Методическая статья

Последовательный В естественных условиях Визуализация остеогенные стволовых / клеток-предшественников во время разрушения Ремонт

DOI:

10.3791/51289

⸱

23 мая 2014 г.

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Stem Cell Institute, 2Wellman Center for Photomedicine and Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественное измерение функции костного предшественников в лечении переломов требуется технологию серийного изображений с высоким разрешением. Здесь, протоколы предназначены для использования прижизненной микроскопии и отслеживание костно-клонов, чтобы последовательно изображение и количественной оценки миграции, пролиферации и дифференцировки остеогенных эндогенных стволовых клеток / клеток-предшественников в процессе ремонта переломов костей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кость переворачивается непрерывно и настоятельно регенеративная следующие травмы. Остеогенные стволовых клеток / предшественников уже давно предположили существование, но в естественных условиях демонстрации таких клеток только недавно были достигнуты. Здесь естественных условиях методы визуализации в исследовать роль эндогенных остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников (OSPCs) и их потомство в ремонте костной предоставляются. Использование костно-клонов клетки трассировки модели и прижизненной визуализации индуцированных микротрещин в свода черепа кости, OSPCs можно непосредственно наблюдать в течение первых нескольких дней после травмы, в которых критические события в начале процесса восстановления произойти. Сайты Травмы могут быть последовательно отображены показывая, что OSPCs переехать в травме, увеличение числа и дифференцируются в остеобласты костных формирования. Эти методы предлагают средства исследования роли стволовых клеток внутренних и внешних регуляторов молекулярной для регенерации и восстановления костей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дегенеративные заболевания костей и возрастная потеря костной приводит к высокому риску остеопороза переломов стала одной из основных проблем в области общественного здравоохранения 1. Обслуживание Кость контролируется, формирующие костную остеобластов и костных резорбции остеокластов. Дефекты клеток костного формирования являются основной причиной возрастной потери костной ткани и дегенеративных заболеваний костей 2,3. В то время как обширные исследования были направлены на улучшение заживления переломов, открытие надежных препаратов для лечения дегенеративных заболеваний костей и переломить слабость переломов остается важным вопросом. Таким образом, изучение источник клеток костного формирования и их механизмов контроля в регенерации и восстановления костей обеспечивает новый представление для повышения скелетных регенерацию и обратить вспять заболеваниями потери костной массы.

Существование мультипотентными мезенхимальных клеток в костном мозге была предложена на основании идентификации клоногенных населения, которые могли бы иначеИАТЭ в остеогенные, Adipogenic и хондрогенные клоны экс естественных 4. Недавно несколько исследования показали, что скелетные / мезенхимальные стволовые клетки (КСЭ / МСК) являются естественным источником остеобластов и имеют решающее значение для костной ткани, реконструкции и ремонта трещин 5,6 . Кроме того, наша линия трассировки исследование показало, что зрелые остеобласты имеют неожиданно короткий период полураспада (~ 60 дней) и постоянно пополняется за счет их стволовых клеток / клеток-предшественников как в нормальных гомеостатических и ремонт перелом условиях 6. Тем не менее, личность в естественных условиях из стволовых клеток и как такие клетки реагируют на перелом травмы и поставить клетки костного формирования неясны. Таким образом, важно разработать метод, который способен анализировать миграции, пролиферации и дифференцировки эндогенных SSCS / МСК в в физиологических условиях.

Перелом ремонт многоклеточным и динамичный процесс регулируется массив комплексацитокины и факторы роста 7. Самый популярный подход для изучения разрушения является использование животную модель с переломом долгосрочной кости и проанализировать кости, кости срезов и методов иммунофлуоресцентных 8-10. Этот процесс ремонта можно контролировать с помощью нескольких методов визуализации в том числе микро-КТ 11, ближней инфракрасной флуоресценции 12 и ХЛ изображений 13. Однако каждый метод имеет определенные ограничения и не было эффективного способа контролировать функцию КСЭ / MSC на клеточном уровне в естественных условиях. Недавно конфокальной / двухфотонного прижизненной микроскопии был разработан и используется для обнаружения трансплантированных раковых клеток и гемопоэтических стволовых клеток в контексте их микросреды костного мозга даже при разрешении одноклеточного в живых животных 14. Объединив эту технологию с серией моделей трассировки линии преемственности, мы смогли определить, что клетки остеогенной стволовых / предшественники могут быть генетически отмечен переходного переменного токативации сопротивления myxovirus -1 (Mx1) промоутер и MX1-индуцированной предшественников может поддерживать большинство зрелых остеобластов в течение долгого времени, но не участвуют в генерации хондроцитов у взрослых мышей 6. Кроме того, мы показали, что Mx1 меченные OSPCs поставлять большинство новых остеобластов в трещины исцеления 6.

