Method Article

Сплит-и-бассейн Синтез и свойства пептида третичный амид библиотеки

DOI:

10.3791/51299

⸱

June 20th, 2014

 , 
1Scripps Florida, The Scripps Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидные третичные амиды (ПТС) представляют собой надсемейство пептидомиметиков, которые включают, но не ограничиваются ими пептидами, пептоиды и N-метилированных пептидов. Здесь мы опишем синтетический метод, который сочетает в себе как сплит-и-бассейн и стратегии суб-мономера для синтеза одной шарик один-соединение библиотеку ПТС.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидомиметики большие источники белка лигандов. Олигомерный природа этих соединений позволяет получить доступ к большой синтетические библиотеки на твердой фазе с использованием комбинаторной химии. Одним из наиболее хорошо изученных классов пептидомиметиков является пептоиды. Пептоиды легко синтезировать и было показано, что протеолиз устойчивых клеток и проницаемого. За последние десять лет, многие полезные белковые лиганды были определены через скрининга пептоидной библиотек. Тем не менее, большинство из лигандов, определенными по пептоидной библиотек не отображаются высокое сродство, за редким исключением. Это может быть обусловлено, в частности, с отсутствием хиральных центров и конформационных ограничений в пептоидной молекул. В последнее время мы описали новый путь синтеза для доступа пептидные третичные амиды (ПТС). ПТС представляют собой суперсемейство пептидомиметиков, которые включают, но не ограничиваются ими пептидами, пептоиды и N-метилированных пептидов. С боковых цепей на обоих α-углерода и основных атомов азота цепь,конформация этих молекул значительно сдерживается стерических препятствий и аллильном 1,3 деформации. (Рис. 1) Наше исследование показывает, что эти молекулы PTA которые хорошо структурированы в растворе и может быть использован для идентификации белковых лигандов. Мы считаем, что эти молекулы могут быть будущий источник высоким сродством белковых лигандов. Здесь мы опишем метод синтеза сочетающего в себе мощь как сплит-и-бассейном и стратегий суб-мономера для синтеза образец один-шарик один-соединение (OBOC) библиотеки ПТС.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидомиметики являются соединения, которые имитируют структуру природных пептидов. Они предназначены, чтобы сохранить биологическую активность, преодолевая некоторые из проблем, связанных с природными пептидами, в том числе проницаемости клеток и устойчивости к протеолизу 1-3. В связи с олигомерной природы этих соединений, большие синтетические библиотеки могут быть легко доступны через мономерных или суб-путей синтеза мономерных 4-7. Одним из наиболее изученных классов пептидомиметиков является Пептоиды. Пептоиды являются олигомеры N-алкилированных глицинов, которые могут быть синтезированы легко использует стратегию, суб-мономера 8, 9. Много полезных белковых лигандов были успешно идентифицированы из скрининга больших синтетических пептоидной библиотеки против белковых мишеней 1, 10-14. Тем не менее, "хиты", выявленные с пептоидной библиотек редко архив очень высокое сродство к белковым мишеням 1,10-14,22. Один маДжор разница между пептоиды и природных пептидов в том, что большинство пептоиды правило, не имеют способность образовывать вторичную структуру из-за отсутствия хиральных центров и конформационных ограничений. Для того, чтобы решить эту проблему, несколько стратегий были разработаны в течение последнего десятилетия, в значительной степени ориентируясь на модификации боковых цепей, содержащихся на основных атомов цепи азота 15-22. В последнее время мы разработали новый синтетический путь, чтобы представить природные боковые цепи аминокислот на пептоидной позвоночника создать пептидных третичные амиды 23.

Пептидные третичные амиды (ПТС) являются супер семья пептидомиметиков, которые включают, но не ограничиваются ими пептидов (R 2 = H), пептоиды (R 1 = H) и N-метилированных пептидов (R 1 ≠ H, R 2 = Me) . (См. рисунок 1) Наша синтетический путь нанимает природных аминокислот в качестве источника хиральности и боковых цепей на45;-углерод, и коммерчески доступные первичные амины, чтобы обеспечить N-замещения. Таким образом, большая химическая пространство, чем у простых пептидов, пептоиды или N-метилированных пептидов могут быть изучены. Спектры кругового дихроизма показали, что молекулы ПТА высоко структурированы в растворе. Характеристика одного из PTA-белковых комплексов четко показывает, что конформационные ограничения PTA требуются для связывания. В последнее время мы также обнаружили, что некоторые молекулы ПТА обладают улучшенной проницаемости клеток, чем их пептоидной и пептидных аналогов. Мы считаем, что эти ПТА библиотеки могут быть хорошим источником высоким сродством лигандов для белками-мишенями. В этой статье мы обсудим синтез образца один шарик один-соединение (OBOC) ПТА библиотеки в деталях, а также некоторые улучшения условий для муфт и расщепления этих соединений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Основы Сплит-и-бассейн синтеза

