Методическая статья

АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

DOI:

10.3791/51317

⸱

24 июля 2014 г.

1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes, UFR de Physique, Université Paris Diderot, 2Institut Jean-Pierre Bourgin, UMR1318 INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles-Grignon

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод отображения механических свойств растительных тканей с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ). Мы сосредоточимся на том, как регистрировать механические изменения, происходящие в клеточных стенках во время развития растений в широкопольном мезомасштабе, что позволяет коррелировать эти изменения с ростом и морфогенезом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем недавно разработанный метод для измерения механических свойств поверхностей растительных тканей с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) микро / нано-углублений, для JPK АСМ. В частности, в этом протоколе мы измеряем модуль кажущейся Юнга клеточных стенок в субклеточных резолюций по регионам до 100 мкм х 100 мкм в цветочных меристем, гипокотиля и корней. Это требует тщательной подготовки образца, правильный выбор микро-инденторами и глубины отступа. Для учета клеточной стенки свойств только, измерения проводятся в высококонцентрированных растворов маннита для того, чтобы плазмолиз клетки и таким образом снять вклад давления клеток тургор.

В отличие от других существующих методов, с помощью различных инденторами и глубины отступа, этот метод позволяет проводить измерения одновременное многомасштабных, Тем не менее, остаются некоторые ограничения: метод может быть использован только на довольно небольших образцов (около 100 мкм в диаметре), и только на внешних тканей; метод чувствителен к ткани топографии; он измеряет лишь некоторые аспекты сложных механических свойств ткани в. Техника в настоящее время быстро развивается, и вполне вероятно, что большинство из этих ограничений будут решены в ближайшее время.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рост растений достигается за счет согласованного расширения жестких клеточных стенок, которые окружают каждую ячейку организма. Количество фактов говорит о том, что в результате изменения химии клеточной стенки, что растения локально контролировать это расширение. Расширение, как полагают, в основном за счет деформации на клеточных стенках, вызванные высоким давлением тургор клетки; этот штамм ответ на давление тургора регулируется механических свойств клеточных стенок 1. Мало что известно о этих механических свойств и как они изменяются в процессе разработки. Кроме того мало известно о том, как эти механические свойства контролируются и способствовать ли обратные изменить химию клеточной стенки таким образом, что, по-видимому скоординированных через ткань. Если мы хотим понять связь между химическим и механическим изменениям в клеточных стенок растений в процессе разработки, и, в конечном счете, как эти микроскопические взаимодействия регулируют завод'Ы макроскопического рост, метод, который может контролировать механические свойства клеточных стенок в развивающихся органы на клеточном или ткани масштабе требуется.

Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), описанный здесь, в основе которого лежит микрометра или нанометровых сжатий ткани или углублений, была разработана именно для измерения механических свойств клеточных стенок в развивающихся органы одновременно в субклеточных резолюций и через целых регионов ткани. Другие методы имеют либо разрешение, что слишком низкая или слишком высокая: экстензометр только в состоянии измерить средние механические свойства целого ткани в миллиметровом масштабе 2-4, в масштабе, который является, например слишком большой для измерения ранние события в органогенез; microindenter может проводить измерения на субклеточном разрешением в нанометровом масштабе, но она ограничена измерения изолированных клеток и не группы клеток или органов 5-7. С АСМ, требуютг ткани, клеточном, и субклеточных резолюции может быть достигнуто 8-10. Недавно несколько протоколов были разработаны специально для измерения механику растений ткани, которые также могут быть использованы 11, 12.

Мы представим здесь, как оценить эластичность ткани через измерения модуля кажущейся Юнга 13.

