Выделение СА1 ядерного Обогащенный фракций из срезов гиппокампа для изучения деятельности зависит от ядерного импорта из Synapto-ядерных Messenger, белков

Synaptic N-метил-D-аспартат-рецепторы (NMDARs) играют ключевую роль в синаптической пластичности и выживаемость клеток сигнализации в то время активации внесинаптических NMDARs может вызвать нейродегенерации и гибель клеток. Эти изменения зависят от жестко контролируемой / регулируемой деятельности выражения зависит генов и, следовательно, требуют постоянного общения между активированными синапсов или дендритов и ядра ^7. MAP киназ ERK1 / 2 являются нижестоящими эффекторами синаптических NMDARs сигнализации и не участвуют в экспрессии генов NMDAR-активация-индуцированной, в то время как сигнализации через внесинаптического NMDAR не имеет или тормозящее действие на ERK1 / 2 деятельности ^8,11.

Есть ряд белков, которые были показаны, чтобы курсировать между дистальных дендритов и ядра. Многие из этих белков содержит сигнал ядерной локализации и активно транспортируется вдоль микротрубочками в динеина и импортина-зависимым образом в ядро ^6,9. Interestinglу, некоторые из этих мессенджеров только транзит в ядре в ответ на конкретные синаптических раздражители. Например, ретроградная транспорт циклического АМФ элемента ответа связывающий белок 2 (CREB2) индуцируется химической ООО, но не LTP ^12. Локализованные NMDAR-зависимой синаптической стимуляции приводит CREB-регулируется транскрипции коактиватор (CRTC1) в ядро, процесс транслокации, которая участвует в долгосрочной гиппокампа пластичности ^4. Недавно было показано, что посланник белок Иаков транслоцируется в ядро после как, синаптической и внесинаптического активации NMDAR и регулирует CREB зависит транскрипцию гена ^5. Синаптической или внесинаптического происхождение сигнала кодируется в посттрансляционной модификации Иакова. Синаптической активности индуцирует ERK1 / 2 зависимое фосфорилирование Иакова в решающий серин в положении 180 (pJacobS 180), который является необходимым условием для последующего транслокации в ядро ​​в первичной гиппокампа культуры. Более того, ян CA1 нейронов острых срезов гиппокампа pJacobS 180 перемещается в ядро после Шаффер залога ЛТП, но не LTD ^1,10. pS180 Иаков приводит к повышенной экспрессии пластичности связанных генов и это выражение гена каналы обратно в синаптической функции. В резком контрасте, Иаков, что перемещается в ядро после внесинаптического NMDARs активация не фосфорилируется в Ser180 и могут быть связаны с различными белкового комплекса в ядре в результате чего 'CREB отключить' и втягивание синаптических контактов ^10.

Большинство опубликованных исследований по ядерной импорта synapto-ядерного белка посланника было сделано в диссоциированных нейронов первичных культурах. Поэтому было бы интересно посмотреть, если такие выводы могут быть воспроизведены в физиологически более актуальными условия, используя срезах гиппокампа, где нейронная связь и функция гораздо лучше сохраняются. Здесь мы представим оптимизированный протокол для оценки LTP-деКулон ядерную транслокацию белка посланников иммуноблоттингом. Этот способ также подходит для анализа активности зависимое фосфорилирование белков в сырой ядерной фракции. В частности, текущий протокол включает получение острых срезов СА1 гиппокампа, индукции и записи ЛТП. Далее, СА1 область под микроскопом рассекают, чтобы изолировать область стимулированного. Мы объединили и изменение протокол для ядерной изоляции, предоставленную CellLytic ядерной Extraction Kit с изменениями, внесенными Чжао и его коллеги ^17. Оптимизированная процедура включает лизис расчлененных СА1 регионов в гипотонического буфера, позволяющее клеток опухоли и высвобождение ядер. Лизис клеток и морфологию ядра может быть определена с помощью микроскопического исследования. Ядерный обогащение достигается стадией короткого центрифугирования. Иммуноблоттинг анализ с антителами против NeuN и NSE2, специфических маркеров ядерных или цитозольных фракций, указывает на то, что этот подход может быть использован в качестве быстрогои воспроизводимый протокол изолировать эти субклеточные фракции и учиться очень неустойчивые посттрансляционные модификации как фосфорилирования белков. Кроме того, этот способ выгоден маленькие образцы ткани, вытекающих из вскрытых СА1 регионах срезах гиппокампа и могут быть использованы в комбинации с иммуногистохимии в срезах гиппокампа.