Для того чтобы эффективно генерировать большое количество соединений на твердой фазе, синтез сплит-и-бассейн часто используется в качестве общей стратегии. Как показано на рисунке 4, TentaGel шарики сначала раскол на три части. Каждая часть взаимодействует с другом реагента, генерации первого остатка на бусины. После первой реакции, все три порции объедин ют вместе, смешивают, а затем снова разделить на три части. Каждая часть будет снова реагируют с другом реагента, генерации второго остатка на бусины. После двух этапов сплит-и бассейн, девять соединения генерируются.

В синтезе суб-мономера, гранулы сначала делят на несколько частей в реакцию с различными бром кислот в присутствии конденсирующего реагента. После промывки растворителем, все шарики будут объединены вместе и смешивают, а затем снова разделить на несколько частей в реакцию с разнымипервичные амины. После аминирования, все шарики объединены вместе и тщательно промывают, завершив полный мономера на каждом борту. Этот процесс может быть повторен до достижения желаемого разнообразие.

2. Подготовка бромангидрид от природных аминокислот

В синтезе суб-мономера, синтез каждого мономера делится на два отдельных этапа: 1. Взаимодействие бромангидрид и 2 аминирования с первичных аминов (рис. 2).. Для синтеза пептидной третичного амида, бромиды хиральной кислотой с боковых цепей на альфа-углерод будет получен из природных аминокислот. Здесь мы описываем способ трансформации природной аминокислоты в соответствующий бромид кислоты с высокой точностью стерео. Мы используем аланин в качестве примера; другие аминокислоты, включая серин, треонин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аспарагин, глутамин, глицин, валин, изолейцин, фенилаланин также могут быть преобразованы в бром кислот под аналогичным кондинс. Обратите внимание, что некоторые из аминокислот с функциональными группами, такие как фенол, гуанидина и амина, должны быть защищены перед преобразованием. Установка реакции показана на рисунке 3.

Меры предосторожности: Для следующие реакции с участием HBr, Nano 2 и других агрессивных / токсичных химических веществ, надлежащее оборудование для обеспечения безопасности, как защитные очки, халате и химически устойчивые защитные перчатки необходимы. Все реакции должны быть выполнены в вытяжном шкафу опытным химиком.

