В настоящем докладе описывается простой и быстрый метод интратекальной прокол иглой для локализованной трансфекции миРНК в поясничном спинном мозге у мышей под короткий прочного легкой анестезией.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Vivo миРНК трансфекции и Нокдаун гена в спинного мозга через Rapid неинвазивной поясничного Intrathecal инъекций у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот отчет описывает шаг за шагом руководство по технике острых интратекальных инъекций иглой в неинвазивной образом, то есть не зависит от катетера имплантации. Технический ограничение этого хирургического метода заключается в изяществом руках. Инъекция является быстрым, особенно для обученного экспериментатора, и с тех тканей нарушение с этой техникой минимальна, повторные инъекции возможны, причем иммунная реакция на иностранных инструментов (. Например катетер) не происходит, тем самым давая лучшее и более конкретные зачитал спинного модуляции мозга. Поскольку применение вещества в значительной степени ограничивается целевой области спинного мозга, препараты не должны применяться в больших дозах, и что более важно нежелательные воздействия на другие ткани, как это наблюдалось с системной доставки, может быть обойдена 1, 2. Кроме того, этот метод сочетать с трансфекции в естественных нуклеиновых кислот с помощью polyethylenimине (PEI) реагент 3, который обеспечивает огромную универсальность для изучения функции спинного через доставку фармакологических агентов, а также ген, РНК и белка модуляторов.
Введение
Спинной мозг является очень важным центр в различных ключевых биологических процессов и физиологических функций, в том числе обработки и передачи болевых (ноцицептивных) входов 4-7. Различные экспериментальные методы были разработаны, чтобы облегчить фармакологическое модуляцию спинного мозга, таких как хронической имплантации интратекальных катетеров 8, спинного мозга, микроинъекции и интратекального введения иглы 9. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от эксперимента парадигмы одна техника может быть более подходящим, чем другие. В то время как хроническая имплантация интратекальных катетеров легко осу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры использования животных были в соответствии с этическими принципами, установленными местной руководящего органа (Regierungspräsidium Карлсруэ, Карлсруэ, Германия).
1. Подготовка миРНК / PEI комплекса
Комплексное решение миРНК / PEI получают, используя инструкции производителя следующим образом:
- Решение: Развести необходимое количество миРНК стерильной водой (при необходимости) до четверти конечного объема и разбавить этот вопрос с 10% раствором глюкозы до половины конечного объема. Vortex мягко или перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Оптимальное количество миРНК должна быть оп....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для того чтобы проиллюстрировать успешную инъекции, мы выполнили эту технику с использованием быстрого Зеленый FCF краситель у взрослых C57BL6 мышей (8-10 недель). Животное было позволено восстановить в течение нескольких минут после инъекции, чтобы обеспечить достаточно времени для красителя для распространения, а затем убили с передозировкой CO 2. Затем колонна позвоночных иссекали и спинной мозг был выставлен. Синий Puncta соответствующий рассеянным красителя, отмеченные место инъекции. Никаких признаков т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Таким образом, вышеописанная методика интратекальных инъекций иглы является эффективным, быстро, в частности, локализованные и неразрушающий. Технически, наиболее важным аспектом этой процедуры является точка введения иглы в канавку. Очень важно, чтобы эта процедура делается с очень спокойных рук и терпения. Как и многие хирургических процедур, обучение повышает скорость успешного инъекций. Это также важно, потому что во время фактического эксперимента, этот метод не обеспечивает очевидный индикатор напрямую подтвердить.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 миРНК | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Контрольная миРНК-А | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Антитело к анти-ß-тубулину III | Sigma | T2200 | |
| Антитела против WAVE1 | R& D Systems | AF5514 | |
| Быстрый зеленый краситель | Sigma | F-7252 | |
| Изофлуран | Бакстера | ||
| Установка изофлурана | Drä ger Lü Бек | ||
| Бритва | Wella | ||
| Шприц Hamilton Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 Г 1/2 в 13 мм Игла | BD Microlance | 304000 | |
| Микроскоп Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 прямой праймер для qRT-PCR | Sigma | cacagagccaggacagg | |
| WAVE1 обратный праймер для qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Ссылки
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-lik....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