1 Подготовка острого срезов гиппокампа от взрослых мозга крысы

1. Обезболить крыс изофлураном. ВНИМАНИЕ: Выполните процедуру, используя закрытую ексикаторе, не вдыхать изофлурана. Убедитесь, что животное полностью под наркозом.
2. Обезглавить крысу, быстро изолировать мозг, и погрузить его в precarbonated (95% O _2/5% CO ₂ газовой смеси) ледяной решение Гея (состав в мм: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O , 0.3 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 11 MgCl ₂ · 6H ₂ O, 0,23 KH ₂ PO _4, 0,8 Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 5 Глюкоза · H ₂ O, 25 HEPES, 22 NaHCO _3, рН 7,32) в течение 30 мин ^1,2,10,16.
3. Удалить мозжечка и часть энторинальной коры. Отделите корковых полушария с середины-сагиттальной вырезать, затем поместите каждое полушарие вниз на ее медиальной поверхности. После этого сделать50-70 ° вырезать (50-70 ° поперечная) вдоль верхнего края каждого полушария ^13,14.
4. Клей каждое полушарие с свежескошенной поверхности на нарезки платформе системы секционирования. Платформа должна быть покрыта precarbogenated решения ледяным Гея.
5. Вырезать 350 мкм 50-70 ° поперечных срезов спереди назад сторона, используя vibratome скорректирован с целью минимизации г-оси колебаний. Гиппокампа, subicular и энторинальной коры головного мозга, а также коры головного мозга, которые расположены дорсолатеральной в гиппокампе будет часть срезов, используемых для экспериментов ^13,14.
6. Трансфер срезах гиппокампа к U-образной формы и погружного типа инкубатора и инкубировать в течение не менее 2 ч при 32 ° С с carbogenated искусственного спинномозговой жидкости (ACSF содержащий в мм: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 1,5 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 1,24 KH ₂ PO _4, 10 Глюкоза · H ₂O, 27,4 NaHCO _3, рН 7,3) ^1,2,10,16.

2 позиционирования электродов, Базовый Запись и индукционные ЛТП

1. Передача гиппокампа ломтик в погруженном записи типа камеры, установленной под микроскопом. Заливать (6-7 мл / мин) с carbogenated ACSF по крайней мере 30 мин при 32 ° С.
2. Подготовить стеклянный капилляр микроэлектродов, заполненных ACSF (сопротивление наконечник 3-5 МОм).
3. Поставьте стакан микроэлектродов, заполненных ACSF в CA1 Шаффер-залоговых волокон для стимуляции и в CA1 рогового radiatum для fEPSP записи ^1,2,10 (Рисунок 2). Расстояние между электродами должно быть около 300 мкм.
4. Вызывание поле возбуждающих постсинаптических потенциалов (fEPSPs) стимуляцией Шаффер-залоговых волокон с импульсами двухфазных прямоугольных тока (200 мс / полярности) в диапазоне 3-4 В.
5. Выполните максимальное тест стимуляции путем измерения вхут-выход отношения и определить силу стимуляции 40% максимальных значений fEPSP-склоновых полученных и держать его постоянным в течение всего эксперимента.
6. Начните запись исходных условий для по крайней мере 15 минут после максимального теста стимуляции. Измерение ответов на тестовые стимулы каждую минуту в течение всего эксперимента. Выполните базовые записи с низкочастотной стимуляции.
7. Запишите основу для по крайней мере 30 мин.
8. Для индукции Поздно БПЛ применяются высокочастотные 100 Гц тетанизации, состоящий из трех 1 сек стимулирования поездов на 100 Гц с 5 мин intertrain интервала. Для увеличения поля стимуляции в СА1 области 5 мкМ бикукуллина можно мыть в 2 мин до тетанизации и следует мыть сразу же после последнего тетанизации.

3 Коллекция фрагментов после индукции LTP и фиксированным замораживания

1. Стоп LTP записи 2 мин или 30 мин после трех поездов тетанической стимуляции, вызывающих Поздний БПЛ.
2. Собирают каждый кусочек в 1,5 мл пробирку и хранить при -80 ° C.