  1. Добавить 370 мл воды в 630 мл 48%-ного раствора HBr с получением 1 л, 30%-ный раствор HBr. Добавить 500 мл этиленгликоля в 1 л ванны контейнера; добавить сухой лед, чтобы поддерживать температуру при -10 ° С. Внимание: 48%-ный раствор HBr сильно кислой и коррозию, соблюдайте осторожность. Прочитайте паспорт безопасности перед использованием.
  2. Добавить D-Аланин (8,9 г, 0,1 моль) и KBr (11,9 г, 0,1 моль) в 250 мл трехгорлую круглодонную колбу с магнитной мешалкой. Добавить 100 мл и 30% HBr, полученного в тон предыдущий шаг. Поместите колбу в баню гликоля этилена, полученного на стадии 2.1, и поддерживать температуру при -10 ° С. Bubble аргон через длинной иглой из нижней части колбы в течение 10 мин, как показано на рисунке 3. Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки при 300 оборотах в минуту.
  3. Растворить NaNO 2 (8,28 г, 0,12 моль) в 100 мл химическом стакане с 20 мл воды. Добавить раствор в уравновешивающей давление капельной воронкой и герметизации капельную воронку с перегородкой. Медленно поверните на клапане капельную воронку и пусть решение NaNO 2 падение в колбу. Управление клапаном для регулирования скорости капель примерно 2 капли в секунду. Продолжайте перемешивание при 300 оборотах в минуту и ​​поддерживать аргон восходящей со дна колбы. Колбу следует иметь в этиленгликоле бане при -10 ° С, пока все NaNO 2 не добавляется. Внимание: Этот шаг генерирует тепло и газ во время добавления NaNO 2 решения. Капель ставка должна быть тщательно конконтролируемых и вся система должна быть открыта через выход аргона.
  4. Продолжайте размешивать в течение еще 3 часа, и пусть температура согреться от -10 ° С до комнатной температуры. Полученный раствор должно быть ясно, светло-желтый; если цвет слишком темный, применить вакуум, чтобы удалить лишние оксидов азота и возможное Br 2, образующейся в процессе реакции.
  5. Извлечение продукта из раствора с 3-кратным 35 мл диэтилового эфира с использованием экстрагента воронку. Комбинат органической фазы и промойте его насыщенным раствором соли. Органическую фазу можно также промывают небольшим количеством NaHCO 3 до промывания солевым раствором, чтобы удалить цвет, если это темно. Органическую фазу сушат над Na 2 SO 4 в течение 6 часов.
  6. Отфильтровать Na 2 SO 4 и выпаривают растворитель в вакууме, сырой продукт должны быть получены ясно до бледно-желтого масла. Сырой продукт может быть дополнительно очищен путем перегонки при 115 ° С, 3 мм рт.ст., иликолонка с силикагелем смесью 3:1 гексан: этилацетат.
  7. Чистый продукт получают в виде прозрачного масла, 6,6 г (выход 74%), плотность = 1,69 г / мл, [α] D 20 = +24 ° (метанол), 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3) δ 4,41 (д, J = 7,0 Гц, 1H), 1,86 (д, J = 7,0 Гц, 3H). В случае (S)-2-бромпропановой кислоты-D 4 (полученного из D 4-L-аланин), чистый продукт получают в виде прозрачного масла, выход 78%, плотность = 1,72 г / мл, [α] D 20 = -19 ° (метанол). 1 H-ЯМР, никакого существенного сигнал H не наблюдается. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (ожидается 154,97). Для (S)-2-бром-4-метилпентановой кислоты (полученного из L-лейцина с использованием той же процедуры) чистый продукт получают в виде прозрачного масла, выход 89%, [α] D 20 = +37 ° (метанол), 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl 3) δ 4,30 (т, J = 7,7 Гц, 1H), 1,94 (дд, J = 10,8, 3,9 Гц, 2H), 1,81 (тт, J = 13,2, 6,5 Гц, 1H), 0,96 (дд, J = 18,2, 6,6 Гц, 7Н). В случае (S)-2-бром-3-Phenylpropanoic кислоты (полученного из L-фенилаланина с использованием той же процедуры) чистый продукт получают в виде бледно-желтого масла, выход 72%, [α] D 20 = +17 ° (метанол), 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3) δ 7,38 - 7,19 (м, 5Н), 4,42 (дд, J = 8,1, 7,3 Гц, 1H), 3,47 (дд, J = 14,2, 8,2 Гц, 1H), 3,25 (дд, J = 14,2, 7,2 Гц, 1H).

3. Изотопный Маркировка аланин Использование трансаминаз

В комбинаторной библиотеки синтеза, особенно в синтезе сплит-и-пула одного борта одного соединения (OBOC) библиотек, количество соединения, которое может быть получено из каждого шарика относительно мала. (Обычно от 1 до 10 пмоль нмоль). Кроме того, масс-спектрометрия широко используется для идентификации и характеризации конечного соединения в связи с его высокой чувствительности. Для того чтобы использовать масс-спектрометрии для определения абсолютной стереохимии при хиральных центрах конечных продуктов PTA, энантиомеры бром кислоты должно быть Исотоpically помечены перед использованием. Здесь мы опишем метод использования трансаминазу и D 2 O, чтобы этикетки L-аланин.

