Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиной модели шейки травмы спинного мозга по изучению пост-поврежденной органов дыхания Нейропластичность

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51235

⸱

28 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1UFR des sciences de la santé - Simone Veil, Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines, 2Service de Physiologie - Explorations fonctionnelles, Hôpital Ambroise Paré, 3Services de Physiologie, Explorations Fonctionnelles, Réanimation Médicale et Centre d'Investigation Clinique et d'Innovation Technologique (Unité Inserm 805), Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines

В этой статье

Краткое содержание

Дыхательная недостаточность является основной причиной смерти после рака шейки травмы спинного мозга. Имея воспроизводимое, количественные и надежную доклинические животную модель дыхательной недостаточности, вызванной частичным травмы шейного поможет понять последующее дыхания и не дыхательные нейропластичность и позволяют тестирования предполагаемых стратегий ремонт.

Аннотация

Шейки травмы спинного мозга вызывает постоянный паралич, и часто приводит к дыхательной недостаточности. На сегодняшний день нет эффективных терапевтических средств не были разработаны, чтобы улучшить / улучшить дыхательную недостаточность следующее высокой шейки травмы спинного мозга (SCI). Здесь мы предлагаем мышиный доклинические модель высокой ТСМ в шейном 2 (С2) метамерной уровне изучения разнообразный пост-поврежденной дыхания нейропластичность. Методика состоит из хирургической травмы частичной на уровне C2, который будет индуцировать hemiparalysis диафрагмы из-за деафферентации диафрагмальных мотонейронов из дыхательных центров, расположенных в стволе мозга. Контралатеральной стороне травмы остается неизменным и позволяет извлекать животных. В отличие от других ГЦБИ, которые влияют на функцию опорно-двигательного (на грудной и поясничном уровне), функция дыхания не требует мотивации животных и количественное определение дефицита / восстановления можно легко выполнить (диафрагма и запись диафрагмального нервас, вся вентиляция тела). Это доклинические модель С2 SCI является мощным, полезным и надежным доклинические модель для изучения различных респираторных и не респираторных событий Нейропластичность на различных уровнях (молекулярных физиологии) и протестировать различные предполагаемые терапевтические стратегии, которые могли бы улучшить дыхание в пациенты SCI.

Введение

Травмы спинного мозга является распространенная травма наблюдается в человеческой популяции с драматическими инцидентов, таких как постоянному параличу. Тем не менее, тяжесть травмы зависит от уровня и степени первоначальной травмы. Дыхательная недостаточность является основной причиной смертности следующей верхних шейных травм спинного мозга (SCI) 1. В настоящее время единственным терапевтическое лечение является размещение пациента при содействии вентиляционной. Поскольку немногие пациенты могут быть отлучить от вентиляционную помощь 2, за счет спонтанного восстановления, которое происходит с пост-поврежденной задержки, необходимость в разработке новых инновационных неинвазивных терапевтических срочно 3. Имея хороший стандартизированный доклинические модель для изучения влияния шейного ТСМ на дыхательной недостаточности и, следовательно, для изучения применения предполагаемых терапевтических стратегий, имеет важное значение.

В этом техническом статье мы опишем конкретный доклинические мышиной модели Oе дыхательной недостаточностью, индуцированный частичной шейки ТСМ на уровне С2. Эта модель в настоящее время используется несколько лабораторий по всему миру (по отзывам: 4-13). Тем не менее, небольшие различия в хирургической процедуры может наблюдаться между различными исследователями для создания этого особое шейки травмы мышиной модели. Эффект С2 ТСМ на дыхательную выход был впервые описан в 1895 году Портер 14. Шейный гемисекция индуцирует деафферентация из диафрагмальных мотонейронов от их центральным приводом (находится в rVRG в стволе мозга, фиг.1А) на ипсилатеральной стороне травмы, что приводит к тихого диафрагмального нерва активности и последующего паралича диафрагмы. Противоположной стороне остается неизменным и позволяет животным выживать. В отличие от другой ТСМ, расположенный в нижней сегмента позвоночника (например contusive травмы на C4 уровне 15), целостность диафрагмального двигательных нейронов ядра на обеих сторонах сохраняется. После CERVческих травмы С2, некоторые спонтанная активность можно наблюдать на той же стороне (диафрагмального и диафрагмы) в связи с активизацией контралатеральных молчаливых синаптических путей, которые пересекли спинной средней линии на уровне сегментная С3-С6 (Скрещенные диафрагмального путей, CPP, рисунке 1b) . Активация CPP, который является, по определению, С2 гемисекция в сочетании с противоположной phrenicotomy которые индуцировать ипсилатеральную частичное диафрагмального восстановление нерва, может произойти от часов до нескольких недель после повреждения 16-18. Реальный положительный эффект этого CPP пути на восстановление дыхания ограничивается 19 и дальнейшего обследования и лечения должны быть разработаны, чтобы улучшить величину спонтанного восстановления 3.