Модуль упругости обычно используется для описания жесткость материала. В малой деформации усилие, необходимое для деформации материала пропорциональна площади отступа. Юнга это коэффициент. В случае непрерывного однородного материала такой же коэффициент будет измеряться независимо от типа отпечатка (размер и форма), но будет изменяться со скоростью измерения. В случае сложной структуры ткани растений, мы наблюдали до сих пор, что сила пропорциональна деформации, позволяющей определитькоэффициент пропорциональности, что мы называем "Видимая Юнга". В отличие от непрерывных средств массовой информации на заводах, это очевидно модуль Юнга чувствителен к размеру отступа. Это не соответствует молодого модулей чистого клеточной стенки. Это лучше всего описывает упругость лесов клеточной стенки ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовьте предметные стекла для монтажа Пример

  1. Подготовка вложения агарозном СМИ: 0,7% низкий агарозы плавления в 10% маннита (в воде).
  2. Использование сильный металлический инструмент (например, буровой наконечник лайма), гравировать на см площадь 0,5 х 0,5 в центре микроскопии стекло. Или наоборот, склеить небольшой кусочек стекла ламели (около 20 х 200 мкм) на стекло с помощью Araldite клей. Примечание: Этот придает шероховатость поверхности, чтобы облегчить адгезию агарозы для того, чтобы агарозы палочки медиа или исправлять слайда. На этом слайде можно использовать повторно.
  3. Поместите капельку объемом приблизительно 20 мкл вложения в агарозном носитель на протравленной области предметное стекло. Это дает тонкий слой агарозы.
  4. Храните предметное стекло в влажной камере и ждать агарозные СМИ затвердеть.

2. Пройдя и монтаж меристема Образцы

  1. Microdissect меристемы для конфокальной томографовнг: вынуть цветочных бутонов по одному из ствола, потянув их вниз с ультра тонких пинцетом. Важно, чтобы удалить все цветочных бутонов до бутонов, которые не проявляют чашелистики (т.е. P1 зачатков 14).
  2. Использование лезвия бритвы или кончик пинцетом, сократить меристему от стебля. Срез должен быть параллелен области поверхности меристемы, которая должна быть измерена с АСМ. Полученный вершина должна быть между 300 мкм и 600 мкм высокой, чтобы соответствовать под иглой АСМ.
  3. Нажмите вершины в пленку геле СМИ, подготовленных на этапе 1.1.4. Выберите позицию на стекле / агарозы и осторожно нажмите таким образом, что меристема как непосредственно в контакте с стекло и выступает из агарозы. Очень важно, чтобы расположить меристему в агарозы в течение нескольких секунд, которые следуют его разрез от стебля. Примечание: Это делается для того, чтобы предотвратить меристемы от сушки. На данном этапе, меристема будет стоять в КРАУМК потому что агарозы перелом от применения давления.
  4. Подготовить несколько меристемы этот способ для пакетной обработки изображений, при условии, что они имеют одинаковую высоту и расположены менее 500 мкм друг от друга на слайде. Держите приготовленные меристем в влажной камере в то время рассечения дополнительные образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограничивает вариацию, идущий от калибровки. В идеале 2 образцы каждого условия могут быть подготовлены и измеряется в случайном порядке. До сих пор нет наблюдаемый эффект пакетном изображений на измерении (стресс, вызванный ответа). Это может быть благодаря разбавления стресса сигнальных молекул в агаре и / или монтажной раствора. Альтернативно реакция на стресс является той же, независимо от количества образца, полученного.
  5. Прежде чем перейти к следующему шагу, убедитесь, что граница между меристемы и цветочных бутонов сухая. Если нет, то аккуратно удалите излишки воды, используя фильтровальную бумагу. Это должно предотвратить на следующем этапе, что расплавленныйагарозном заливает образец из-за капиллярности сил.
  6. С 20 мкл пипетки, добавить достаточно растаял монтажа агарозы заполнить трещины, созданной на шаге 1.2.3. и окружить каждый меристему. Агарозу должны выйти на уровень шрам от удаленной бутон цветка (зачаток). Чтобы достичь этого, это может быть необходимо добавить агарозы на каждом конце трещины.
  7. Когда агарозном добавляется, он будет быстро залить в трещину; с помощью пипетки, отсасывать часть расплавленный монтажа агарозы для того, чтобы меристема является самой высокой точкой на слайде. Это фиксирует меристемы так, что она не может двигаться во время съемки.