  1. Растворить L-аланина (300 мг, 3,36 ммоль) с 10 мл D 2 O в 50 мл полиэтиленовую трубку. Добавить α-кетоглутарата (10 мг, 0,068 ммоль) в качестве со-подложке. Разминка трубку до 37 ° С и отрегулируйте PD в 8,5-8,7 использованием soution 1 М NaOD. Примечание: PD определяется тест-полосок рН. Традиционный метр электро рН оснащен стеклянным электродом селективного для H + может дать неправильный зачитал для D +.
  2. Добавить аланин трансаминазы (0,1 мг, ЕС 2.6.1.2 от сердца свиньи, Roche Diagnostics, Индианаполис) ПФ 8,5 - 8,7, 37 ° С раствор, приготовленный из предыдущего шага. Положите трубку в 37 ° С инкубатор и инкубировать его на ночь с легким встряхиванием, предпочтительнее от 10 до 30 мин.
  3. После инкубации в течение ночи, взять 0,5 мл раствора D 2 O и проверить ход реакции с помощью 1 Н-ЯМР. Все протонные сигналыlanine, δ 3,76 (д, J = 7,2 Гц, 1H), 1,46 (д, J = 7,3 Гц, 3Н), 1 H ЯМР 400 МГц, должны быть существенно подавлена ​​в результате дейтерировании. Более 98% протона должен быть заменен на дейтерий, как описано выше 23. Примечание: D 2 O может быть частично восстановлена ​​путем перегонки если реакцию проводят в больших масштабах (> 200 мл D 2 O). Как правило, от 60% до 80% D 2 O может быть дистиллированной из раствора.
  4. Замораживание вышеуказанного раствора с жидким азотом и лиофилизации его с помощью лиофилизатора, чтобы получить белый дейтерированного L-аланин порошок.

4. Синтез пептоидной компоновщика области

Область линкер не требуется для синтеза библиотеки PTA. Однако для того, чтобы избежать высокий фон в нижнем диапазоне молекулярных веса (100-600) от MALDI масс-спектроскопии и улучшить ионизацию соединений, пептоидной линкер с несколькими полярных остатков часто используется. Это пептоидной линкег могут быть синтезированы с помощью стандартных пептоидной процедуры синтеза. Здесь мы будем синтезировать пентамера из N-метоксиэтил глицина в качестве линкера (как показано на рисунке 5).

  1. Выпуклость 90 мкм шарики TentaGel с ОЗУ линкер (1 г, 0,27 ммоль / г) в 10 мл ДМФ в течение 3 ч в 12 мл шприц реакторе с мягким встряхивании.
  2. Слить DMF из реактора и добавляют 10 мл 20% раствора пиперидина DMF для снятия защиты с Fmoc группу из амидный линкер Rink. Встряхнуть бусы с 20%-ным раствором пиперидина в течение 30 мин. Промыть DMF 5x, чтобы удалить все пиперидина.
  3. Потратьте несколько бусы из шприца и проверить его с помощью теста хлоранил. Бусы должны становится темно-коричневой (тест хлоранил положительным для первичного амина), если Fmoc успешно снимают.
  4. Подготовьте следующие решения: 1. 20 мл, 2 М бромуксусная раствора кислоты / DMF; 2 20 мл, 2 М раствор DIC / DMF.; 3. 10 мл, 1 М methoxylethylamine / решение DMF.
  5. Добавить 5 мл 2 М бромуксусную решения кислота / DMF кшарики, слегка встряхнуть. Затем добавляют 5 мл 2 М DIC / ДМФ решения шариков; запечатать шприц с поршнем и положил его на шейкере. Встряхнуть в течение 10 мин.
  6. Вымойте бисером с DMF тщательно. Добавить 2 мл 1 М раствора метоксиэтиламин / DMF, приготовленные из шага 4.4 с гранулами. Уплотнение шприца с поршнем и встряхивают его на шейкере в течение 30 мин.
  7. Вымойте бисером с DMF 5x. Проверьте несколько бусин с тестом хлоранил, если положительные (бисер синеет), то переходите к следующему шагу. В противном случае, повторите шаг 4,6.
  8. Повторите шаги 4,5 до 4,7, 4x для завершения пентамер.

. 5 Сплит-и-бассейн Синтез ОТА библиотеки с (R) - и (S)-2-бромпропионовой Кислоты

Здесь мы описываем синтез небольшой ОТА библиотеки с теоретической разнообразия 9261 соединений с использованием 1 г шариков из стадии 4.8. Обратите внимание, что TentaGel шарик 90 мкм содержит приблизительно 2,9 млн. бусы на грамм; Поэтому избыточностьбиблиотека будет 2,9 х 10 6/9261 = 312 экземпляров. Мы используем бромуксусную кислоту, (R)-2-бромпропановой и изотопный надписью (S)-2-бромпропановой кислотно-D 4, как кислоты и 7 различных аминов (А1 ~ А7, см. рисунок 5 для деталей) для аминирования. Шприц реакторы и вакуумный коллектор будет использоваться для выполнения синтеза.

  1. Добавьте 10 мл дихлорметана 1:01: DMF к шприцу с шагом 4,8; использовать 1000 мкл пипетки с усеченной кончика пипетки разделить все 1 г бусы равномерно на три 5 мл шприцев реакторов. Обозначить их как B (бромуксусной кислоты), R ((R)-2-бромпропановой) и S ((S)-2-бромпропановой кислоты-D 4). Вымойте все 3 шприцы с DCM 3x, и мыть шприцы меченные R и S безводным ТГФ 3x, мыть шприц с надписью с B с DMF 3x.
  2. Шприц R и S. BTC связь бромпропановой кислоты.
    1. Подготовка свежий раствор BTC / ТГФ. Добавитьpproximately 200 мг БТД во флакон в вытяжном шкафу, запечатать его с крышкой. Взвешивают количество BTC во флаконе. Рассчитать количество растворителя, необходимое и безводный ТГФ добавить во флакон, чтобы сделать 20 мг / мл раствора BTC / ТГФ.
    2. Подготовьте бром кислот / БТД смесь. Добавить (R)-2-бромпропановой кислоты (89 мкл, 0,95 ммоль) и (S)-2-бромпропановой кислоты-D 4 (89 мкл, 0,95 ммоль) в двух небольших флаконах по отдельности. Для каждого флакона, добавляют 5 мл вышеуказанного раствора 20 мг / мл BTC / ТГФ. Запечатайте два флакона и поместить их в -20 ° C морозильник на 20 мин.
    3. Добавить 1125 мкл, 2:01 ТГФ / DIPEA (750 мкл ТГФ, 375 мкл DIPEA, 2,2 ммоль) в шприц R и S отдельно. Смешайте бисер с кончика пипетки. Пусть они сидят в течение 5 мин.
    4. Возьмем два охлаждением бром кислоты / BTC смеси из стадии 5.2.2, добавить 2,4,6-триметилпиридин (356 мкл, 2,7 ммоль) в каждой ампулы. Белые осадки сразу же образуют. Примените соответствующую подвеску непосредственнок подщелачивают шариков (шприц R и S на шаге 5.2.3) как можно скорее, а затем положить их на шейкере, чтобы пожать под 120 оборотов в минуту в течение 2 часов.
      Примечание: Решение в шприце реакторов должна быть бледно-желтовато подвеска в течение всего хода реакции. Темный цвет является показателем избыточного тепла, выделяющегося во время начальной добавлением раствора хлорида кислоты. Это может быть решена путем дальнейшего охлаждения или разбавить бром кислоты / BTC смеси.
  3. Шприц B. Муфта бромуксусной кислоты с ДВС
    1. Подготовьте свежий 20 мл, 2 М раствор бромуксусной кислоты / DMF. Подготовить 20 мл, раствор 2 М DIC / DMF.
    2. Добавить 2 мл 2 М бромуксусную решения кислота / DMF в шприц B, слегка встряхнуть. Добавить 2 мл раствора 2 М DIC / DMF в шприц B, слегка встряхнуть.
    3. Положите шприц B на том же шейкере как шприц R и S , Встряхните его в течение 2 часов. Следует отметить, что реакция сочетания бромуксусной кислоты / DIC делается в течение 30 мин; длительное время реакции для удобства синтеза сплит-и-бассейна.
  4. Через 2 часа, принимать шприц R, S и В из шейкера. Вымойте все три шприцы тщательно DCM 5x. Затем промыть водой с DMF 5x. Обратите внимание, что шприц R и S не может быть промывают ДМФ, прежде чем промывают DCM или ТГФ в первую очередь.
  5. Бассейн все бусы из шприцев R, S и В в один 12 мл реактора шприца. Вымойте все шарики с DMF 5x.
  6. Добавьте 10 мл дихлорметана 1:01: DMF к шприцу; использовать 1000 мкл пипетки с усеченной кончика пипетки разделить все шарики равномерно на 7 отдельных 2 мл шприцев, обозначить их как A1-A7.