Этот протокол обеспечивает мощный тип доклинических мышиной модели для изучения дыхания после поврежденной пластичность на различных уровнях (дыхательная физиология из предварительно и диафрагмальных мотонейронов, интернейронов, молекулярная и CELLULAг, передвижение передней конечности, например), а также образцом для тестирования инвазивных и неинвазивных терапевтических стратегий, направленных на улучшение дыхания и восстановление движений следующий С2 частичной шейки травмы спинного мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен комитетом по этике в RBUCE-UP кафедры мастерства (Университет Paris Sud, договора грант № 246556) и Университете де Версаль Saint-Quentin-ан-Ивелин.

1. Подготовка стерилизовать хирургические инструменты

  1. Очистите хирургических инструментов с лабораторной моющего средства.
  2. Автоклав инструменты до операции.
  3. В хирургической сессии стерилизации инструментов, поместив подсказки в горячем шарик стерилизатор в течение 10 мин при 180 ° С между 2 хирургических операций.

2. Подготовка наркотикам

  1. Подготовьте 2 х 1 мл шприцы для предварительного анестетика коктейль препараты и послеоперационных препаратов.
  2. Согласно веса крысы, подготовить шприц с предварительно анестезирующих препаратов: Carprofen (5 мг / кг), бупренорфин (50 мкг / кг), Baytril (5 мг / кг) и дексмедетомидин (0,5 мг / кг). Заполните объем до 1 мл лактат Рингера.
  3. Подготовка вдругой шприц разворот для предварительного обезболивающих препаратов: Атипамезол (500 мкг / кг).

3. Анестезия Крысы

  1. Администрирование подкожно в организм животного решение предварительно обезболивающих препаратов, описанных в пункте 2.2. Затем положить животное обратно в клетку и ждать, пока не появится седативный эффект.
  2. Поместите крысу в закрытой камере, заполненной 5% изофлуран в 100% О 2, и подождите, пока ритм дыхания замедляется (около 30 сек). Затем снимите крысу из камеры и поместить его на стол интубации.

4. Оротрахеальная интубации

  1. Ли животное на спину, затем закрепите головку путем размещения ремня, прикрепленного к его передних зубов к столу.
  2. С волоконно-оптической света, загораются грудной пространство. Затем поместите ларингоскоп (или выполненное на заказ один, Jou др.. 20 для получения подробной информации) в рот животного. Визуализация голосовые связки.
  3. Слиде и разместить оротрахеальная руководство в трахею (между голосовыми связками). Вставьте оротрахеальная трубку (16 г размер катетер) на направляющей.
  4. Снимите руководство и проверить с гортани зеркало размещается в конце оротрахеальная трубки на наличие влаги, подтверждающие соответствующую позицию трубки в трахею, а не в пищевод.
  5. Подключите трубку к аппарату искусственной вентиляции легких грызунов (683 грызунов вентилятор, Harvard Apparatus) и отрегулируйте концентрацию изофлураном до 2% (в 100% О 2).
  6. Закрепите оротрахеальная трубку с хирургической лентой.