Здесь, используя модели отслеживания костно-происхождение и прижизненный микроскопии, протокол обеспечивается определить Vivo кинетики в из MX1 + остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников в репарации переломов. Этот протокол предлагает последовательный воображение для того чтобы отслеживать перемещение остеогенных шток / предшественников в сайтах разрушения и количественное измерение расширения osteoprogenitor в начале процесса восстановления. Этот подход может быть полезен в нескольких контекстах, включая оценки терапевтических кандидатов для улучшения восстановления костей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Мыши и Предобусловливание

Примечание: Все Мышей содержали в свободных от патогенов условиях и все протоколы были одобрены уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) на Массачусетского общего госпиталя на. Все операции должны проводиться в стерильных условиях с использованием автоклавного стерильного оборудования. Mx1-Cre 15, Rosa26-LoxP-стоп-LoxP-EYFP (Rosa-YFP), и Rosa26-LoxP-стоп-LoxP-tdTomato (Rosa-Помидор), были приобретены у Jackson Laboratories. мышей Остеокальцин-GFP были предоставлены доктором Генри Кроненберга. Для количественного анализа OSPC миграции и пролиферации в естественных условиях, были использованы Mx1-Cre + Роза-YFP + (одиночный цвет-репортер) мышей. Для получения более подробной отслеживания их дифференцировки в остеокальцина + зрелые остеобласты, мы использовали тригенный Mx1-Cre + Роза-Помидор + Ocn-GFP +мышей.

  1. Чтобы пометить MX1 + клеток в живом организме, подготовить полиинозиновую-полицитидиловая кислоту (PIPC, 2,5 мг / мл) в стерильный раствор PBS и вводят 200 мкл на 20 г Mx1-Cre + репортера мыши внутрибрюшинно один раз через день в течение 10 дней.
  2. Для устранения резидентные MX1 + гемопоэтических клеток, облучать мышей с одной дозой 9,5 Гр. После 24 часов облучения трансплантации дикого типа клеток костного мозга (1x10 6 клеток / мышь) внутривенно 16. Примечание: С Mx1-индуцибельные клетки включают гемопоэтические клетки и гемопоэтические полученных остеокластов, ликвидацию MX1 + гемопоэтических клеток улучшает качество изображения и количественный анализ MX1 + остеогенных клеток.
  3. После трансплантации костного мозга, контролировать животных для четырех до шести недель для того, чтобы добиться успешного репопуляции клеток донора костного мозга.

2. Моприменению препарат

  1. Обезболить мышь внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл кетамин / ксилазином (100 мг / кг, ксилазин 12 мг / кг веса тела) с использованием утвержденных IACUC процедуру. Примечание: Продолжительность эффекта может быть продлен на дополнительные дозы кетамина / ксилазина.
  2. Определите, если мышь полностью под наркозом в связи с отсутствием реакции на пальце ноги и / или хвоста пинчах. (Необязательно) Когда мышь находится под наркозом, обеспечить себе ИФ противогаз над носом, записывая на пленку. Отрегулируйте уровень изофлураном обеспечить животное полностью отключке.
  3. Клип волос головы с помощью электрического триммера или маленькие ножницы. Удалите фрагменты волос и стерилизовать открытые участки кожи с 70% спиртовым тампоном. Применить слезоточивый гель для предотвращения роговицы обезвоживание.

