фаз.
   Примечание: количество должно быть отрегулировано для каждого отдельного клеточной линии. Конфлюентности 50-60% во время эксперимента идеально подходит.
   1. Следует помнить, чтобы добавить соответствующее темное контроль токсичности клеток для каждой из концентраций mTHPC.себе являются клетки, которые будут инкубировали в отсутствие или в присутствии выбранных концентраций mTHPC, но не будут гореть.
2. На следующий день, инкубировать клетки с различными концентрациями mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, и 10 мкг / мл) в зависимости от клеточных линий и держать их в темноте в течение 5 часов.
   1. См. раздел 1.3.2
      Примечание: Время инкубации до освещенность зависит от клеточной линии и на ПС, используемого, поэтому желательно, чтобы проверить различные концентрации и различные моменты времени в отдельных экспериментах.
3. После инкубации в течение указанного периода времени, промыть клетки дважды PBS и добавить новый свежую среду без mTHPC.
4. Освещать клеток с диодного лазера 652 нм, удельной для спектра поглощения mTHPC (см. Рисунок 1).
   1. Установите лазер для 21,88 мВт / см ² степени на высоте 13,5 см DistaNCE из клеток, с тем чтобы получить энергетическую дозу 5 Дж / ​​см ^2. Освещать клетки для 230 сек. Не осветить темные клетки контроля токсичности (с и без mTHPC).
      Примечание: Всегда носите очки для защиты глаз от лазерного света, используемого для возбуждения PS.
5. После освещения, сохранить клетки в темноте при 37 º C в течение 24 часов. Впоследствии добавить водорастворимый тетразолия (WST-1) Реагент (10 мкл μl/100 среды).
6. Через три часа после добавления WST-1 реагентом, измеряют поглощение в отдельные лунки 96-луночного планшета при 415 нм.
7. Для того чтобы вычислить процент выживших клеток, установить среднее значение величин, полученных для не mTHPC обработанных клетках для каждого условия до 100% (то есть освещение, без mTHPC и nonilluminated, без mTHPC).

3. Оценка сотового телефона на сотовый Подсчет

1. Семенной 20000 клеток / мыLL в 24-луночный планшет, и пусть они придерживаются в течение ночи.
2. Инкубируйте клетки в течение 5 ч с mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, и 1,25 мкг / мл) и освещать их, как описано выше.
3. Сбор среды, промыть клетки один раз ЗФР, Trypsinize их и собирать их центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин.
4. После центрифугирования аспирации среды и ресуспендирования клеток в 200 мкл свежей среды.
5. Граф клеток в камере Нойбауэр.

Результаты

С здесь сообщенных методов, мы исследовали mTHPC основе PDT в клетках человека OS. Во-первых, время и зависит от дозы поглощение mTHPC была исследована в низком метастатическим поиска предметов и в высокоразвитых метастатических клеточных линий 143B ОС. Поглощение mTHPC может быть оценена путем измерения флуоресценции mTHPC с флуоресцентным спектрофотометром (рис. 2, воспроизведены с разрешения Reidy соавт. ^11). Фиг.2А иллюстрирует поглощение mTHPC в зависящей от вре...

Обсуждение

Для достижения оптимального цитотоксичность в ответ на PDT, очень важно выбрать правильные настройки лазерного света и времени инкубации. Описанных здесь процедуры соответствуют и эффективным для определения поглощения PS и количественно PDT индуцированной цитотоксичности в пробирке. Использование конкретных длин волн поглощения ПС mTHPC, клеточное поглощение PS может быть определена в прямом порядке, и PS может быть активирован для генерации цитотоксических активных форм кислорода.

...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	PAA GmbH, Фрайбург, Германия	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Фрайбург, Германия	E15-817
Термоинактивированная эмбриональная сыворотка	теленка GIBCO, Базель, Швейцария	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Йена, Германия		Поскольку эта липосомальная формула происходит от R& Каталожный номер D отсутствует в настоящее время. Запас: 1,5 мг/мл; предоставляется в соотношении 9:1 дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) и дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG; чистота >99%)
Spectramax Gemini XS plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany Ceralas
PDT 652 nm Laser	biolitec AG, Jena, Germany	LD652nm2W400u
Водорастворимый реагент тетразолий (WST)	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Швейцария	1644807