Nanopodia тонкие, но хрупкие мембранные каналы, которые простираются до 100 мкм от переднего фронта или задней задней ячейки и чувств сотовой среды. Прямая фиксация при 37 ° С, нежной стирки, и избежания органических растворителей, таких как этанол, метанол или ацетон и более высоких концентраций Тритон Х-100, должны соблюдать эти клеточные структуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Nanopodia - Тонкие, хрупкие Мембранные Прогнозы с ролями в сотовых передвижении и межклеточных взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Приверженец клетки в культуре поддерживать поляризованное состояние, чтобы поддержать движение и межклеточных взаимодействий. Nanopodia тонкие, удлиненные, в значительной степени F-актин-отрицательных мембранные выступы в эндотелиальных и раковых клеток, которые могут быть визуализированы с помощью TM4SF1 (Трансмембранное-4-L-шесть-семья-1) окрашивания иммунофлюоресценции. TM4SF1 кластеры в 100-300 диаметром мкм Tmed (ТМ 4SF1 е nriched микро D omains), содержащий от 3 до целых 14 отдельных TM4SF1 молекул. Tmed расположены прерывисто вдоль nanopodia на очередной интервал от 1 до 3 Tmed за μ м и прочно закрепить nanopodia в матрице. Это позволяет nanopodia расширить более 100 μ м от переднего фронта или задней задней поляризованных эндотелиальных или опухолевых клеток, и вызывает мембранные остатки, чтобы их оставили позади на MATRIX, когда клетка отходит. Tmed и nanopodia были упущены из-за их крайней хрупкости и чувствительности к температуре. Регулярное мытье и фиксация нарушают структуру. Nanopodia сохраняются путем непосредственного фиксации в параформальдегида (PFA) при 37 ° С с последующим короткой инкубации в 0,01% Triton X-100 перед окрашиванием. Nanopodia открыть новые перспективы в области клеточной биологии: они обещают, чтобы изменить наше понимание того, как клетки воспринимают окружающую их среду, обнаруживать и идентифицировать другие клетки на расстоянии, инициировать межклеточных взаимодействий в тесном контакте, и из сигнальных механизмов, участвующих в движении, пролиферации и клеточной -клеточные коммуникации. Методы, разработанные для изучения TM4SF1 производный nanopodia могут быть полезны для изучения nanopodia, которые образуют в других типах клеток посредством классических tetraspanins, в частности с повсеместно выражается CD9, CD81, CD151 и.
Введение
Во время поляризации для движения, клетки животных расширить разнообразные динамические, мембранные выступы из их поверхности, в том числе филоподий, ламеллиподий, отвода волокон, и оборками 1. Недавно добавленные в этот список были nanopodia, недавно признанным тип тонкий (100-300 мкм в диаметре), удлиненные (длиной до 50-100 мкм) мембраны проекция, которые обеспечивают мембранные каналы для расширения F-актиновых структур, таких как филоподий и отвод волокна, и что пятно положительно с TM4SF1 (трансмембранного-4-L-шесть семьи-1) в культивируемых эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3.
TM4SF1 представляет собой бело....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток на коллаген стекла с покрытием диска
- Место стеклянные диски (12 мм в диаметре) в стеклянной банке (4 унции) и автоклав для стерилизации диски.
- Положите 25 мл 70% этанола в 50 мл трубки Сокол и поместить его в капот культуре клеток. Это решение может быть повторно использован многократно, пока уровень раствора не падает до 20 мл.
- Поместите острые щипцы с дополнительной тонкой точке в 70% этанола в течение 5 мин перед использованием его для обработки стекла диск.