3. Микрофактуры Травма

  1. Убедившись, что животное полностью отключке, сделать один обратный Г-образный надрез, чтобы открыть кожу головы. Вкратце, сделать первый поперечный разрез (менее 1 см) ЗАПУСКнг от одного уха к другому уху. Включите ~ 60 ° и продолжают надрезать к носу, пока ~ 2-3 мм от носа. Примечание: Этот разрез минимизирует образование рубцовой ткани выше области для включения в образ.
  2. Отделите кожных лоскутов, потянув к сторонам щипцами. Оба лобные кости и пересечение сагиттальной и корональной швов должны быть четко подвергается.
  3. Очистите открытую поверхность с помощью промывки стерильной PBS и нежным вытирая стерильными марлевыми или ватными тампонами, пока все остаточные волосы не будут устранены.
  4. Для генерации микротрещины на свода черепа, держать голову мыши с одной стороны и 30 г иглу с другой стороны. Сделайте микро-прокола (~ 0,2 мм Диаметр рану <глубине 1 мм) на левой лобной кости недалеко от пересечения сагиттальной и корональной швов, вставив кончик иглы 30 G с легким нажимом и скручивания движение. Внимание: Очень важно, чтобы избежать иглу от проникновения в мозг, тем самым минимизируя bleediнг и повреждение тканей.
  5. Перейти к большей иглой (20 или 25 г) и расширить отверстие прокола, поворачивая иглу (~ диаметром 0,5 мм).
  6. Повторите шаг 3,3-3,5 генерировать второй прокол на противоположной лобной кости.
  7. Протрите раненых пятна от непрерывного падения ФСБ пока кровотечение не остановится.
    Примечание: Кровотечение на сайтах разрушения будут мешать соответствующей визуализации и вызывают образование рубцов.
  8. Нанесите каплю стерильного физиологического раствора соли или 2% Methocel на черепе, чтобы избежать высыхания. Примечание: Не дайте поверхности черепа, чтобы высохнуть, что позволит снизить четкость изображения. Важно использовать достаточное количество геля или физиологического раствора, чтобы покрыть область.

4. Прижизненной визуализации

  1. (Необязательно) Перед изображений, некоторые мыши инъецируют сосудистого красителя, чтобы визуализировать кровеносные сосуды. Введите ретро-орбитально с 20 мкл нецелевой Qtracker 705 (2 мкМ раствора в 50 мМ боратного буфера) разводили в 80 мл PBS. Используйте инсулиновый шприц, чтобы минимизировать реагента отходов. Если сигнал не достаточно яркий, дополнительные суммы могут потребоваться.
  2. Включите сканер. Примечание: Полигон основе лазерный сканер позволяет одновременно приобретение многоканального изображения в скорости видео (30 кадров в секунду). Сканирование Скорость видео очень важно для получения изображений живых животных.
  3. Включите многофотонной лазера (фемтосекундных титан-сапфирового лазера). Установите длину волны в 880 нм и регулировать мощность для генерации второй гармоники томографии (440 нм) кости. Для возбуждения GFP и tdTomato, включите 491 нм и 561 нм твердотельных лазеров.
  4. Включите ФЭУ (ФЭУ) детекторов для каждого сигнала (435 ± 20 нм полосовой фильтр для генерации второй гармоники, 528 ± 19 нм полосовой фильтр для GFP, и 590 ± 20 для tdTomato.) (Необязательно) Используйте 638 нм гелий-неоновый лазер и PMT с 695 ± 27,5 нм полосового фильтра для обнаружения Qtracker 705 сигнал.
  5. Плаце животное на XYZ-оси этапе моторизованный микроскоп. Держите мышь в наиболее удобном положении с электрическим грелку, чтобы помочь поддерживать температуру тела (это снижает риск потери животного). Используйте ленту, чтобы держать мышь, чтобы минимизировать движение во время съемки и сохранить изображаемого область в максимально горизонтальном положении.
  6. Нанесите каплю теплого 2% метилцеллюлозы гель или физиологического раствора на черепе, чтобы избежать высыхания. Поставьте покровного стекла на область изображения. Используйте низкий увеличения объектива (30x воды погружение объективную 0,9 NA) для сканирования черепа.
  7. Использование контроллера XYZ-оси, найти поверхность свода черепа по сигналу ГСП из костей и определить критическую местоположение ориентир, например, пересечении между сагиттальной швов и корональных швов. Приобретать изображение и записывать координаты XYZ.
  8. Продолжайте искать расположения травмы, наблюдая ГСП и сигналов флуоресценции.
  9. Когда сайты травмы или регион ое интерес найдены, получить изображение лучшего фокальной плоскости, содержащей SHG и флуоресценции сигналов от клеток, представляющих интерес. Сохранить XYZ координаты и расстояние до пересечения сагиттальной и корональной швов, чтобы определить их точное местоположение для следующих раундов изображений.
  10. Для сбора 3D клеточные и костных структур травмы перелома, запись изображений по Z-стеки (2 - 5 интервальных мкм) с ~ 100 мкм глубине от эндостальной поверхности кости. После завершения визуализации одной стороне травмы, повторите обработку изображения для соседних участков травмы.