5. Хирургия позвоночника

  1. Поместите животное в вентральной позиции пролежни на хирургическом пластины с подогревом, с носом, указывая на 90 ° углом к ​​хирургу. Поддерживать температуру тела вокруг 37,5 ° С на протяжении операции.
  2. Бритье волос с ножницами между лопатками и удалить волосы марлей.
  3. Протрите кожу бетадином, то с 70% спирта. Повторите этот шаг 3 раза.
  4. Носок пинч выполняется перед началом операции, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.   Затем выполните боковой разрез кожи ростро-каудально с ножницами между лопатками.
  5. Разрежьте acromiotrapezius мышц ростро-каудально, следуя сухожилия, чтобы предотвратить любое кровотечение. Тогда отделить ромбовидную мышцы для доступа остистой мышцы (окружающие позвонок).
  6. Уберите остистой мышцы от C1 до C3 позвонка. С2 позвонка является одним с видным апофиза.
  7. Очистите мышцы вокруг спинной части позвонка с помощью стерильных ватных тампонов.
  8. Начните удалить тщательно апофиза С2 с костными кусачками. Тогда, по-прежнему тщательно до спинной спинного мозга не подвергается. Убедитесь, что ламинэктомия является спинной геми ламинэктомия. Обратите особое внимание на твердой мозговой оболочки, который охватывает спинной мозг и артерии в непосредственной близости от этой области.
  9. За # 55 щипцов, препарировать ROSтро-каудально твердая мозговая оболочка вдоль С2, рядом продолжить сбоку на каждой ростральной и хвостового стороне.
  10. Губка до спинномозговой жидкости.
  11. Сделать боковую секцию под шейки задних корешков № 2 с microscissors. Проверить при помощи микро скальпелем, что степень поражения достаточно близко, чтобы достичь средней линии спинного мозга (см. рисунок 2А для спинной травмы). Если нет, то другой разрез может быть сделан, чтобы завершить травмы. В случае кровотечения, использовать стерильные ватные тампоны. Будьте осторожны, чтобы не пойти в противоположной стороне, в противном случае, животное не восстановится от травмы и будет иметь дыхательной недостаточности.
  12. Шовный мышцы в качестве защитного слоя и шов обратно в кожу. Очистите рану Бетадин насыщенного стерильную марлю.
  13. Выключения изофлуран испаритель и впрыснуть разворота препараты (Атипамезол [500 мкг / кг, внутримышечно]), проверить температуру тела.
  14. Когда животное начинает дышать против вентилятора,отсоедините трахеи трубку от вентилятора, а затем удалить оротрахеальная трубку. Место животное в отапливаемом клетку для восстановления.

6. Послеоперационный уход

После операции животные постоянно контролировать, чтобы обеспечить наилучшее для восстановления окружающей среды. Антибиотики (Baytril, 5 мг / кг), противовоспалительное (Carprofen, 5 мг / кг) и бупренорфин (50 мкг / кг) наркотики даны каждые 12 ч в течение первых 2 дней после операции, чтобы предотвратить инфекции и уменьшить возникновение послеоперационной боли. Крысы имеют доступ к вволю мягкой пищи и воды (или воды застывший на первый послеоперационный день). Подкожные жидкости могут быть использованы, чтобы предотвратить обезвоживание на первых послеоперационных дней. Вес тела и потребление пищи ежедневно контролируется. Их среда обогащается в течение всего эксперимента и времени после травмы (двойной корпус, насосно-компрессорных труб в их клетках).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протяженность травмы

Успех и воспроизводимость этой конкретной экспериментальной модели зависят от опыта каждого манипулятора / хирурга. Последующее количество дыхательных восстановления (диафрагмального деятельности нервов и деятельности диафрагмы) после травмы С2 коррелирует с остальными вентролатеральной пощадил белое вещество 21. Поскольку травма "ручной" и требует некоторой практики от хирурга, степень каждой травмы должна быть проверена на гистолог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Технические Трудности Создание C2 травмы Модель

С2 травмы мышиной модели является интересным инструментом для изучения дыхания после поврежденной нейропластичность. Тем не менее, шаги, необходимые для получения воспроизводимых и надежную модель многочисленны и каждый из них может повлиять на исход исследования. Например, во время процесса интубации, особую осторожность должно быть принято с оротрахеальная трубка может произвести воспаление трахеи, что может привести к различ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Эта работа поддерживается финансирование из рамочного Евросоюз Седьмой Программы (FP7/2007-2013) по договору грант № 246556 (европейский проект RBUCE-UP), HandiMedEx выделено французским государственных инвестиций Совета. Марсель Bonay была поддержана Chancellerie де университеты де Пари (Ноги Poix), фондах де дотация Recherche ан Санте Respiratoire и Центра d'помощи Respiratoire местожительство d'Иль де Франс (Кардиф)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AnimalMale
Sprague Dawley Rat Janvier225-250 g
Surgical Instruments
Student Dumont #5 щипцыFine Science Tool91150-20
Студенческий щипцы стандартного образцаFine Science Tool91100-12
Mayo-Stille НожницыFine Science Tool14013-15Изогнутый
студенческий ванна Пружинные ножницыFine Science Tool91500-09Прямые
пружинные ножницы - лезвия 8 ммFine Science Tool15025-10Прямой тупой/тупой
Friedman Pearson RongeurFine Science Tool16121-14Изогнутый
препарирующий нож - Fine TipFine Science Tool10055-12Прямой
иглодержатель Ольсена-ХегараFine Science Tool12002-14Зубчатый
ретрактор Weitlaner-LocktiteFine Science Tool17012-112x3 Тупые
рассасывающиеся хирургические нитиCentravetBYO001Размер шовного материала 4-0
Equipment
Hot Bead SteriliserFine Science Инструмент18000-45
Катетер CentravetCAT18816 G
Ларингоскоп
Направляющая проволока
Ларингеальное зеркалоCentravetMIR011
Лактатные кольцаCentravetRIN020
ШприцИгла Centravet
O2Air LiquidI1001M20R2A001
683 RodentT Вентилятор 115/230VГарвардский аппарат55-0000
Автономный испарительWPIEZ-155
Тонкая линия нагрева WPIEZ-211
Канистра с воздухомWPIEZ-258
Drugs
КарпрофенСентравет
РимадилЦентраветRIM011
БупренорфинСентраветBUP001
БайтрилСентраветBAY001
ДексмедетомидинЦентраветDEX010
АтипамезолЦентраветANT201
Бетадина растворCentravetVET002
IsofluraneCentravetVET066

