Method Article

Выражение, изоляция, и очистка растворимых и нерастворимых Биотинилированные белков для нервной ткани Регенерация

DOI:

10.3791/51295

⸱

January 22nd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка biotinylatable слитые белки имеет много потенциальных применений в различных областях исследований. Рекомбинантный инженерно белок является прямым процедура, которая является экономически эффективным, обеспечивая высокие урожаи специально разработанных белков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантный инженерно белок используется кишечной палочки (E.coli) системы экспрессии на протяжении почти 4 десятилетия, а сегодня Е. палочка по-прежнему наиболее широко используется организмом-хозяином. Гибкость системы позволяет добавлением фрагментов, таких как биотин тега (для стрептавидином взаимодействий) и больших функциональных белков, как зеленый флуоресцентного белка или вишнево-красного белка. Кроме того, интеграция неестественных аминокислот, таких как ионов металлов хелаторов, однозначно активных функциональных групп, спектроскопических зондов, и молекул, придающих пост-трансляционные модификации позволило лучше манипулирование свойствами белковых и функциональных возможностей. В результате этот метод создает настраиваемые слитые белки, которые предлагают значительные утилиту для различных областях исследований. Более конкретно, biotinylatable последовательность белка были включены в многих белков-мишеней вследствие высокой аффинности взаимодействия между биотина с авидином и стрептавидином. Это дополнение помог в повышении обнаружения и очистки меченых белков, а также открывая путь для вторичных приложений, таких как сортировки клеток. Таким образом, биотин-меченых молекул показать все большую и широкую влияние в Биоиндастриэл и биомедицинских областях. Для целей нашего исследования мы разработали рекомбинантных белков биотинилированное слияния, содержащие фактор роста нервов (ФРН) и semaphorin3A (Sema3A) функциональные области. Мы сообщали ранее, как эти белки слияния биотинилированный, вместе с другими активными белковых последовательностей, могут быть привязаны к биоматериалов для тканевой инженерии и регенеративной целей. Этот протокол описывает основы инженерной biotinylatable белков в масштабе миллиграмм, используя Т7 лаковые индуцибельную вектор и E. палочки хозяева выражения, начиная с преобразования масштабирования и очистки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки охватывают широкий диапазон биомолекул, которые отвечают за многих биологических функций, в конечном счете, приводит к правильного формирования тканей и организации. Эти молекулы инициировать тысячи путей, которые контролируют до регулирования и / или понижающей регуляции генов и других белков сигнализации, поддержания равновесия в человеческом теле. Срыв одного белка влияет весь этот веб сигналов, что может привести к возникновению разрушительных расстройств или заболеваний. Инженерно отдельные белки в лаборатории предлагает одно решение для борьбы с этими отрицательных последствий и предлагает альтернативу низкомолекулярных препаратов. В 1977 году, ген, кодир....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование белок-мишень

  1. Использование Национальный центр биотехнологической информации веб-сайта (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) получить аминокислотную последовательность для белка-мишени с учетом видов интереса и любых вариантах сплайсинга. Выбор аминокислотную последовательность, которая соответствует активной области, представляющей интерес белка.
    Примечание: Для Sema3A, аминокислоты 21-747 были выбраны. Слитый белок был разработан с NGF где последовательность барстара, аминокислоты 1-90, был добавлен к NGF аминокислот 122-241.
  2. Для N-конец добавить последующие последовательности: 6X-Его тегов для очистки (HHHHHH)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клонирование и испытаний Выражение

