Эта статья демонстрирует использование быстро сканирующей конфокальной микроскопии с поведением изображений клеток непосредственно через пупария. Задержите куколки дело нетронутыми, этот метод позволяет наблюдения и измерения динамических процессов клеточных на стадии разработки Drosophila, которые трудно изучать непосредственно.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изображений Через куколки случае
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Давние использование дрозофилы в качестве модели для клеточной и эволюционной биологии дало широкий спектр инструментов. Вместе эти методы позволили анализ клеточной и эволюционной биологии из различных методологических углами. Онлайн изображений является новым методом наблюдения динамических процессов клеток, такие как деление клеток или клеточной подвижности. Выделив мутации в неохарактеризованных предполагаемых белков клеточного цикла это стало необходимо соблюдать митоза на месте с помощью живого изображения. Большинство живых изображений исследования у дрозофилы были сосредоточены на эмбриональной стадии, которые доступны для манипуляций и наблюдения из-за их небольшого размера и оптической прозрачности. Тем не менее, в этих стадий клеточного цикла необычен тем, что в нем отсутствует один или оба из фаз разрыв. В противоположность этому, клетки куколки крыла дрозофилы имеют типичный клеточный цикл и пройти период бурного митоза, охватывающую около 20 час из куколки развития. Легко Identify и изолировать куколок соответствующем этапе поймать митоза на месте. Монтаж нетронутыми куколки условии наилучшее сочетание сговорчивости и долговечность во время съемки, позволяя эксперименты для запуска в течение нескольких часов с минимальным воздействием на клетки и животных жизнеспособности. Метод позволяет наблюдать особенности как малые, как, или меньше, чем, летать хромосомы. Регулировка настроек микроскопа и детали крепления, позволило расширение подготовки визуализировать мембранные динамику соседних клеток и флуоресцентно меченных белков, таких как тубулина. Этот метод работает для всех тестируемых флуоресцентных белков и может захватить масштабные особенности субмикронных по множеству временных масштабах. В то время как ограничен наружной 20 мкм куколки с обычным конфокального микроскопа, этот подход к соблюдению белка и клеточных динамику в куколки тканей в естественных условиях в целом могут быть полезны при исследовании клеток и биологии развития в этих тканях.
Введение
Уксус муха, дрозофилы, является устоявшейся моделью для изучения многих аспектов биологии. Исследования дрозофилы имеет богатую историю генетического эксперимента, который позволяет изощренные формы генных манипуляций в том числе слова, нокдаун и мутации. С появлением флуоресцентный белок этикеток, это репертуар расширилась и теперь включает изучение клеток и белков в живых животных. Муха эмбрион является отличной системой для таких исследований, поскольку это маленькое и оптически ясно позволяя глубоко, с высоким разрешением изображения в естественных условиях 1-3. Другие этапы развития лету оказались менее сговорчивыми, требуя Наркоз 4, вскрытие и краткосрочный культуру 5,6, или создание окон в кутикулу для работы с изображениями 7,8. Эти манипуляции, как правило, компромисс развития животных в долгосрочной перспективе и не влияет на животное таким образом, чтобы ограничить изображений на короткие периоды.
ЛОР "> Для изучения новых мутаций в генах, которые напоминают регуляторов клеточного цикла, необходимо было найти подходящую подготовку для изучения сроков и верность клеточного цикла. Поскольку обрезаются большинство эмбриональных клеточных циклов (SM или S-G2-M) и мутанты изучаемые не обнаруживают дефекты до более поздних стадиях, это не было важно соблюдать клеточный цикл в стадии куколки тканей. эпителиальных клеток в куколки имеют более типичный G1-S-G2-M клеточного цикла и куколки этой стадии не способны мышечных движений 9. Первоначальный отправной точкой для манипуляций включены нетронутыми все куколки, выразив Histone2AV-GFP. Несмотря на кажущуюся непрозрачности куколки случае это нетронутыми подготовка оказалась отлично подходит для долгосрочных в естественных изображений. Эта техника проста Достаточно того, что студенческие исследователи обычно используют его для изучения аспектов клеточной и эволюционной биологии у дрозофилы и все же разрешение является достаточно тонкой, чтобы позволить дискриминацию микрометр масштабных функций. С помощью этого метода, наблюдения событий более часов, минут или секунд возможны просто, регулируя параметры временных рядов. Видео с помощью синих, зеленых, желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, или их комбинации, были сделаны. Важно отметить, что, если приняты меры, чтобы минимизировать интенсивность лазера, даже долгосрочная изображений не имеет никакого влияния на развитие или жизнеспособности животных.Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Fly Работа
- Поддерживать мух на стандартной фуражное зерно-агар-патока-дрожжевой среде при комнатной температуре 10.
- Для крестов, изолировать девственниц в пределах 6 часов от вылупления. После пересечения с мужчинами желаемого генотипа, изменение летит к новым флаконах каждые 3-4 дня.
Примечание: Для этих экспериментов Gal4 линии A9 был использован для управления экспрессией трансгенов в крыле. Fly запасы могут быть получены из фондового центра в Блумингтон. Акции, используемые в этих экспериментах, включают A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), ШОС / суо HsCre (BL # 1092), UAS-ChRFP-ванна (BL # 25773), lollibow 11.
2. Выбор и монтаж Куколки
- Стадия куколки либо путем сбора их в виде белого предкуколок (WPP) и держать их при 25 ° С, пока не достигнут соответствующего возраста или с помощью морфологических критериев 12.
