Нейронов торговля мембрана динамически управляет ПЛАЗМАЛЕММЫ наличие белка и существенно влияет нейротрансмиссию. На сегодняшний день, это была сложной для измерения нейронов эндоцитического торговлей взрослых нейронов. Здесь мы описываем высокоэффективную, количественный метод измерения быстрые изменения в экспрессии белка поверхности экс естественных условиях в острых срезах мозга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Регулируемый эндоцитотический торговля является центральным механизмом содействия разнообразные нейромодуляторного событий, за счет динамического управления рецептор, ионный канал, и представление транспортера клеточной поверхностью на минут масштабе времени. Существует широкий разнообразие механизмов, которые контролируют эндоцитического оборотом отдельных белков. Исследования следственные молекулярные основы торговли были в первую очередь полагаться на поверхности биотинилирования количественно измерить изменения в экспрессии поверхностных мембранных белков в ответ на экзогенные стимулы и генной инженерии. Тем не менее, этот подход был в основном ограничивается культивируемых клеток, которые не могут добросовестно отражают физиологически соответствующие механизмы на игре у взрослых нейронов. Кроме того, культурные подходы клеток может привести к недооценке региональной специфики различия в механизмах торговли людьми. Здесь мы описываем подход, который простирается на клеточной поверхности биотинилирование к острой подготовки мозга среза. Мыпоказывают, что этот метод обеспечивает высококачественный подход для измерения быстрые изменения в поверхностных уровней мембранного белка у взрослых нейронов. Такой подход, вероятно, находят широкое применение в области нейронов эндоцитотического людьми.
Введение
Эндоцитотических торговля является повсеместное клеточный механизм, что точно настраивает ПЛАЗМАЛЕММЫ презентация различных интегральных мембранных белков. Эндоцитоз обеспечивает жизненно важных питательных веществ к внутриклеточной среде 1 и уменьшает чувствительность рецепторов сигналов в ответ на активацию рецепторов 2. Эндоцитотических утилизации обратно в мембране может дополнительно повысить клеточную сигнализацию за счет увеличения уровня экспрессии белка на клеточной поверхности 3. Кроме того, возмущения с торговлей людьми мембраны вовлечены в многочисленные заболевания и патологические состояния, 4,5, подчеркнув необходимость расследовать молекулярные механизмы, которые регулируют белковый торговлей эндоцитического. В то время как многие белки используют классические клатрином зависит интернализации механизмы, монтажные доказательства в течение последних нескольких лет показывает, что несколько клатрином независимым эндоцитотических механизмы регулируют эндоцитического потенциал растущего массивабелки 6,7. Таким образом, необходимость исследовать эндоцитотических механизмы, облегчающие торговлей физиологических соответствующих систем значительно вырос.
В мозге, эндоцитотический торговля рецепторов, ионных каналов и нейромедиаторов перевозчиков имеет первостепенную роль в создании синаптическую пластичность 8-11 и реагирования на наркотики 12-15, в конечном счете, влияющих возбудимость нейронов и синаптических ответов. На сегодняшний день большинство исследований нейронных торговли людьми полагаться либо на гетерологичными систем экспрессии или культивируемых первичных нейронов, ни один из которых может надежно отражают механизмы на игре у взрослых нейронов. Здесь мы сообщаем подход, который использует поверхностную биотинилирование количественно измерить уровни поверхностного белка в острых срезах мозга, полученных из взрослых грызунов. Используя этот подход, мы представляем данные, демонстрирующие, что мышь полосатой переносчиков дофамина быстро усваивает в реОтклик на форболового эфира опосредованного протеинкиназы С (РКС) активации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Вся обработка животных и сбор урожая ткани проводили в соответствии с руководящими принципами университета Массачусетс медицинской школы Комитета Уходу за животными использования (IACUC), следуя утвержденной протокол № A1506 (Меликян, PI).
Обязательные решения
Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) - Сделать свежий ежедневно
125 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,2 мМ NaH 2 PO 4, 1,2 мМ MgCl 2, 2,4 мМ CaCl 2, 26 мМ NaHCO 3, и 11 мм глюкозы
Примечание: Подготовка ACSF в виде исходного раствора 10x, за исключением NaHCO 3 и глюкозы. Сделать 1x рабочие растворы ежедневно с 10-кратным складе, дополняя свежего NaHCO 3 и глюкозы.
Сахароза-дополняется ACSF (SACSF) - Сделать свежий ежедневно
250 мМ успешнорозы, 2,5 мМ KCl, 1,2 мм NaH 2 PO 4, 1,2 мМ MgCl2, 2,4 мм CaCl 2, 26 мМ NaHCO 3, и 11 мМ глюкозы
Примечание: Подготовка SACSF в виде исходного раствора 10x, за исключением NaHCO 3 и глюкозы. Сделать 1x рабочие растворы ежедневно с 10-кратным складе, дополняя свежего NaHCO 3 и глюкозы.
Сульфо-N-hydroxysuccinyl-SS-биотин (сульфо-NHS-SS-биотин, Pierce Chemical Company)
Маточные растворы должны быть 200 мг / мл в ДМСО и устойчивы к нескольких циклов замораживания / оттаивания. Аликвоты хранили при -20 ° С. Сукцинил эфир быстро гидролизуется в водном растворе, так рабочие растворы следует готовить непосредственно перед нанесением на ломтики.
Кусочек Quench Решение
ACSF дополнен 100 мМ глицина
РИПА Lysis Buffeг
10 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1,0 мМ ЭДТА, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na деоксихолат
РИПА с ингибиторов протеазы (РИПА / PI) - Сделать свежий ежедневно
RIPA с добавлением 1 мкМ лейпептина, 1 мкМ пепстатина, 1 мкМ апротинина и 1 мМ фенилметил сульфонил фторид.
1. Подготовка мозга фрагменты
- Сделать свежий 1x SACSF и 1x ACSF
- Холод SACSF на льду в небольшой стакан. Эта информация будет использоваться для хранения свежесобранных мозг мыши.
- Пропитайте ACSF и SACSF с кислородом путем пропускания с 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 мин на льду.
- P30-38 мыши должны использоваться для оптимальной жизнеспособности ткани. Жертвоприношение животных путем смещения шейных позвонков и обезглавливания, и быстро удалить мозги в prechilled, насыщенный кислородом SACSF.
- Использование вибрирующий микротом, составит 300 срезы головного мозга мкм в интересующей области.
- При желании, ломтики могут быть дополнительно расчлененные до восстановления для обогащения конкретных областях мозга или отдельной правым и левым полушариями, чтобы использовать как контрольной и экспериментальной ломтиками, соответственно.
- Использование огневой полировкой пипетки Пастера, передать ломтиками, чтобы сетка дном камеры, установленные в 24-луночных планшетах.
- Разрешить кусочки, чтобы восстановить в течение 40 мин, 31 ° С в ACSF кислородом, при непрерывном барботировании, нежный.
2. Лечение наркотиками (в случае необходимости) и ломтик Биотинилирование
- После восстановления, мыть ломтики 3x в нагретого (37 ° C), насыщенный кислородом ACSF пузырьков постоянно с 95% / 5% O 2 / CO 2.
- Добавить тестируемых соединений и инкубировать с непрерывным оксигенации.
- Для удобства, добавьте 1/10 объема 10х концентрированного препарата, и смешать, аккуратно переворачивая.
- Взболтать слегка пластины в водяной бане при желаемой температуре.
- После медикаментозного лечения, быстрохолод ломтики промывкой 3 раза в ледяной ACSF.
3. Biotinylate поверхностных белков
- Подготовка 1,0 мг / мл сульфо-NHS-SS-биотин в ледяной ACSF непосредственно перед маркировкой.
- Добавить 0,75 мл сульфо-NHS-SS-биотин, чтобы ломтики и инкубировать ломтиками на льду, 45 мин.
- Промыть ломтики три раза быстро ледяной ACSF, затем инкубируют в течение 10 мин в ледяной ACSF на льду.
- Вымойте ломтики три раза ледяным буфером ломтик закалки и инкубировать с 0,75 мл ломтик резкого буфера два раза, 25 мин, на льду, чтобы утолить бесплатно сульфо-NHS-SS-биотин.