Когда покрытие выполняется должным образом, одной изолированной колонии должны сформировать увеличить шансы выщипывание клональная трансформированные клетки бактерий (рис. 2а). Однако, если слишком много клетки высевают, планшеты инкубировали слишком долго при 37 ° С или трансформации сомнительна, колонии может покрывать агаром или образуют более крупные агрегаты клеток (фиг. 2В и 2С). Во в.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантный инженерно белок является очень мощная техника, которая охватывает множество дисциплин. Он является экономически эффективным, перестраиваемый и относительно простая процедура, что позволяет производство высокими выходами специально разработанных белков. Важно отметить, что проектирование и выражая белки-мишени не всегда просто. Базальной выражение и рекомбинантный стабильность белков зависит от конкретных вариантов вектора, E. штаммы кишечной клеток, дополнения тегов пептидные и параметры.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность в Университете Акрона за финансирование, которое поддерживает эту работу.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Дитио-DL-треитол, DTT, 99,5%Chem-Impex International127100 г
2-Гидроксиэтилмеркаптан β-МеркаптоэтанолChem-Impex International642250 мл
Уксусная кислота, ледянаяEMDAX0073-92,5 л
АгарBioshopAGR001.500500 г
Ампициллина натрия соль Sigma-AldrichA951825 г
Пеногаситель 204Sigma-AldrichA6426500 г
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript США Inc.4 & микро; g
BL21(DE3) Компетентные клеткиNovagen69450 1мл; Экспрессия Хозяин
Брэдфорд реактивSigma-AldrichB6916500 мл
BugBusterNovagen70922-3100 мл
Гель фильтрация стандартBio-Rad151-19016 флаконов
ГлицеринBioshopGLY001.11 л
Гуанидин гидродиорид амиоформамидин гидрохлоридChem-Impex International1521 кг
His-Pur Ni-NTA СмолаThermo Scientific88222100 мл
соляной кислотыEMDHX0603-32,5 л
имидазола Chem-Impex International418250 г
IPTGChem-Impex International194100 г
Laemmli буфер для пробBio-Rad161-073730 мл
Лаурилсульфат натрия соль, Поверхность додецила натрияChem-Impex International270500 г
LB Бульон;  Sigma-AldrichL30221 кг
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 мл; Клонирование хозяина
фосфатный буферный физиологический растворSigma-AldrichP5368-10PAK10 упаковок
хлорида калияChem-Impex International012471 кг
Sema3A-pET-21a(+)GenScript США Inc.4 & микро; g
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 л
натрия хлоридSigma-AldrichS5886-1KG1 кг
гидроксид натрияFisher ScientificS318-500500 г
Натрия фосфат диаосновнойSigma-AldrichS5136-500G500 г
Натрия фосфат одноосновнойSigma-AldrichS5011500 г
Потрясающий бульонBioshopTER409.55 кг
тетрациклина гидрохлоридаChem-Impex International66725 г
Трис/Глицин/SDS Буфер, 10xBio-Rad16107321 л
Тризма БазаSigma-AldrichT15031 кг
Триптон, поджелудочная железаEMD 1.07213.10001 кг
Дрожжевой экстракт, ЭМД гранулированный1.03753.0500500 г
  Ä KTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Включает в себя комплекты и аксессуары
Настольный орбитальный шейкерThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Фермент поставляется с реакционными буферами и раствором биотина
Диализная кассетаThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Диализная трубкаSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25 000 и 50 000
Клапан переключения потока FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Набор для количественного анализа биотинаInvitrogen1094598
Frac-950 Штативы для трубок, штатив CGE Healthcare18-6083-13
Коллектор фракций FRAC-950GE Healthcare18-6083-00Включает в себя комплекты и аксессуары
Термостат с подогревом/охлаждением VWR13271-102Модель 1156D
Нагревательная печь серии FDСвязующее МодельFD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Снято с производства--Замена Продукт: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI AvantiCentrifuge Beckman Coulter393126
JA 25.50 РоторBeckman Coulter363055
JLA 8.1 РоторBeckman Coulter969329включает в себя 1 л полипорпиленовые бутылки
JS 5.3 РоторBeckman Coulter368690
Ламинарный проточный колпакThemo Scientific1849Forma 1800 series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel вертикальный система электрофореза
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-луночный гребень
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 мл  объем ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Источник питанияBio-Rad164-5052250 В, 3 А, 300 Вт
Круглое дно Трубки из полипропиленового сополимераVWR3119-005050 мл  трубки для ротора JA 25.50
Концентраторы Spin-X UFCorning431488, 431483  20 и 6 мл; MWCO: 10 000 Da
Subcloning ServiceGenScript США Inc.Ультразвуковой процессор Protein Services
 Cole-Parmer18910445AМодель CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Модель G560

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotinylated ProteinsE coli ExpressionAffinity ChromatographyProtein PurificationNerve Growth FactorSemaphorin3ASDS Page AnalysisFPLC PurificationNative IsolationNon native Isolation

Related Articles