- Осторожно снимите щипцы из трубки и закройте крышку, затем аккуратно поместите этанола обрабатывают щипцами на верхней части трубки высохнуть на возд....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для Шаг 1:
Если клетки (например, HUVEC и PC3 используемые в данном исследовании) способны нормально расти, клетки будут приложить к коллагена покрытием диска в течение 30 мин после того как они высевают, поляризовать и становятся подвижными вскоре, и расширить nanopodia впереди своего пути передвижения. фиг.1А и 1В соответственно показывает поляризованы и пролиферирующих HUVEC. Фиг.2А показывает поляризованных клетках РС3 в подвижном состоянии.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Nanopodia тонкие клеточной мембраны каналы, которые прочно прикрепить к матрице через Tmed и может расширить более 100 мкм от поляризованного мобильного клетки ощутить окружающую среду и посредником межклеточные взаимодействия 2,3. Nanopodia придерживаться матрицы так прочно, что остатки остались позади, как клеточных уходит (рис. 1 и 2). Таким образом, Nanopodia позволяют нам изучить, как клетки воспринимают окружающую их среду и определить путь движения клетки, и как движен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы признаем, Д-р Гарольд Дворжака за полезные обсуждения в том числе по предложению попробовать фиксацию в 37 ° C PFA. Эта работа была поддержана NIH грант P01 CA92644 и договором с Национальным фондом по исследованию рака.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стеклянные диски | Fisher Scientific | 12-545-82 | Стеклянная банка диаметром 12 мм |
| Fisher Scientific | 02-912-310 | Сертифицированные чистые прозрачные стеклянные банки с прямыми стенками, стеклянное стекло на 4 унции | |
| Fisher Scientific | 12-544-1 | Микроскоп премиум-класса Простые стеклянные предметные стекла Fisherfinest | |
| 50 мл Пробирка Falcon | BD Falcon | 352070 | 50 мл прозрачная полипропиленовая коническая центрифужная трубка, номинал 16 000 RCF. Стерильный. |
| 15 мл Falcon Tube с штативом из пенополистирола | Corning | 430790 | Corning 15 мл Центрифуга из полипропилена |
| Острые щипцы | Fisher Scientific | 13-812-42 | Рассекающие щипцы для особо тонкой заостренной осколки |
| 24-луночный Клеточный культуральный планшет | BD Bioscience | 353047 | 24-луночный Клеточный культуральный планшет |
| 150 мм Клеточный культуральный планшет | BD Bioscience | 353025 | 150 мм Клеточный культуральный планшет |
| 19 G 1 ½ Игла для шприца | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Этанол | Декон Лабораториз, Инк. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen | раствор BD Bioscience | 354249 | Коллаген I, высокая концентрация, крысиный хвост, 100 мг |
| трипсина/ЭДТА | Cellgro | 25-053-CI | 0,25% трипсин-ЭДТА 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM с высоким содержанием глюкозы (1x), жидкий, с L-глутамином, без пирувата натрия |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 л | PBS, 10x раствор, pH 7,4 |
| PFA (параформальдегид) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% в PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Фетальная бычья сыворотка |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 базальная среда 500 мл и EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Факторы роста |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | растворяют в воде. 4% исходный раствор и рабочая концентрация 0,4%. |
| Мышиное антитело к человеческому антителу TM4SF1 | Millipore | MAB3127 | Epitope находится во внеклеточном домене |
| мышиного античеловеческого антитела CD9 | BD Bioscience | 555370 | Эпитоп расположен во внеклеточном домене |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd антитело | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Реагент Antifade с DAPI |
| 70% этанолом; | 17,5 мл этанола (200 пр)<бр/> 7,5 мл дважды деионизированной воды | ||
| 10x PBS (всего 200 мл) | 20 мл 10x PBS<бр/> 180 мл дважды деионизированной воды | ||
| 20% Triton X-100 (всего 20 мл) | 4 мл Triton X-100 16 мл дважды деионизированной воды | ||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 г NaN3 25 мл дважды деионизированной воды | ||
| 50 нг/мл раствора бычьего коллагена в PBS (make 5 ml) | Стоковый раствор 50 мкм; г/мл (50 мл)<бр/> 830 г/мкм; л коллагена I (3 мг) 50 мл PBS | ||
| ICC Blocking Buffer (50 мл) | 49 мл PBS 2% FBS (добавить 1 мл) 0,04% NaN3 (добавить 100 μ l 4% NaN3) | ||
| ICC Blocking Buffer/0,01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 мл ICC Blocking Buffer 25 μ л 20% Triton X-100 | ||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Шкаф | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (серия 60) |
| 37 ° C, 5% CO2 Инкубатор для клеточных культур | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Нагревательная прокладка для инкубатора с водяной рубашкой |
| K& H Manufacturing | 1020 | K& H Lectro Kennel Подогреваемая прокладка с чехлом из свободного флиса (www.amazon.com) | |
| Центрифуга | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Настольная центрифуга |
| гемоцитометр | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line гемоцитометр |
Ссылки
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogen....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