- Для наблюдения деления клеток, выберите куколки, которые недавно подверглись головы выворачивание.С этого времени, пока непосредственно перед вылупления (в> 96 часов), куколки не неподвижны позволяя расширенный покадровой наблюдение.
- Удалить куколок из флаконов, сначала касаясь их с кистью, смоченной в воде, ожидая в течение минуты, чтобы позволить воде, чтобы ослабить клей, а затем аккуратно подталкивая их на кисти.
- Осторожно промыть выбранный куколок по подталкивая их с кистью в воде, чтобы удалить слюнные железы клейкие и частиц пищи.
- Трансфер чистую куколки, чтобы блюдо 25 мм чашки с покровного нижней (число 1 ½ покровные).
- Использование тонких полосок либо формовочной глины или зубной воск в качестве опоры, крепление куколок так, что ткань представляет интерес находится ближе всего к покровное.
Примечание: В исследованиях, описанных здесь, были обнаружены куколки крылья, ноги, брюшной histoblasts или спинной Notum. На практике любой ткани в 20 мкм от поверхности куколки случае наблюдается. - Ориент куколки так тщательно, что Тканье интерес параллельна поверхности покровного стекла.
- После того, как куколки установлены с помощью кисти для передачи тонкий слой тиодиэтиленгликол (TDG) в пространство между куколки и покровного стекла.
Примечание: TDG уменьшает поверхностное рассеяние, соответствует показатель преломления масла, а также позволяет кислороду проникать в ткань 13. Использование масел не рекомендуется, так как они, как правило, лишает ткани кислорода, вызывая быстрое прекращение клеточных поведения.
3. Изображений
Примечание: Для изображений, конфокальный микроскоп может иметь важное значение, поскольку confocality удалить большую часть затемн фоне вызванного интенсивной освещенности куколки случае.
- Настройка параметров на конфокальной чтобы свести к минимуму воздействие освещения на куколки развития и жизнеспособности. Чтобы сделать это, найти баланс между интенсивностью возбуждения и чувствительности коллекции. Типичная конфигурация для визуализации Wiй Leica SP5 использовал резонансную сканер (8000 Гц), мощность лазера установлен в 2% (10% пропускания от 20% мощности), пинхол набор до 120 мкм, и линия усреднения установлен до 8. Параметры будут меняться в зависимости от условий эксперимента.
Примечание: Для решения прекрасно шкала имеет 40X и 63X Нефть погружения линз (0,1 мм рабочее расстояние) также успешно используемый в этом методе, хотя они ограничивают глубину резкости.
4. Анализ
Для анализа кадров, Z-стеки или фильмы импортировать файлы данных на Фиджи, который имеет эффективные инструменты для просмотра, измерения и изменения файлов для презентации 14. Например время для завершения митоза была измерена с помощью интервал выборки и многомерный браузер изображений пошагово кадров во время просмотра клетку от профазы к телофазе. X-, Y-и Z-размеры можно измерить с помощью измерительного инструмента. Подробные инструкции по программному обеспечению и его использованиесм.: http://fiji.sc/Fiji.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клетки эпителия псевдомногослойного, такие как развивающегося Drosophila глаз, или желудочковой слоя проявляющего позвоночных центральной нервной системы, претерпевают ядерного движений, называемых интеркинетической ядерного миграции во времени с клеточного цикла. Репликация ДНК происходит, когда ядра на поверхности базальной или вблизи и клетки вступают в митоз, когда ядра достичь апикальной поверхности 15,16. Куколки крыло клетки образуют быстро делящиеся монослоя эпителий в течение первых нескольк...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для визуализации, измерения и количественной характеристики делящихся клеток, необходимый разработки простого подготовки к наблюдая митоза в живом куколки крыла дрозофилы с помощью конфокальной анализа His2AvGFP экспрессирующих клеток. Этот метод был использован для документирования, что цикл клеток в куколки крыла несет сильное сходство с клеточными циклов в псевдомногослойного эпителия в этом ядер переезда в апикальной поверхности эпителия, где они вступают в митоз. После телофазе, ядра упасть обратно в эпите...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность Akira Chiba для интеллектуальной поддержки, материальной поддержки, и акции. Благодаря Юлии Dallman для комментариев.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Подстилка для мух | Genesee Scientific | 59-114 | для обезболивания мух |
| CO2 газ | Airgas South | CD50 | Для обезболивания мух |
| Регулятор | Airgas South | CO2 регулятор | |
| флаконов от мух | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Культура мух |
| Drosophila линии:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Стеклянные донышки посуды #1 1/2 | WillCo Wells BV | Для микроскопии | |
| Тиодиэтилен Гликоль | Fluka | 88559 | монтант |
| Лепка из глины | в магазин | Поддержка для позиционирования куколок | |
| против кистей Магазин | художественных принадлежностей | Для манипулирования мухами | |
| Тонкие щипцы, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| компьютер | любой | 8 Гб ОЗУ для анализа изображений/фильмов | |
| Программное обеспечение | Бесплатное программное обеспечение http://fiji.sc/Fiji | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| Конфокальный микроскоп | Любой быстрый сканирующий конфокальный объектив должен быть достаточным | ||
| 20X сухим, и 40X или 63X масляными иммерсионными линзами | любой | Для визуализации тканевых, клеточных и субклеточных особенностей | |
| Иммерсионное масло (нефлуоресцентное) | |||
| Стереомикроскоп | любой | Для манипуляций с мухами |
Ссылки
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