4 Выделение ядерных Обогащенный фракций от СА1 области гиппокампа

1. Возьмите 1,5 мл пробирки Эппендорф с замерзшими ломтиками от -80 ° C и держите их на льду.
2. Добавить 0,5 мл свежей холодной TBS-буфера, содержащего протеазы (PI) и ингибиторы фосфатазы (PS), в трубу. Инкубировать в течение 2-3 мин и передать стереомикроскопа. ВНИМАНИЕ: Использовать защитные перчатки и лабораторный халат во время работы с ИП и ПС.
3. Рассеките CA1 рогового pyramidale область гиппокампа с помощью двух игл. Используйте одну иглу для проведения срез под стереомикроскопом и второй иглы для резки области СА1.
4. Соберите расчлененный CA1 регионы от 5 ломтиков (для каждой группы) в новую пробирку 1,5 мл, содержащую 50 мкл буфера для лизиса (1x гипотонического буфера для лизиса, содержащего в мм: 10 HEPES, 1,5 MgCl _2, 10 KCl, рН 7,9, с PI и PS). Заметим, что это количество материала будет достаточно, чтобы запустить 2-3 иммуноблотах.
5. Перемешать собранную ткань благодаря тщательной пипетки вверх и вниз. Используйте 200 мкл пипетки. Инкубируйте лизата на льду в течение 5-7 мин, чтобы позволить клетки набухать.
6. Возьмите 2 мкл лизата, падение на предметное стекло, и визуализировать опухоль из клеток под ярким поле микроскопа. При правильном набухания клеток ядра появляются как круглые нетронутыми структуры.
7. Соберите 20 мкл образца в свежую 1,5 мл трубки как «гомогената фракции '. Добавить 8 мкл денатурирующего буфера 4x образца SDS.
8. Центрифуга оставшиеся лизатов при 11000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
9. Осторожно собрать надосадочную жидкость из верхней ("цитозольной фракции '), TRansfer в новую пробирку и добавить 20 мкл 4х буфера выборки.
10. Ресуспендируют осадок в 60 мкл гипотонического буфера и добавить 20 мкл 4х буфера выборки. Эту фракцию называют «ядерного обогащенной фракции '.
11. Гомогената цитозольного, и ядерные обогащенные фракции можно хранить при -20 ° С или -80 ° С для последующего иммуноблоттинга.

5 Полуколичественный Иммуноблоттинг для Synapto-ядерных белков

1. Разморозить образцы и варить их в течение 5 мин при 95 ° С.
2. Возьмем 5 мкл от каждой фракции и определяют концентрацию белка по амидо черным теста или BCA теста.
3. Загрузить равное количество образцов белка из гомогената, цитоплазматические и ядерные обогащенных фракций на SDS-PAGE. Образцы от контроля и ломтиками LTP должен быть сделан на том же гель для прямого сравнения.
4. Выполните стандартную западную-блоттинга процедуру (мокрый передачи рекомендуется).
5. Зонд мембраны с тОн антитело выбора. Затем те же блоты (или же образцы работают параллельно) могут быть проверены с цитоплазматической маркер - нейронов специфической enolase2 (NSE2) и ядерного маркера - NeuN и -actin антител в качестве контроля нагрузки.

Анализ 6. данных

1. Эффективность индукции LTP могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения Clampfit. Средний уклон исходных записей сравнивали с склоны после тетанизации помощью двусторонней ANOVA, р <0,05 считали значительно отличается. Значения наклона fEPSP были изображены на схемах как среднее ± SEM
2. Для количественного определения иммуноблотах, сканировать авторадиографические фильм и анализировать интегральную плотность белковых полос по ImageJ или полос флуоресценции с системой Licor. Значения иммунореактивных полос должно быть нормализовано для загрузки и промокательной управления. Для сравнения контроля и LTP групп непараметрической Манна-Уитни U-тест может быть использован.

Таблица 1 Буферы.

Ранее мы показали, что synapto-ядерный белок мессенджер Jacob накапливается в ядрах после индукции LTP, но не LTD 1. Кроме того, перемещение Иакова после синаптической стимуляции требует активации МАРК ERK1 / 2 и фосфорилирования Иакова в Ser180 (рис 1). Фосфорилированный Иаков транслоцируется в ядро в импортина-зависимым способом и фосфорилируется состояние может сохраняться в течение длительного периода времени по ассоциации с промежуточной нити αinternexin 15 (рисунок 1). Фосфо-состояние Иакова важно для экспрессии активности зависит от генов и выживание клеток. Интересно, что активация внесинаптических NMDARs также приводит Jacob в ядро, но в этом случае Jacob не фосфорилированные на Ser180 и его накопление ядерного индуцирует CREB 'выключить' 5,10. Результаты, описанные выше, были получены ProtocoLs установленные в нашем недавнем исследовании (см Карпова и др. 10 для подробного описания модели).

