Оценивая эксплуатационные качества в Mdx Мышь Модель

Summary

Основным критерием результата в клинических испытаниях для нервно-мышечных расстройств, как правило, улучшение функции мышц. Таким образом, оценки влияния потенциальных терапевтических соединений на производительность мышц предварительной клинически на мышах имеет большое значение. Мы здесь опишем несколько функциональных тестов для решения этой проблемы.

Abstract

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелым и прогрессивным мышечного истощения расстройства, для которых никакого лечения не доступен. Тем не менее, несколько потенциальных фармацевтических соединений и подходы генной терапии продвинулись в клинических испытаниях. С улучшением функции мышц является наиболее важным конечная точка в этих испытаниях, много внимания было уделено созданию надежной, воспроизводимой, и легко выполнять функциональные тесты для предварительного клинически оценить функцию мышц, силу, состояние, и координации в MDX модель мыши для DMD. Оба инвазивные и неинвазивные тесты доступны. Тесты, которые не усугубить заболевание может быть использован для определения естественную историю болезни и последствий терапевтических вмешательств (тест например. Сила передних конечностей сцепление, два различных висит испытаний с использованием либо проволоку или сетку и rotarod ход). С другой стороны, вынужден работает Беговая дорожка может быть использован для повышения прогрессирование заболевания и / или оценитьЗащитные эффекты терапевтических вмешательств на патологии болезни. Мы здесь описать, как выполнять эти наиболее часто используемых функциональных тестов в надежной и воспроизводимым образом. Используя эти протоколы, основанные на стандартных оперативных процедур позволяет сопоставление данных между различными лабораториями.

Introduction

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенным нервно-мышечных расстройств влияющих 1:5000 новорожденных мальчиков. Это тяжелая и ​​прогрессивная мышечная изнуряющая болезнь вызывается мутациями в гене DMD, которые нарушают открытую рамку считывания и предотвратить синтез функционального белка дистрофина. Мышечные волокна, лишенные дистрофина уязвимы осуществлять индуцированного повреждения. По исчерпании регенеративной способности мышечных, и в связи с хроническим воспалением поврежденных мышц, волокна замещаются соединительной тканью и жиром, впоследствии приводит к потере функции. Как правило, пациенты с МДД теряют способность передвигаться на нижних конечностях, в начале второго десятилетия. Позже, также мышцы рук и плечевого пояса страдают и пациенты часто развиваются грудопоясничного сколиоз из-за асимметричного ослаблению мышц, поддерживающих позвоночник. Вспомогательная вентиляция, как правило, требуется в позднем подростковом возрасте или в начале двадцатых. Дыхательная и сердце свинец провалдо смерти в третьем или четвертом десятилетии ^1.

Хотя ген причинным было обнаружено более 25 лет назад ^2, нет никакого лечения доступны для пациентов с МДД. Однако, улучшение медицинского обслуживания и использование кортикостероидов увеличились продолжительность жизни в западном мире ^3. С использованием животных моделей, таких как мыши MDX, крупные шаги вперед в обнаружении потенциальных терапевтических стратегий были сделаны. MDX мыши является наиболее часто используется DMD модель мыши. Он имеет точечную мутацию в экзоне 23 мышиного гена МДД и, следовательно, не имеет дистрофина ^4. За последние пару лет, многие предлагаемые стратегии продвинулись в клинических испытаниях ^5-9. В этих испытаниях, улучшение функции мышц является первичная конечная точка, утверждающая важность тестирования преимущество соединений на функции мышц у мышей в ходе предварительного клинической стадии тестирования.

Как МДДпациенты, также дистрофина негативные мышечных волокон MDX мышей уязвимы осуществлять индуцированного повреждения и их функции мышц нарушается сравнению с C57BL/10ScSnJ мышей дикого типа. Это ухудшение может быть оценена с различными функциональными пробами. Некоторые из этих испытаний являются неинвазивным и не мешают мышечной патологии (например, передних конечностей прочности сцепления, висит испытаний и rotarod подряд). Поэтому они могут быть использованы для мониторинга естественную историю болезни или определения влияния соединений на прогрессирование заболевания. Чтобы получить детальную картину влияния соединений на функции мышц в MDX мышей, функциональный тест режим, который не мешает прогрессирования заболевания, состоящей из всех этих тестов можно использовать ^10.

С другой стороны, вынужден работает беговая дорожка может быть использован для намеренно усугубить прогрессирования заболевания и протестировать защитные возможности соединений ^11. Беговая дорожка может бытьиспользуется в качестве критерия оценки, в которых время работы до изнеможения измеряется ¹² или в качестве инструмента для MDX мышей усталости, так что они выполняют менее в последующем функциональной испытание, обеспечивающее большие различия в производительности между группами лечения ^13. При выборе функциональных тестов, их влияние на прогрессирование заболевания следует иметь в виду, особенно при тестировании дистрофические мышей, как в MDX мыши ^14.

