В настоящем докладе описывается простой и быстрый метод интратекальной прокол иглой для локализованной трансфекции миРНК в поясничном спинном мозге у мышей под короткий прочного легкой анестезией.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Vivo миРНК трансфекции и Нокдаун гена в спинного мозга через Rapid неинвазивной поясничного Intrathecal инъекций у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот отчет описывает шаг за шагом руководство по технике острых интратекальных инъекций иглой в неинвазивной образом, то есть не зависит от катетера имплантации. Технический ограничение этого хирургического метода заключается в изяществом руках. Инъекция является быстрым, особенно для обученного экспериментатора, и с тех тканей нарушение с этой техникой минимальна, повторные инъекции возможны, причем иммунная реакция на иностранных инструментов (. Например катетер) не происходит, тем самым давая лучшее и более конкретные зачитал спинного модуляции мозга. Поскольку применение вещества в значительной степени ограничивается целевой области спинного мозга, препараты не должны применяться в больших дозах, и что более важно нежелательные воздействия на другие ткани, как это наблюдалось с системной доставки, может быть обойдена 1, 2. Кроме того, этот метод сочетать с трансфекции в естественных нуклеиновых кислот с помощью polyethylenimине (PEI) реагент 3, который обеспечивает огромную универсальность для изучения функции спинного через доставку фармакологических агентов, а также ген, РНК и белка модуляторов.
Введение
Спинной мозг является очень важным центр в различных ключевых биологических процессов и физиологических функций, в том числе обработки и передачи болевых (ноцицептивных) входов 4-7. Различные экспериментальные методы были разработаны, чтобы облегчить фармакологическое модуляцию спинного мозга, таких как хронической имплантации интратекальных катетеров 8, спинного мозга, микроинъекции и интратекального введения иглы 9. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от эксперимента парадигмы одна техника может быть более подходящим, чем другие. В то время как хроническая имплантация интратекальных катетеров легко осуществимо в крысу, этот метод очень трудно в мыши, учитывая ограничения на размер. Успех составляет очень низкий и дефицит моторных часто происходят из-за громоздких присутствии катетера в строго ограниченном субдуральной пространства в мыши. Кроме того, долгосрочные поставки наркотиков оказывается из-за частого свертыванияхронически имплантировали катетеры. Наконец, иммунные реакции являются общими.
Эти проблемы можно обойти с помощью метода острой интратекального инъекции через иглу в отсутствии preimplanted катетера, который позволяет быстро и анатомически ограниченное применение препаратов и реагентов к спинного мозга у мышей. Этот способ полностью сохраняет преимущества интратекального доставки по сравнению с другими системными способами доставки (например, орального, внутривенного, внутрибрюшинного, и т.д.), такие как специфичности спинного модуляции, которая позволяет уменьшенные дозы и предел побочных эффектов, а также способности обеспечивать вещества не обычно не пересекают гематоэнцефалический барьер, так как во время интратекальной инъекции, игла вводится между твердой мозговой оболочки и спинного мозга. Важно отметить, однако, по сравнению с другими методами интратекального доставки, интратекального метод инъекционной иглы является наименее инвазивным, позволяя многочисленные применения вже животное, не причинив никакого значительного повреждения тканей или вызывая иммунную реакцию из-за имплантации инородного материала. Тем не менее, это требует технических навыков для очень точного нацеливания иглы, чтобы позволить эффективность.
Здесь мы визуально продемонстрировать способ достижения оптимального показатель успеха для специально нацеленные на поясничную область спинного мозга. Место инъекции, которая выбрана в этом эксперименте является паз между L5 и L6 позвоночных колонке, рядом с котором спинной мозг заканчивается, чтобы свести к минимуму возможность повреждения позвоночника. Кроме того, мы демонстрируем использование этой техники, чтобы сбить генов в спинном мозге с помощью миРНК.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры использования животных были в соответствии с этическими принципами, установленными местной руководящего органа (Regierungspräsidium Карлсруэ, Карлсруэ, Германия).
1. Подготовка миРНК / PEI комплекса
Комплексное решение миРНК / PEI получают, используя инструкции производителя следующим образом:
- Решение: Развести необходимое количество миРНК стерильной водой (при необходимости) до четверти конечного объема и разбавить этот вопрос с 10% раствором глюкозы до половины конечного объема. Vortex мягко или перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Оптимальное количество миРНК должна быть определена опытным путем, но 1 мкг миРНК в 10 мкл раствора комплекса на животное является хорошей отправной точкой для оптимизации.