Чтобы доказать, что Джейкоб транслоцируется в ядро после индукции LTP, мы индуцированных и измеряется индукцию Шаффер залога fEPSP потенцирования при острых срезов гиппокампа и затем выделяют нейронов ядра из СА1 нейронов (рисунки 2 и 3). Мы сравнили две различные точки времени после применения высокочастотной стимуляции (2 мин и 30 мин) и записаны индукцию LTP для каждого среза, который был впоследствии обработан для ядерной изоляции и Вестерн-блоттинг (фиг.2 и 3). Обогащение ядерного маркера нейронов NeuN можно видеть в ядерном обогащенной фракции, полученной из рассеченной СА1 области, в то время как цитозольного маркера нейронов конкретных enolase2 (NSE), в основном присутствует в надосадочной фракции, полученной после центрифугирования лизированных Cлоктей (4А). Специфика pS180 Jacob антител характеризуется ранее (подробнее см Карпова и др. 10). Уровни pS180 Иаков оставался неизменным в общем объеме CA1 белковых гомогенатах и в ядерной обогащенного фракция 2 мин после тетанизации (Рисунок 4B), но мы нашли значительное увеличение pJacobS 180 иммунореактивности 30 мин после индукции LTP (Рисунок 4C), подтверждающий, что Иакова транслокации в ядро ​​в этой клеточной модели пластичности фосфорилируется в Ser180.

Рис.1 Иаков фосфорилируется в S180 кодирует синаптическую происхождение NMDARs сигналов. Тетанической стимуляцию гиппокампа Шаффер залога волокон приводит к активации синаптических NMDARs и последующей активации МАРКERK1 / 2 сигнального каскада. Активированный ERK1 / 2 связывается и фосфорилирует Jacob на серина 180 и / 2 комплекс Jacob-ERK1 перемещается в ядро, и это коррелирует с повышенной активности CREB и активации экспрессии генов, связанных с пластичности.

Рисунок 2 Оборудование и инструменты, используемые для индукции LTP и рассечения регион СА1 от срезов гиппокампа. А) Vibratome используется для приготовления острых срезов гиппокампа (1 - Vibratome) B1-2) электрофизиологии и настройка изображения (2 - микроскоп; 3 - Микроманипулятор и система перфузии; 4 - Перекодирование электрод; 5 - Стимуляция электрод; 6 - Вода объективом ; 7 - держатель Slice с гиппокампа ломтик) C) Оборудование, используемое для рассечения СА1 области от срезов гиппокампа (8 Stereomicroscope; 9 - Инсулин шприц с иглами; 10 - Малые хирургические ножницы; 11 - Скальпель; 12 - Пластиковые пипетки Пастера, 13 - Тонкий шпатель; 14-100 мм пластик культура блюдо заполнено водой со льдом, и 40 мм пластик культура блюдо используется для рассечения ломтиками.

Рисунок 3 мультфильм демонстрируя экспериментальную процедуру. Цифры указывают шаги в протоколе. 2.1-2.8) острый гиппокампа ломтик в затопленную камеру со стеклянными электродами, помещенными в роговом radiatum для потенцирования Шаффер залога-СА1 синапсов. На вставке представляет образец fEPSP аналоговые следы, горизонтальная полоса указывает 5 мс, а вертикальная полоса указывает 0,5 мВ. 3,3) Срезы были собраны в 1,5 мл пробирки, послеЗапись LTP и замораживали. 4.3) Вскрытие региона CA1 от взрослых ломтиками гиппокампа крысы. 4,4-4,5) CA1 области гомогенизировали в гипотонического буфера для лизиса, что приводит к осмотическому набуханию клеток и высвобождения ядер. 4,8) Центрифугирование лизатов при 11000 оборотах в минуту в течение 1 мин. 4.10) Коллекция цитоплазматических и ядерных обогащенных фракций для иммуноблотинга. 5.3) Загрузка цитоплазматических и ядерных обогащенных фракций на SDS-PAGE и последующего стандартной западной-блоттинга.

Рисунок 4 Индукция СА1 LTP приводит к накоплению pJacS180 в ядре. А) Вестернблот для гомогената, цитозольной и ядерных обогащенных фракций СА1 лизата зондируют цитозольного и ядерных маркеров. B) Иммуноблот анализ уровня pJac-S180 в гомогенат 2 мин и 30 мин после промводств из тетанизация. C) Иммуноблот анализ уровня pJacS180 в ядерной обогащенного фракция 2 мин и мин после тетанизации. Эти результаты являются частью количественного графике, опубликованном в Карпова и др 10. Эти представительные иммуноблоты не включены в по первоначальной публикации.

Авторам нечего раскрывать.