Мы здесь подробно описывать, как выполнять наиболее часто используемые функциональные испытания в качестве надежного и воспроизводимым способом на основе имеющихся стандартных операционных процедур с TREAT-NMD сети. Нажмите здесь, чтобы посетить TREAT-НПРО .

Protocol

Эксперименты, описанные здесь были утверждены Комитетом по этике животных (DEC) из Медицинского центра Лейденского университета (LUMC) на. Мыши были выведены вивария в LUMC и хранятся в индивидуальном вентилируемые клетки с 12 ч света темных циклов. У них было вволю доступ к воде и стандартным кормом.

При выполнении любой из функциональных тестов, описанных ниже, экспериментальные условия должны строго контролироваться, чтобы уменьшить изменение. Предпочтительно, возрастные и гендерные подобранные мыши следует использовать, как производительность отличается между возрастом и полов. Мыши, принадлежащие к той же помета следует рандомизированы над экспериментальных группах. Животные должны быть проверены и тем же оператором, который ослепил в экспериментальных группах. Испытания должны проводиться в тот же времени суток и дня недели, одной комнате, чтобы уравнять запахи, шумы и т.д. ¹⁴ Большая разница между отдельными мышей и временных точках может наблюдаться для всехфункциональные тесты, поэтому 6-8 мышей / экспериментальная группа должна использоваться. Функциональная тест производительности также может в значительной степени отличаться между различными инбредных линий дикого типа. Таким образом, экспериментальных и контрольных мышей дикого типа всегда должны иметь соответствующие фоны (в случае MDX мышей использовать штамма дикого типа C57BL/10ScSnJ). Все данные, описанные здесь, были получены с C57BL/10ScSnJ штамма дикого типа, который мы называем дикого типа отсюда на. Испытания, описанные здесь, могут использоваться в продольном направлении от крайней мере 1-19 месячного возраста в MDX и мышей дикого типа. Испытания не должны повторяться более одного раза в неделю, чтобы предотвратить мышей от потери заинтересованность и готовность выполнить задачу.

1. Передних конечностей Возьмитесь Испытание на прочность

Используйте тест передних конечностей прочности сцепления для измерения прочности передних конечностей. Тест основан на склонность мыши инстинктивно понять сетку когда подвешивают за хвост ¹⁵ и ADAPTEд от DMD_M2.2.001.pdf .

1. Аппарат создан: Прикрепите сетку к датчиком силы, который измеряет максимальное усилие, приложенное мышью на сетке во время тянуть. Убедитесь, что параметр включен режим Peak натяжения (T-PK) для буксировки. Единицы силы можно регулировать либо в унций-в-силу, г-из-силу, фунтов-из-силы, килограммов-из-силу, или Ньютонов.
   Примечание: Мы предпочитаем работать с г как единицу значений. Несколько метров имеются в продаже, но только осевые датчики дать надежные результаты как рычажного типа датчиков силы отрицательно влияют физических законов эффекта рычага. Либо негибкими сетка или треугольник может быть использован с барами, которые 1-2 мм в диаметре.
2. Перед испытанием, оценки массы тела мыши, чтобы позволить нормализации веса тела.
3. Используйте граммов в качестве единицы значений. Сброс счетчика в начале каждого RECOВИДЕОЗАПИСЬ.
4. Отключив мышь из клетки, захватывая хвост и перемещая его в горизонтальном направлении сетки.
5. Проверьте, что мышь хватается сетку плотно обеими передними лапами.
6. Потяните мыши от сетки так, чтобы его понять нарушается; высшая сила, приложенная к сетке будет показан на дисплее преобразователя, который может быть либо вручную, либо автоматически записываются.
7. Только принимать во внимание тянет в котором мышь показывает устойчивость к экспериментатора. Отклонение меры в котором только одна лапка, или задних конечностей были использованы и в котором мышь превратили в течение тянуть.
8. Пусть мышь тянуть сетке три раза подряд, а затем вернуть его в клетку для отдыха в течение не менее одной минуты. Примечание: между серией тянет период отдыха необходимо для мыши, чтобы восстановиться и избежать образования привычки.
9. Тогда давайте мышь выполнять четыре серии тянет, каждым из которых следует короткий период покоя. Таким образом, МОВэ потянул в общей сложности 15x (3 тянет х 5 раз = 15 тянет).
10. Определить максимальную прочность сжатия и нормализовать вес тела на основе среднего значения трех высших ценностей из 15 значений, собранных.
11. Дополнительно: Определите усталость, вычисляя декремент между средним первых двух и последних двух серий тянет 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 11 12 = C и 13 +14 + 15 = D. Формула: (C + D) / (A + B) дает значение 1 для мышей, которые не являются усталость. Это может быть выражено в процентах, так что мышь без усталости имеет значение 0% и мыши, которые передние конечности полностью усталость имеет значение 100%.