3. Монтажные Главные или гипокотиля Образцы

  1. Для корней и гипокотиля, не рассечение не требуется. В тонкой пленке агарозы на подготовленном стекло, делают канавку либо непосредственно выше травления в стекле или вдоль стеклянной пластинки. Расположите корень или гипокотиль в эту канавку гарантируя, что он находится в контакте сстекло по всей ее длине.
  2. Прежде чем перейти к следующему шагу, убедитесь, что образец сухой на ее поверхности. Если нет, то аккуратно удалите избыток воды с использованием фильтровальной бумаги.
  3. Добавить растаял монтажа агарозном вокруг образца, как в пункте 1.2.6.

4. АСМ Подготовка и чувствительности Калибровка (для JPK NanoWizard АСМ)

  1. Установите кантилевера на АСМ. Консольные должен быть установлен с круглой формой индентора. Радиус определит х, у, разрешение г и глубину вдавливания, при котором точное измерение может быть в архиве.
    1. Для того, чтобы мезо-наноразмерных измерения на поверхности эпидермиса, используйте радиус 50 нм круглый индентора; принять мезомасштабные измерений, используйте радиус мкм круглый индентора 0,5; принять микромасштабной измерения (через 2-3 клеток), используйте радиус 2,5 мкм круглый индентора.
  2. Позиционировать лазер на кончике кантилевера. Совместите лазер к серединеиз похитителя с помощью зеркала.
  3. Установите чистый стакан под АСМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: следующие установлен для преобразования сигнала в положение лазерного на рецептор АСМ в деформации кантилевера и, по оценке жесткости пружины кантилевера, чтобы перевести его в силу.
  4. Подход с целевой силы "уставки" 1 В.
  5. Выберите "силовой спектроскопии". У углубление, установив максимальный "относительно уставки" до 2 V, "расширить скорость" до 40 мкм / сек, а "длина г" до 5 мкм.
  6. В меню "калибровка менеджер", выберите линейную часть форвардной кривой, чтобы соответствовать чувствительности, используя кнопку "выберите пункт по размеру диапазон". «Относительная уставки" должны быть преобразованы из "вольт" на "метр".
  7. В меню "менеджер калибровка" выберите "жесткости пружины", чтобы оценить Эльasticity кантилевера с использованием тепловые флуктуации. Нажмите кнопку "Выполнить", чтобы получить спектральную плотность участок кантилевера. Найдите резонансный пик с минимальной частоты. Установите его с помощью кнопки "выберите пункт по размеру диапазон".
    ПРИМЕЧАНИЕ 1: Для более подробной информации о настройке тепловых флуктуаций, читать Кук и др. 15.
    Примечание 2: Предпочтительно использовать прямой метод, чтобы оценить упругость кантилевера с использованием опорного кантилевера (или материала с известной жесткостью). Тот, используется здесь был любезно пожертвован Атеф Asnacios 16.
  8. Добавить 200 мкл 10% раствора маннита в соответствии с кантилевера. Realign лазер на середине похититель с помощью зеркала.
  9. Перекалибруйте чувствительность: из меню "калибровка менеджер", нажать на кнопку «неизвестного»; повторите шаги 2,3 до 2,5.

. 5 Сбор данных: кажущихся Модуль Юнга картографии

  1. Разместите запрессованных образцов под АСМ и добавить 500 мкл каплю 10% раствора маннитола на образец. Раствор маннита plasmolyzes клетки в течение нескольких минут.
  2. Подход с целевой силы ("поставлена ​​точка") от 20 нн ("установить точки" не должно быть более 3 В)
  3. Отступ с "относительно уставки" 200 нн, "расширить скорость" 40 мкм / сек, а "длина г" 5 мкм.
  4. Отрегулируйте "относительно уставки" для того, чтобы получить отступ 100 нм для 200 нм, установленного кантилевера или 0,5 мкм для смонтированном кантилевера 1 мкм / 5 мкм.
  5. В режиме "отображения сила", выберите регион для сканирования: для меристем, 70 мкм х 70 мкм с разрешением ("пикселов") из 64 х 64; для гипокотиля и корней, 100 мкм х 100 мкм с разрешением 64 х 64.
  6. Пресс сканировать запустить эксперименты. Сохраните выход.