4. Подготовка Tissue лизаты
- Вымойте ломтики три раза в ледяной ACSF и передать каждый ломтик в микроцентрифужных трубки с помощью огневой полировкой пипетки Пастера.
- Аккуратно осаждения кусочек путем центрифугирования 200 мкг, 1 мин и тщательно аспирации оставшиеся ACSF.
- Добавить 400 мкл ледяной RIPA / PI и разбить ткани с помощью пипетки вверх и вниз, как только через P200 пипсEtte.
- Передача диссоциируют среза / RIPA в свежую пробирку и инкубируют 30 мин, 4 ° C, вращение, чтобы завершить лизис.
- Гранул распада клеток путем центрифугирования, 18000 XG, 15 мин, 4 ° С
- Определение концентрации лизата белка с помощью анализа белка ВСА, с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в качестве стандарта.
5. Изолировать Биотинилированные Белки
- Оптимизация / общее соотношение белка бисера.
Примечание: индивидуальные уровни экспрессии белка может варьироваться в широких пределах в разных областях мозга. Если все биотинилированного белка в данном количестве тканей лизата не захвачен, это не возможно точно определить любые потенциальные изменения в экспрессии поверхности. Поэтому крайне важно, чтобы эмпирически определить оптимальный / общее соотношение белка шарик для конкретного региона белок / мозга, до начала работы на новом исследовании ломтик биотинилирования.- Выдержите 25 мкл стрептавидин агарозном бисером с увеличением количествас тканевой лизата (примерный диапазон 25-200 мкг), а затем действуйте, как описано ниже для связывания, стиральные и элюирования шаги.
- Количественная полученные иммунореактивные группы и выбрать соотношение шарик / лизата в линейном диапазоне связывания которые позволят обеспечить точный количественный анализ либо увеличивается или уменьшается выражение поверхности белка.
- Подготовка Стрептавидин-агарозы
- Определение общего объема шарика, необходимую для всех образцов. Подготовка достаточный объем шарик на эту сумму плюс одна посторонняя (т.е. 4 образцов при 25 мкл / образец = 100 мкл бисер + один дополнительный = 125 мкл бисером.
- Vortex Стрептавидин шарик акции и пипетки из требуемого объема. При использовании P200 пипетки, отрезать конец наконечника для предотвращения блокировки или шарик ущерб.
- Вымойте бисером 3 раза в 0,5-1,0 мл RIPA / PI удалить консервантов, вихревание после каждого RIPA того и коллекторов бусы между моет путем центрифугирования 18000 мкг, 1 мин, при комнатной нравратура.
- Аспирируйте от буфера между стирок с использованием стекла пипетки Пастера, прикрепленный к вакуумной колбе. Пластиковая P200 наконечник прикреплен к концу стекло пипетки Пастера обеспечивает более точное управление при аспирации. Это не обязательно, чтобы удалить абсолютно все буфера в течение первых двух стирок, так как он рискует аспирационные бусы в пипетку. После последней промывки, удалить как можно больше избыточный буфер, насколько это возможно без аспирации шарики.
- Добавить RIPA / PI довести шарики обратно к своему первоначальному объему, пипетки вверх и вниз, чтобы ресуспендируют. Избегать вихревание в этой точке, как бисер будет прилипать к стенке трубы.
- Алиготе шарики в микроцентрифужных пробирок с помощью Р200 с наконечником отрезаны. Внесите вверх и вниз несколько раз между выборки для обеспечения шарики остаются равномерно приостановлено и рассеянный между трубками.
- Привязка биотинилированные белки со стрептавидином шарики
- Распределить клеточных лизатов в пробирки, содержащие агарозном бисером. Для экспериментов Whe вновь сравниваются несколько образцов, не забудьте использовать такое же количество белка для каждого образца для точных сравнений.
- Добавить дополнительную RIPA / PI довести до образцов к 200 мкл минимальном объеме. Это гарантирует, что образцы будут смешивать адекватно во время инкубации, а также объединяет концентрации белка по образцам.
- Поместите трубки в трубчатой ротатора и смешивать в течение ночи при 4 ° С.
- В отдельных трубок, обойтись эквивалент общего объема лизата, используемой для каждого образца. С другой стороны, если образец высоких объемах, часть от общего объема лизата могут быть зарезервированы вместо этого, чтобы приспособить максимальных объемов нагрузка на ПААГ с ДСН. Они будут использоваться для нормализации поверхностной экспрессии к общему количеству белка.
- Добавить либо равным объемом 2х или 1/5 объема 6x SDS-PAGE образца буфера и либо инкубировать при температуре 4 ° С, параллельно с образцами шариков или хранить при -20 ° С до образцы не анализировали.
- Гранул бусы путем центрифугирования 18000 мкг, 2 мин, при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатантные и мыть шарики три раза 0,75 мл RIPA. Чтобы свести к минимуму потери шарик, оставить небольшой объем головы буфера выше бисером между стирок. После последней промывки, удалить как можно больше RIPA, насколько это возможно, без нарушения шарик гранул.
- Элюции биотинилированные белки стрептавидином шариков за счет уменьшения дисульфидную связь. Добавьте 25 мкл 2x SDS-PAGE уменьшая образец буфера, вихрь также и вращать образцы 30 мин, комнатной температуры.
Примечание: Многие мембранные белки имеют высокую тенденцию к агрегации при кипячении в SDS-PAGE образца буфера, сильно ухудшая их электрофоретической подвижности. Если это имеет место для белка под следствием, во избежание нагрева образцов и, вместо этого, элюируют медленно при комнатной температуре. Если кипящей абсолютно необходимо (например, если другой белок оценивали параллельно требуется кипячение), SAMPLе буфер может быть дополнена 2 М мочевины (конечная концентрация) для сведения к минимуму агрегации. В то время как эффективность в снижении агрегации в некоторых случаях, мочевина часто ставит под угрозу появления полос. - Анализ образцов с помощью иммуноблот.
- Оттепель всего образцы лизатов и поверните параллельно с образцами Бисера, 30 мин, комнатной температуры.
- Отдельные белки на ПААГ с ДСН.
- Определить белок (ы) интересов иммуноблоттингом.
- Убедитесь, что полосы обнаружены в линейном диапазоне обнаружения для правильного количественного определения.
- Чтобы гарантировать, что биотинилирование реагент не получил доступ к внутриклеточных белков с помощью поврежден / скомпрометированных клеток. Это лучше всего достигается иммуноблоттингом параллельно для внутриклеточного белка, характерные для этого типа клеток, ведется расследование.
- Количественная плотность диапазона и рассчитать относительную белка поверхностную плотность в процентах от общего уровня экспрессии белка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Нейронов допамина транспортер интернализуется в ответ на РКС активации в клеточных линиях 16-20. Несмотря на многие докладов, демонстрирующих РКС-индуцированные потери DAT поверхности в различных клеточных линий и систем экспрессии, она была сложной, чтобы подтвердить этот вывод в культивируемых дофаминергических нейронов 21-23. Мы использовали мыши ломтики стриарные непосредственно проверить усваивает ли DAT в ответ на РКС активации у взрослых дофаминергических нейронов. После получения среза, сре...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на многолетний знаний, которые эндоцитотический оборот критически воздействия синаптической передачи сигналов в мозге, она оказалась сложной для количественного измерения изменения в экспрессии поверхностных белков у взрослых нейронов. В этой работе мы сообщаем надежный подход маркировать поверхностный белок Экс Vivo при острых срезах мозга. Мозг ломтик препараты имеют давнюю историю утилита для электрофизиологических записей, как они утверждают, синаптические связи и жизнеспособность клеток до часов п...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких финансовых интересов, которые конфликт с этой работы.
Благодарности
Эта работа финансировалась за счет грантов НИЗ DA15169 и DA035224 в HEM
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| sulfo NHS-SS-биотин | Pierce | 21331 | |
| стрептавидин агарозный | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovaine serum | albumin Sigma | A3059 | |
| Вибрирующий микротомный секционер | различные | ||
| Встряхивающая водяная баня | различные | ||
| Millicell сетчатые вставки с дном (8 & микро; m размер пор) | Millipore | PI8P 012 50 | Их можно стирать вручную и использовать повторно |
Ссылки
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