  7. Аминирования. Подготовка 10 мл, 2 м первичные решения амин / DMF для каждого из 7 аминов, перечисленных на рисунке 5. Добавить 5 мл EACч раствор амина в соответствующий шприц A1-A7. Выдержите все 7 шприцы в инкубаторе 60 ° C при встряхивании в течение ночи.
  8. После инкубации, мыть все бусинки тщательно DMF. Возьмите несколько шариков из каждого шприца и проверить с помощью теста хлоранил. Если шарики станут зелеными (положительный) в течение 3 мин, перейдите к следующему шагу. Если отрицательный, повторите шаг 5,7 для отрицательных шприцев.
  9. Повторите шаги 5,1 до 5,8 2x для завершения тример. Необязательный шаг: После каждого цикла, мы рекомендуем, чтобы проверить качество синтеза помощью масс-спектроскопии, как описано ниже. Все 9261 соединений в настоящее время синтезированы на TentaGel бисера как библиотеки OBOC.
  10. Масс-спектроскопические подтверждение ПТС.
    ПТС очень структурированные олигомеры и обладают многими общими чертами N-метилированных пептидов. Одна из общих проблем твердофазного синтеза N-метилированных пептидов является кислота деградация во ТФК декольте. Для подавления деградации кислоты, расщепление молекул, таких как циклоспорин оттвердый носитель часто проводится при низкой температуре. Мы сравнили различные Раскалывание условия для расщепления различных молекул PTA от твердого носителя. Мы обнаружили, что, как правило, низкой температуры и снижение концентрации TFA может эффективно подавлять ухудшение кислоты и обеспечить более чистые соединения.
    1. Подготовка 10 мл 1:01 TFA / DCM раствора в 15 мл пробирку. Закройте трубку и положил его в -20 ° C морозильник на 20 мин.
    2. Вымойте бисером, которые должны быть расщеплены с DCM 5x. Встряхнуть бисером в DCM в течение 15 мин и мыть шарики снова DCM 5x.
    3. Слейте DCM из шприца. С помощью светового микроскопа и пипетки с усеченной наконечником для передачи каждого отдельного шарик в 96-луночный планшет, одного борта на лунку.
    4. Накройте 96 лунками с покровным. Поместите пластины в -20 ° C морозильнике в течение 15 мин.
    5. Возьмем охлажденный раствор 1:01 TFA / DCM с шага 5.10.1 и добавить 20 мкл в каждую лунку, содержащую шарик. Положите покровное назад и пут 96-луночный планшет на шейкере в -20 ° C холодильник.
    6. Встряхнуть в течение 20 мин. Возьмите тарелку 96-а, и снимите крышку скольжения. Сушить TFA / DCM из каждой лунки путем продувки воздуха или аргона над ней. Если более 10 шарики дрова, SpeedVac может быть использован, чтобы высушить TFA / DCM от всей пластине. Следует отметить, что в этой точке, не все из соединений отщепляется шарики, но расщепляется соединения должно быть более чем достаточно для выполнения анализа масс-спектрометрии.
    7. Добавить 20 мкл 6:04 АКС: Н 2 О распустить расщепленные соединений из каждой лунки. Пятно 0,6 мкл каждого раствора соединения вместе с 0,6 мкл CHCA MALDI матрицы на MALDI пластины.
    8. С помощью MALDI масс-спектрометрии для определения молекулярной массы и последовательность (MS / MS) каждого соединения.