. 6 Анализ данных: Модуль упругости Расчеты кажущихся Юнга

  1. Откройте файл данных в программное обеспечение для анализа данных.
  2. Выберите "пакетную обработку", чтобы применить тот же анализ для всех кривых одной карте.
  3. Выберите "корректировки высоты для изгиба кантилевера" так, чтобы извлечь глубину вдавливания.
  4. Выберите "модуль подходят функцию Юнга", что возьмет на себя сила пропорциональна площади отпечатка. Установите "Tip Shape", чтобы параболических предположить, что форма отступ является параболической.
  5. Укажите радиус чаевых.
  6. Выберите преимущественно в "втягивания" кривую для анализа, потому что это менее чувствительны к топографии, чем кривая "продлить". Однако, если существует значительное прилипание зонда во время "ретракта" использовать "продлить" кривую, которая является нечувствительным к прилипание.
  7. Наборкоэффициент Пуассона 0.5. Нажмите на анализ и сохранить результат.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 мы приводим типичные значения модуля Юнга карты цветочными меристем (рис. 1a и 1b), молодые и старые гипокотили (рис. 1С-F), и корневой меристемы (рис. 1G и 1Н). Во всех экспериментах индентора полусферической, но его радиус отличается тем, чтобы различные пространственные разрешения может быть достигнуто рисунках 1C и 1D показаны типичные результаты для мезо-наноразмерных инденторами (ради...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В растениях, изменение механических свойств играют важную роль в направляя рост и морфогенез. На сегодняшний день наблюдается большой прогресс в разгадке генетические и химические сетей, которые контролируют рост растений, но наши знания о том, как эти сети способствуют и зависят от изменений в механических свойств находится в зачаточном состоянии. Этот метод должен позволить нам восполнить этот пробел, и поэтому она должна быть сильной интерес для ученых, изучающих любой аспект роста растений или формообразования. Тепе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы даем особую благодарность Ив Couder за многочисленные полезные обсуждения. Мы благодарим Atef Asnacios для калибровки консолей и обсуждения. Мы благодарим Лиза Уиллис, Эллиот Meyerowitz, и Оливера Hamant за критическое прочтение. Эта работа была частично финансируется программы Human Frontier Science гранта RGP0062/2005-C; Agence Nationale-де-ла Recherche проекты'' Growpec,'' и'' Mechastem''.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AFMJPKNanoWizardВсе 3-го поколения способны выполнять работу с одинаковой приоритетностью.
AFM stageJPKCellHesionТребуется для образца с низким рельефом (менее 11 &; m между самой низкой и самой высокой точкой в зоне силового сканирования).
AFM оптикаJPKTop View OpticsОчень важно для того, чтобы позиционировать образец. Может быть заменен биноклем дальнего действия или микроскопом.
СтереомикроскопLeicaM125Любой тип стереомикроскопа может подойти.
Монтируемый кантилевер 150 нмНаносенсоры Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, SwitzerlandR150-NCL-10Для измерения только клеточной стенки на поверхности эпидермиса используют.
1 & микро; m установленный консольНаносенсоры Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, SwitzerlandSD-Sphere-NCH-S-10Для измерения механики клеточной стенки ортогонально поверхности эпидермиса.
Бесконцевые кантилеверыНаносенсоры Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, SwitzerlandTL-NCH-20Для измерения локальной механики ткани (шириной 2-3 клетки) используйте 5&микро; М установленная консоль. Мы прикрепили 5 & микро; m боросиликатный шарик к консоли без кончика.
5 и микро; m кремниевые микросферыCorpuscularC-SIO-5
AralditeBartik S.A. 77170 Coubet, FranceAraldite для крепления шарика к бесконцевой консоли.
Низкоплавкая агарозаFisher Scientific Fair Lawn, Нью-Джерси 07410BP160-10034-45 ° C температура гелеобразования
D-MannitolSigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, Сент-Луис, Миссури 63103 СШАM4125-500G
2 Нержавеющая сталь No 5 ПинцетIdeal-Tek 6828 Balerna, Швейцария 
951199

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
  2. Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).
  3. Durachko, D. anielM., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25(2009).
  4. Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
  5. Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
  6. Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
  7. Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
  8. Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
  9. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
  10. Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
  11. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
  12. Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
  13. Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
  14. Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
  15. Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
  16. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
  17. Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121(2012).
  18. Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
  19. Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813(2013).
  20. Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
  21. Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
  22. Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
  23. Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549(2011).
  24. Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи