Эта статья демонстрирует использование быстро сканирующей конфокальной микроскопии с поведением изображений клеток непосредственно через пупария. Задержите куколки дело нетронутыми, этот метод позволяет наблюдения и измерения динамических процессов клеточных на стадии разработки Drosophila, которые трудно изучать непосредственно.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изображений Через куколки случае
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Давние использование дрозофилы в качестве модели для клеточной и эволюционной биологии дало широкий спектр инструментов. Вместе эти методы позволили анализ клеточной и эволюционной биологии из различных методологических углами. Онлайн изображений является новым методом наблюдения динамических процессов клеток, такие как деление клеток или клеточной подвижности. Выделив мутации в неохарактеризованных предполагаемых белков клеточного цикла это стало необходимо соблюдать митоза на месте с помощью живого изображения. Большинство живых изображений исследования у дрозофилы были сосредоточены на эмбриональной стадии, которые доступны для манипуляций и наблюдения из-за их небольшого размера и оптической прозрачности. Тем не менее, в этих стадий клеточного цикла необычен тем, что в нем отсутствует один или оба из фаз разрыв. В противоположность этому, клетки куколки крыла дрозофилы имеют типичный клеточный цикл и пройти период бурного митоза, охватывающую около 20 час из куколки развития. Легко Identify и изолировать куколок соответствующем этапе поймать митоза на месте. Монтаж нетронутыми куколки условии наилучшее сочетание сговорчивости и долговечность во время съемки, позволяя эксперименты для запуска в течение нескольких часов с минимальным воздействием на клетки и животных жизнеспособности. Метод позволяет наблюдать особенности как малые, как, или меньше, чем, летать хромосомы. Регулировка настроек микроскопа и детали крепления, позволило расширение подготовки визуализировать мембранные динамику соседних клеток и флуоресцентно меченных белков, таких как тубулина. Этот метод работает для всех тестируемых флуоресцентных белков и может захватить масштабные особенности субмикронных по множеству временных масштабах. В то время как ограничен наружной 20 мкм куколки с обычным конфокального микроскопа, этот подход к соблюдению белка и клеточных динамику в куколки тканей в естественных условиях в целом могут быть полезны при исследовании клеток и биологии развития в этих тканях.
Введение
Уксус муха, дрозофилы, является устоявшейся моделью для изучения многих аспектов биологии. Исследования дрозофилы имеет богатую историю генетического эксперимента, который позволяет изощренные формы генных манипуляций в том числе слова, нокдаун и мутации. С появлением флуоресцентный белок этикеток, это репертуар расширилась и теперь включает изучение клеток и белков в живых животных. Муха эмбрион является отличной системой для таких исследований, поскольку это маленькое и оптически ясно позволяя глубоко, с высоким разрешением изображения в естественных условиях 1-3. Другие этапы развития лету оказались менее сговорчивыми, т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Fly Работа
- Поддерживать мух на стандартной фуражное зерно-агар-патока-дрожжевой среде при комнатной температуре 10.
- Для крестов, изолировать девственниц в пределах 6 часов от вылупления. После пересечения с мужчинами желаемого генотипа, изменение летит к новым флаконах каждые 3-4 дня.
Примечание: Для этих экспериментов Gal4 линии A9 был использован для управления экспрессией трансгенов в крыле. Fly запасы могут быть получены из фондового центра в Блумингтон. Акции, используемые в этих экспериментах, включают A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), ШОС / суо HsCre (BL # 1092), UAS-ChRFP-ванна (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клетки эпителия псевдомногослойного, такие как развивающегося Drosophila глаз, или желудочковой слоя проявляющего позвоночных центральной нервной системы, претерпевают ядерного движений, называемых интеркинетической ядерного миграции во времени с клеточного цикла. Репликация ДНК происходит, когда ядра на поверхности базальной или вблизи и клетки вступают в митоз, когда ядра достичь апикальной поверхности 15,16. Куколки крыло клетки образуют быстро делящиеся монослоя эпителий в течение первых нескольк.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для визуализации, измерения и количественной характеристики делящихся клеток, необходимый разработки простого подготовки к наблюдая митоза в живом куколки крыла дрозофилы с помощью конфокальной анализа His2AvGFP экспрессирующих клеток. Этот метод был использован для документирования, что цикл клеток в куколки крыла несет сильное сходство с клеточными циклов в псевдомногослойного эпителия в этом ядер переезда в апикальной поверхности эпителия, где они вступают в митоз. После телофазе, ядра упасть обратно в эпите.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность Akira Chiba для интеллектуальной поддержки, материальной поддержки, и акции. Благодаря Юлии Dallman для комментариев.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Подстилка для мух | Genesee Scientific | 59-114 | для обезболивания мух |
| CO2 газ | Airgas South | CD50 | Для обезболивания мух |
| Регулятор | Airgas South | CO2 регулятор | |
| флаконов от мух | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Культура мух |
| Drosophila линии:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Стеклянные донышки посуды #1 1/2 | WillCo Wells BV | Для микроскопии | |
| Тиодиэтилен Гликоль | Fluka | 88559 | монтант |
| Лепка из глины | в магазин | Поддержка для позиционирования куколок | |
| против кистей Магазин | художественных принадлежностей | Для манипулирования мухами | |
| Тонкие щипцы, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| компьютер | любой | 8 Гб ОЗУ для анализа изображений/фильмов | |
| Программное обеспечение | Бесплатное программное обеспечение http://fiji.sc/Fiji | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| Конфокальный микроскоп | Любой быстрый сканирующий конфокальный объектив должен быть достаточным | ||
| 20X сухим, и 40X или 63X масляными иммерсионными линзами | любой | Для визуализации тканевых, клеточных и субклеточных особенностей | |
| Иммерсионное масло (нефлуоресцентное) | |||
| Стереомикроскоп | любой | Для манипуляций с мухами |
Ссылки
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