- Раствор В: Разбавить необходимое объем реагента PEI стерильной водой до четверти конечного объема и разбавленной этот вопрос с 10% раствором глюкозы до половины конечного объема. Vortex GEntly или перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
Примечание: количество реагента PEI определяет ионный баланс в комплексе, который влияет на эффективность трансфекции. Аналогичным образом оптимальное количество раствора PEI должна быть определена эмпирически. В наших руках, оптимальное количество составляет 0,12 мкл PEI раствора на 1 мкг миРНК. - Смешайте раствор А с раствором Б все сразу, вихрь мягко.
- Инкубируйте смешанного раствора в течение 15 мин при комнатной температуре перед использованием. Этот комплекс стабилен в течение 2 ч при комнатной температуре и в течение 24 ч при 4 ° С.
2. Интратекальное впрыска
- Обезболить мышь с 3% изофлуран, пока он не показывает никаких признаков рефлекса. Кроме того, проверьте, хвоста и / или лапы пинч рефлекса для дальнейшего обеспечения состояние наркоза.
- Бритье около 2 см 2 меха на заднем конце животного у основания хвоста для лучшего визуализации во время введения иглы.
- Наведите курсор вносовой обтекатель для продолжения администрации изофлурана во время процедуры, уменьшить изофлурана до 1,5%, и покрывать глаза мыши с глаз смазки.
- Подготовка готов к использованию миРНК смешанный раствор с использованием 25 мкл Hamilton шприц, прикрепленный к 30 G 0,5 в иглу.
- Найдите остистый процесс L6, которая должна быть самым видным один и исправить, нажав на нее мягко столбец позвоночных вокруг этой области.
- Осторожно вставьте иглу между паз L5 и L6 позвонков и наблюдать за хвост фильме как этот знак указывает на успешный выход иглы в интрадуральной пространстве.
Совет: Использование ноготь, нужно быть в состоянии определить местонахождение паз, а также. - После того, как наблюдается хвост фильм, не сразу, а тщательно закрепите положение иглы с одной стороны и впрыснуть нужного объема вещества с другой стороны медленно.
Совет: объем между 5-10 мкл является оптимальным как объем менее 5 &# 181; л ненадежно и объем больше, чем 10 мкл приводит к слишком много давления. - После инъекции выполняется, переместите мышь обратно в клетку, чтобы оправиться от наркоза.
- Повторите этот инъекции по крайней мере еще два раза каждые 24 ч, чтобы достичь оптимального понижающей регуляции гена-мишени.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для того чтобы проиллюстрировать успешную инъекции, мы выполнили эту технику с использованием быстрого Зеленый FCF краситель у взрослых C57BL6 мышей (8-10 недель). Животное было позволено восстановить в течение нескольких минут после инъекции, чтобы обеспечить достаточно времени для красителя для распространения, а затем убили с передозировкой CO 2. Затем колонна позвоночных иссекали и спинной мозг был выставлен. Синий Puncta соответствующий рассеянным красителя, отмеченные место инъекции. Никаких признаков т...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Таким образом, вышеописанная методика интратекальных инъекций иглы является эффективным, быстро, в частности, локализованные и неразрушающий. Технически, наиболее важным аспектом этой процедуры является точка введения иглы в канавку. Очень важно, чтобы эта процедура делается с очень спокойных рук и терпения. Как и многие хирургических процедур, обучение повышает скорость успешного инъекций. Это также важно, потому что во время фактического эксперимента, этот метод не обеспечивает очевидный индикатор напрямую подтвердить...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 миРНК | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Контрольная миРНК-А | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Антитело к анти-ß-тубулину III | Sigma | T2200 | |
| Антитела против WAVE1 | R& D Systems | AF5514 | |
| Быстрый зеленый краситель | Sigma | F-7252 | |
| Изофлуран | Бакстера | ||
| Установка изофлурана | Drä ger Lü Бек | ||
| Бритва | Wella | ||
| Шприц Hamilton Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 Г 1/2 в 13 мм Игла | BD Microlance | 304000 | |
| Микроскоп Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 прямой праймер для qRT-PCR | Sigma | cacagagccaggacagg | |
| WAVE1 обратный праймер для qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Ссылки
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neuroscience. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