6. Хлоранил Тест

  1. Подготовьте следующие реагенты свежий для каждого теста. Раствор А: 2% Хлоранил (CAS: 118-75-2) в ДМФ. РешениеB: 2% ацетальдегида (CAS: 75-07-0) в ДМФ.
  2. Смешайте 100 мкл раствора А с 100 мкл раствора В до испытания в 1,5 мл трубки; падение бусины в и осторожно встряхните. Если шарики синим в течение 5 мин, это указывает на наличие вторичного амина на поверхности гранул. Первичные амины дают темно-коричневый цвет, а не синеет.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем, три представительства MALDI спектры от PTA тримера с линкера. Как показано на фиг.6А, когда расщепляется при комнатной температуре с использованием 50%-ного раствора TFA / DCM, значительное ухудшение наблюдается. На рисунке 6A, пик 593 и 484 соответствуют линкера и ОТА тримера соответственно, показывают, что вся молекула была успешно синтезировали на шарик, но разрушаются во время расщепления. Когда расщепляется в условиях низкой температуры, как описано выше, колич...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пептидные третичные амиды (ПТС) представляют собой суперсемейство пептидомиметических олигомеров. Помимо хорошо изученных пептидов, пептоиды и N-метилированных пептидов, большая часть соединений в этой семье остается недостаточно изученной, Majorly из-за отсутствия синтетического метода иметь доступ к общему N-алкилированные пептиды. Здесь мы описываем эффективный метод синтеза хиральных АРУ с строительные блоки, полученные из аминокислот. Ранее мы уже сообщали использовать новый суб-мономера маршрут к синтеза библиотек...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Jumpei Моримото и д-р Тодд Доран для ценную помощь. Эта работа была поддержана контрактом от NHLBI (NO1-HV-00242).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,4,6 триметилпиридинACROS161950010CAS:108-75-8
2-морфолиноэтанаминSigma-Aldrich06680CAS:2038-03-1   
48% водный раствор HBrALFA AESARAA14036ATCAS:10035-10-6
АцетальдегидSigma-Aldrich402788CAS:75-07-0   
АцетонитрилФишераSR015AA-19PSCAS:75-05-8
Безводный тетрагидрофуран (THF)EMD EM-TX0277-6CAS:109-99-9
БензиламинSigma-Aldrich185701CAS:100-46-9
бис(трихлорметил) карбонат (BTC)ACROS258950050CAS:32315-10-9
Бромоуксусная кислотаACROS106570010CAS:79-08-3
ХлоранилСигма-Олдрич23290CAS:118-75-2
ЦиклогексанметиламинСигма-Олдрич101842CAS:3218-02-8
D2OКембриджский изотопDLM-4-99.8-1000CAS:7789-20-0
D-аланинAnaspec61387-100CAS:338-69-2
Дихлорметан (DCM)ФишерBJ-NS300-20CAS:75-09-2
Диметилформамид (DMF)FisherBJ-076-4CAS:68-12-2
ЭтиленгликольOakwood44710CAS:107-21-1
ИзопентиламинSigma-AldrichW321907CAS:107-85-7
KBrACROS424070025CAS:7758-02-3
L-аланинAnaspec61385-100CAS:56-41-7
3-метоксипропиламинсигма-олдричM25007CAS:5332-73-0
2-метоксиэтиламинсигма-олдрич143693CAS:109-85-3
N-(3-аминопропил)-2-пирролидинонсигма-олдрич136565CAS:7663-77-6 
N,N'-Диизопропилкарбодиимид (DIC)ACROS115211000CAS:693-13-0
N,N-Диизопропилэтиламин (DIPEA)Sigma-AldrichD125806CAS:7087-68-5
NaNO2ACROS424340010CAS:7631-99-4
NAOD 40% раствор в водеACROS200058-506CAS:7732-18-5
ПиперидинALFA AESARA12442-AECAS:110-89-4
ПиперониламинSigma-AldrichP49503CAS:2620-50-0
ПропиламинSigma-Aldrich240958CAS:107-10-8
Трифторуксусная кислотаSigma-Aldrich299537CAS:76-05-1
α-Циано-4-гидроксикоричная кислотаSigma-Aldrich39468CAS:28166-41-8   
α-КетоглутаратALFA AESARAAA10256-22CAS:328-50-7
Смола тентагеля с линкером RINKRapp-PolymereS30023
АланинтрансаминазаRoche10105589001AKA: Глутамат-пируваттрансаминаза (GPT)
ИнкубаторНью-Брансуик ScientificInnova44
NMRBruker400 МГц
MALDI масс-спектрометрApplied Biosystems4800 MALDI-TOF/TOF
ЛиофилизаторSP ScientificVirTis настольный K
Шприцевой реакторINTAVISРеакционная колонка3 мл, 5 мл, 10 мл, 20 мл
Вакуумный коллекторPromegaA7231Vac-Man

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
  2. Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
  3. Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
  4. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
  5. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
  6. Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
  7. Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
  8. Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
  9. Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
  10. Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
  11. Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
  12. Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
  13. Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
  14. Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
  15. Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
  16. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
  17. Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
  18. Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
  19. Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
  20. Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
  21. Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
  22. Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
  23. Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
  24. Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
  25. Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8 (10), 2312-2321 (2013).
  26. Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
  27. Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
  28. Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
  29. Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
  30. Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
  31. Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
  32. Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptide Tertiary AmideSplit and pool SynthesisPTA SubmonomerCombinatorial LibrarySolid Phase SynthesisOBOC LibraryPeptoid AnalogConformational ConstraintHigh Throughput ScreeningMs MS Analysis

Related Articles