2. Висячие тесты

С висячими тестов, баланс, координацию и состоянии мышц могут быть оценены. Эти тесты основаны на том, что мыши очень хотят остаться висит на проводе или сетки до изнеможения ^16. Есть два отличительных висит испытаний, в которых в начале теста либотолько две передние конечности или все четыре конечности используются, с помощью проволоки или сетки соответственно. Тест висит помощью проволоки и сетки являются самыми длинными метод времени подвеска заимствована из DMD_M.2.1.004.pdf и DMD_M.2.1.005.pdf соответственно. Фиксированная висит лимит используется 600 сек. Большинство мышей дикого типа можно повесить за 600 сек, в то время как дистрофические мышей не могу. Чтобы уменьшить время, затраченное выполнении этого теста, максимальное время висит был установлен на месте. Мыши, которые попадают с провода или сетки до этого даны до более двух попыток. Это делается, чтобы перестраховаться, что мыши действительно не в состоянии повесить и не попадают из-за неуклюжести.

1. Висячие тест с двумя конечностями
   1. Аппарат создан: Плотно закрыть 2 мм толщиной металла ткань вешалка к полке с лентой и поддерживать вешалку около 370; см над слоем подстилки. Примечание: В качестве альтернативы, можно использовать на 55 см в ширину 2 мм толщиной металлической проволоки, которая плотно закреплены между 2 вертикальных клетей. Расстояние 37 см достаточно, чтобы поощрять мышей оставаться висит, но и достаточно низко, чтобы предотвратить мышей от травм при падении вниз. Провод не должен вибрировать или вытеснить в ходе испытания, поскольку это может отрицательно повлиять на функционирование мыши.
   2. Ручка мышь через хвост и привести его рядом с проволокой.
   3. Пусть мышь понять провод только с двумя передними лапами и снизить задних конечностей таким образом, что мышь висит только с двумя передними лапами на проводе (рис. 2В).
   4. Непосредственно запустить таймер, когда мыши. После освобождения, сильные мышей попытаться поймать провод со всеми четырьмя конечностями и хвостом, который позволил (рис. 2С).
   5. Когда мышь показывает неправильное поведение (например, балансируя на или намеренно спрыгнув провод как швладеть на рисунках 2D и 2Е), непосредственно обратиться к этому, заменив мышь на проводе без остановки таймера.
   6. Когда мышь падает провод, остановить таймер и записать время висит.
   7. Когда мышей способны повесить за 600 сек, снять их провод и вернуть их в клетку. Мыши, которые попадают до этого предела приведены максимум более двух попыток.
   8. Запишите максимальное время висит (т.е. самая длинная из испытаний) и использовать это для дальнейшего анализа.
2. Висячие тест с четырьмя конечностями
   1. Аппарат создан: Используйте либо ручной квадратной или крышка большой клетке для крысы или кролика для этого теста. Расположите сетку 25 см выше мягкой подстилкой, чтобы предотвратить мышей от вредить при падении, но и препятствовать мышей намеренно спрыгнуть сетку. Плотно закрыть сетку так, что экспериментатор не придется вручную провести сетку во время эксперимента в качестве этих движений я мог быnterfere с выполнением мыши.
   2. Наведите мышь на сетке так, чтобы она захватывает его с четырьмя лапами.
   3. Переверните сетку так, чтобы мышь висит и непосредственно запуска таймера.
   4. Тест сессия заканчивается для мышей, которые в состоянии повесить на протяжении 600 секунд. Дайте мышей, которые попадают от сетки ранее максимум более двух попыток.
   5. Используйте максимальное время висит (IE. Самый длинный из испытаний) для дальнейшего анализа.

3. Rotarod Летние

С силой тест rotarod мышц, координация, баланс, и состояние может быть определено ^17.

1. Аппарат создан: Для этого теста, мыши должны работать на вращающейся трубки. Убедитесь, что постоянная скорость устанавливается на 5 оборотов в мин (оборотов в минуту), и что скорость увеличивается с 5-45 оборотов в минуту в течение первых 15 сек при запуске. После этого он должен поддерживать свою скорость.
2. Поместите мышей на трубке rotarodкогда он вращается с медленной постоянной скоростью 5 оборотов в минуту. Пять мыши могут быть проверены одновременно.
3. Запустите работать, когда все мыши расположенный. В течение первых 15 сек скорость трубки ускоряется от 5-45 мин, после чего он поддерживает эту скорость.
4. Контролировать пробег. Время работы непрерывно записывается с помощью программного обеспечения. Продолжительность останавливается автоматически, когда мышь падает трубку, так как это активизирует строку времени, расположенный под трубы. Измените мышей, которые оборачиваются лицом в противоположную сторону на трубе во время работы без остановки трубку, чтобы повернуть.
5. Закончите тестовую сессию для мышей, которые в состоянии работать в течение срока действия 500 сек. Дайте мышам максимум более двух попыток, позволяющих им улучшить их время работы, когда они падают раньше.
6. Используйте максимальное время работы (т.е. самая длинная из испытаний) для дальнейшего анализа.