Ссылки

  1. Frankel, H. L., et al. Long-term survival in spinal cord injury: a fifty year investigation. Spinal Cord. 36, 266-274 (1998).
  2. Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38, 449-472 (2000).
  3. Zimmer, M. B., Nantwi, K., Goshgarian, H. G. Effect of spinal cord injury on the respiratory system: basic research and current clinical treatment options. J Spinal Cord Med. 30, 319-330 (2007).
  4. Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Neuromuscular adaptations to respiratory muscle inactivity. Respir Physiol Neurobiol. 169, 133-140 (2009).
  5. Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon and recovery of function following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 85-93 (2009).
  6. Nantwi, K. D. Recovery of respiratory activity after C2 hemisection (C2HS): involvement of adenosinergic mechanisms. Respir Physiol Neurobiol. 169, 102-114 (2009).
  7. Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
  8. Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D., Reier, P. J. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 123-132 (2009).
  9. Seeds, N. W., Akison, L., Minor, K. Role of plasminogen activator in spinal cord remodeling after spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 141-149 (2009).
  10. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
  11. Vinit, S. Cervical spinal cord injuries and respiratory insufficiency: a revolutionary treatment. Med Sci (Paris. 28, 33-36 (2012).
  12. Kastner, A., Gauthier, P. Are rodents an appropriate pre-clinical model for treating spinal cord injury? Examples from the respiratory system). Exp Neurol. 213, 249-256 (2008).
  13. Vinit, S., Lovett-Barr, M. R., Mitchell, G. S. Intermittent hypoxia induces functional recovery following cervical spinal injury. Physiol Neurobiol. 169, 210-217 (2009).
  14. Porter, W. T. The Path of the Respiratory Impulse from the Bulb to the Phrenic Nuclei. J Physiol. 17, 455-485 Forthcoming.
  15. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
  16. Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon: a model for plasticity in the respiratory pathways following spinal cord injury. J Appl Physiol. 94, 795-810 (2003).
  17. Vinit, S., Gauthier, P., Stamegna, J. C., Kastner, A. High cervical lateral spinal cord injury results in long-term ipsilateral hemidiaphragm paralysis. J Neurotrauma. 23, 1137-1146 (2006).
  18. Fuller, D. D., Johnson, S. M., Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Chronic cervical spinal sensory denervation reveals ineffective spinal pathways to phrenic motoneurons in the rat. Neurosci Lett. 323, 25-28 (2002).
  19. Dougherty, B. J., Lee, K. Z., Lane, M. A., Reier, P. J., Fuller, D. D. Contribution of the spontaneous crossed-phrenic phenomenon to inspiratory tidal volume in spontaneously breathing rats. J Appl Physiol. 112, 96-105 (2012).
  20. Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J Appl Physiol. 89, 1766-1770 (2000).
  21. Fuller, D. D., et al. Graded unilateral cervical spinal cord injury and respiratory motor recovery. Respir Physiol Neurobiol. 165, 245-253 (2009).
  22. Vinit, S., Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Lipopolysaccharide attenuates phrenic long-term facilitation following acute intermittent hypoxia. Respir Physiol Neurobiol. 176, 130-135 (2011).
  23. Ahmad, F., Wang, M. Y., Levi, A. D. Hypothermia for Acute Spinal Cord Injury-A Review. World Neurosurg. , (2013).
  24. Lovett-Barr, M. R., et al. Repetitive intermittent hypoxia induces respiratory and somatic motor recovery after chronic cervical spinal injury. J Neurosci. 32, 3591-3600 (2012).
  25. Minor, K. H., Akison, L. K., Goshgarian, H. G., Seeds, N. W. Spinal cord injury-induced plasticity in the mouse--the crossed phrenic phenomenon. Exp Neurol. 200, 486-495 (2006).
  26. Baussart, B., Stamegna, J. C., Polentes, J., Tadie, M., Gauthier, P. A new model of upper cervical spinal contusion inducing a persistent unilateral diaphragmatic deficit in the adult rat. Neurobiol Dis. 22, 562-574 (2006).
  27. Golder, F. J., et al. Breathing patterns after mid-cervical spinal contusion in rats. Exp Neurol. 231, 97-103 (2011).
  28. Lane, M. A., et al. Respiratory function following bilateral mid-cervical contusion injury in the adult rat. Exp Neurol. 235, 197-210 (2012).
  29. Vinit, S., et al. Axotomized bulbospinal neurons express c-Jun after cervical spinal cord injury. Neuroreport. 16, 1535-1539 (2005).
  30. Guenther, C. H., Windelborn, J. A., Tubon, T. C., Yin, J. C., Mitchell, G. S. Increased atypical PKC expression and activity in the phrenic motor nucleus following cervical spinal injury. Exp Neurol. 234, 513-520 (2012).
  31. Mantilla, C. B., Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Motoneuron BDNF/TrkB signaling enhances functional recovery after cervical spinal cord injury. Exp Neurol. 247, 101-109 (2013).
  32. Vinit, S., Darlot, F., Aoulaiche, H., Boulenguez, P., Kastner, A. Distinct expression of c-Jun and HSP27 in axotomized and spared bulbospinal neurons after cervical spinal cord injury. J Mol Neurosci. 45, 119-133 (2011).
  33. Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Glial activation in the spinal ventral horn caudal to cervical injury. Respir Physiol Neurobiol. 180, 61-68 (2012).
  34. Vinit, S., Stamegna, J. C., Boulenguez, P., Gauthier, P., Kastner, A. Restorative respiratory pathways after partial cervical spinal cord injury: role of ipsilateral phrenic afferents. Eur J Neurosci. 25, 3551-3560 (2007).
  35. Dougherty, B. J., et al. Recovery of inspiratory intercostal muscle activity following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 183, 186-192 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C2
Мышиной модели шейки травмы спинного мозга по изучению пост-поврежденной органов дыхания Нейропластичность
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.