5. Сообщение Операция Процедуры

  1. После обработки изображений, промыть сайт изображений с стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить метилцеллюлозы гель из черепа. Используя стерильный ватный тампон, нанесите небольшое количество тройной мазь с антибиотиком на поверхности. Обложка кожных лоскутов и вновь закрыть головы хирургическим наложения швов. Это может быть сделано с гипоаллергенным наложения швов нити (рассасывающиеся полиглактин сутуры) и 5-0 размер шва игла. Внимание: Хорошая техника наложения швов минимизирует образование рубцов.
  2. Лечить всех животных с IP инъекции 0,05-0,1 мг / кг бупренорфина каждые 12 ч в течение 48 ч после операции. Держите животных в теплом камеры восстановления, пока они не восстановить достаточную сознание. После 3 до 5 дней, снова откройте шов и повторите прижизненной шаги визуализации для отслеживания сотовый изменения во время заживления переломов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стабилизировалась долго модель перелом кости был популярен в исследованиях разрушения. Тем не менее, длинная кость или большие модели разрушения вызвать многократное повреждение тканей и, следовательно, имеют ограничение в количественном измерении функции костных клеток. Мы разработали минимально инвазивной травмы (диаметр менее 1 мм с минимальным или вообще без вторжения в твердой мозговой оболочки) на свода черепа лобных костей с иглой бурения (1А-1С). Мы выбрали вид сверху на свода черепа лобных кост...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регулирование скелетных стволовых клеток может иметь большое значение для определения более совершенных методов для достижения регенерации кости. Количественный и порядковый изображений на клеточном уровне была технически сложной задачей. Хотя модель перелом длинных костей мыши широко используется и подходит для биомеханических исследований 17, его расположение глубоких тканей, неровный размер перелом, повреждение мягких тканей, а также применение стабилизирующих фиксаторов ограничили последовательный прижизн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим С. парк за чтение рукописи. Эта работа была поддержана NIAMS под Award Количество K01AR061434 и лейкемии и лимфомы общества стипендий премии (5127-09) в DP и гранты Национальных Институтов Здоровья в CPL и DTS Содержание несут их авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6J (H-2b)Jackson Laboratories (Бар-Харбор, Мэн)000664
Кетамина гидрохлорид для инъекцийBionichepharma67457-001-10  Объем флакона: 10 мл (50 мг/мл)
Стерильный раствор ксилазинаLloyd Inc.NADA# 139-236
Бупренорфин HlBEDFORD LABNDC 55390-100-10Флакон: 0,3 мг/мл, Дозы: 0,05-0,1 мг/кг
DPBS, 1XCORNING cellgro21-031-CV
Спиртовые подушечки для приготовления спирта (70% изопропилового спирта)Kendall WEBCOL5110
Тонкие хирургические ножницыF.S.T14568-09
Сверхтонкие щипцыF.S.T11150-10
VICRYL*Plus Шовный материалEthiconVCP490G
Qtracker 705 нецелевые квантовые точкиInvitrogenQ21061
Methocel 2%OmmiVision
pIpC (полиинозин-полицитидиловая кислота)   SigmaP0913-50MG100 μ л (2,5 мг/мл в PBS) для 10 г мыши
Mai Tai Tunable Ultrafast LasersSpectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 нм DPSS лазерCobolt AB
Radius-635 HeNe лазерCoherent

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Intravital ImagingCalvarial BoneMX1 Positive CellsBone Marrow TransplantationMicrofracture GenerationSequential ImagingStem Cell Tracking

Похожие статьи