4. Беговая дорожка Упражнение

Беговая дорожка может быть использован тремя способами в качестве инструмента в предварительной клинических исследований. Во-первых, вынуждены работает беговая дорожка может быть использован для обострить патологию болезни, как описано в данном протоколе (см. также: DMD_M2.1.001.pdf ). Во-вторых, максимальный пробег способность мышей и последствий лечения на это может быть оценено (см. описание метода пусть мышей продлится до истощения DMD_M.2.1.003.pdf ). Наконец, беговой дорожке можно использовать до другого функционального тестирования, чтобы исчерпать мышь так, чтобы он выполняет менее во втором тесте ^13. Это делается путем осуществления мышей два или три раза в неделю, как описано ниже, непосредственно следует либо одной из функциональных тестов, описанных в протоколе 1-3.

1. Аппарат создан: Есть несколько беговые дорожки имеющиеся в продаже на котором несколько мышей может RUN одновременно и для которых высота, продолжительность и скорость можно регулировать. Некоторые беговые дорожки оснащены сеткой, чтобы доставить низкие удары интенсивности поощрять мышей бежать. Тем не менее, MDX мышей чувствительны к стрессу и может быть легко мотивированы в доступной форме нежным толчок с рукой в направлении движения. Таким образом, настоятельно рекомендуется, чтобы не использовать ударную сетку. Как правило, стимуляция рукой необходима только в течение первого пускового сессии.
2. Поместите мышей на горизонтальной беговой дорожке.
3. Запустите беговую дорожку на скорости движения 12 м / мин. Более низкие скорости (8 м / мин) должны быть использованы в старых мышей (> 15 месяцев), где более высокие скорости легко привести к истощению.
4. В ходе первой сессии, поощрять мышей бежать, осторожно подталкивая их, когда они находятся в конце ленты.
5. Когда мыши столкнулись продолжительностью 30 мин, поместить их обратно в клетку.
6. Повторите это два раза в неделю в течение, например 12 недель.
7. Разрешить отдыха периоды, когда это необходимо. Например, некоторые MDX мышей должны остановить бег и должно быть разрешено отдыхать в течение нескольких минут. Если это произойдет, поверните ремень с, дают все мыши период отдыха двух минут, поверните ремень на в течение двух минут при 4 м / мин. После этого увеличить скорость 12 м / мин и позволяют мыши, чтобы завершить этот протокол. Важно, чтобы все мыши завершить весь протокол работает.
   
   Примечание: В случае MDX мышей нужно отдыхая периоды, рассмотреть разминка перед протоколом упражнений 30 мин. Это разогреть сессия состоит из: акклиматизации период 2 мин со скоростью 4 м / мин, сразу за которым следует 8 мин прогрева в 8 м / мин.
   
   
   В наших руках 4-16 недельных самок MDX мышей в состоянии завершить протокол тренировки 30 минут без отдыха. Другие сообщили, что в соответствующей возрастной мыжской MDX мышам 45% от мышь требует отдыха периоды, чтобы закончить упражнение. Разминка протокол снизитьс количество остановок ^12.

Results

Передняя конечность сцепление сила дикого типа и MDX мышей увеличивает в возрасте от 4-12 недель и уменьшает снова в старых мышей. Нарушения в силу уже можно наблюдать у молодых MDX мышей. Репрезентативные данные из 9-недельных самок мышей показаны на фиг.1А и 1 В. Хотя усталость не отличается между штаммами еще в этом возрасте, MDX мышей слабее мышей дикого типа. У нас нет данных, но на утомляемость у пожилых MDX и мышей дикого типа.

Discussion

Функциональные тесты, представленные здесь, воспроизводимым, легко выполнить и применимы к дикого типа и дистрофических мышей независимо от их возраста. Испытания предоставить полезные инструменты для предварительного клинически оценить функцию мышц, силу, состояние и координацию. При тестировании эффектов соединения по естественной истории заболевания, неинвазивные тесты описано здесь (передняя конечность сцепление прочность, как висит тесты и тест rotarod) может быть красиво в сочетании в функциональном тестовом режим...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Измеритель прочности захвата мыши	Chatillon DFE (перепродан Columbus Instruments)	# 80529
Подвесная проволока 2 конечности устройство	Тканевая вешалка или устройство
Подвесная проволока 4 конечности устройство	Крышка крысиной клетки или изготовленное на заказ устройство
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
Беговая дорожка для мышей Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM