Nanopodia тонкие, но хрупкие мембранные каналы, которые простираются до 100 мкм от переднего фронта или задней задней ячейки и чувств сотовой среды. Прямая фиксация при 37 ° С, нежной стирки, и избежания органических растворителей, таких как этанол, метанол или ацетон и более высоких концентраций Тритон Х-100, должны соблюдать эти клеточные структуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Nanopodia - Тонкие, хрупкие Мембранные Прогнозы с ролями в сотовых передвижении и межклеточных взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Приверженец клетки в культуре поддерживать поляризованное состояние, чтобы поддержать движение и межклеточных взаимодействий. Nanopodia тонкие, удлиненные, в значительной степени F-актин-отрицательных мембранные выступы в эндотелиальных и раковых клеток, которые могут быть визуализированы с помощью TM4SF1 (Трансмембранное-4-L-шесть-семья-1) окрашивания иммунофлюоресценции. TM4SF1 кластеры в 100-300 диаметром мкм Tmed (ТМ 4SF1 е nriched микро D omains), содержащий от 3 до целых 14 отдельных TM4SF1 молекул. Tmed расположены прерывисто вдоль nanopodia на очередной интервал от 1 до 3 Tmed за μ м и прочно закрепить nanopodia в матрице. Это позволяет nanopodia расширить более 100 μ м от переднего фронта или задней задней поляризованных эндотелиальных или опухолевых клеток, и вызывает мембранные остатки, чтобы их оставили позади на MATRIX, когда клетка отходит. Tmed и nanopodia были упущены из-за их крайней хрупкости и чувствительности к температуре. Регулярное мытье и фиксация нарушают структуру. Nanopodia сохраняются путем непосредственного фиксации в параформальдегида (PFA) при 37 ° С с последующим короткой инкубации в 0,01% Triton X-100 перед окрашиванием. Nanopodia открыть новые перспективы в области клеточной биологии: они обещают, чтобы изменить наше понимание того, как клетки воспринимают окружающую их среду, обнаруживать и идентифицировать другие клетки на расстоянии, инициировать межклеточных взаимодействий в тесном контакте, и из сигнальных механизмов, участвующих в движении, пролиферации и клеточной -клеточные коммуникации. Методы, разработанные для изучения TM4SF1 производный nanopodia могут быть полезны для изучения nanopodia, которые образуют в других типах клеток посредством классических tetraspanins, в частности с повсеместно выражается CD9, CD81, CD151 и.
Введение
Во время поляризации для движения, клетки животных расширить разнообразные динамические, мембранные выступы из их поверхности, в том числе филоподий, ламеллиподий, отвода волокон, и оборками 1. Недавно добавленные в этот список были nanopodia, недавно признанным тип тонкий (100-300 мкм в диаметре), удлиненные (длиной до 50-100 мкм) мембраны проекция, которые обеспечивают мембранные каналы для расширения F-актиновых структур, таких как филоподий и отвод волокна, и что пятно положительно с TM4SF1 (трансмембранного-4-L-шесть семьи-1) в культивируемых эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3.
TM4SF1 представляет собой белок с tetraspanin, как топологии, который был первоначально известен как антигеном опухолевых клеток 4 до открытия, что молекула эндотелиальных биомаркеров клеток, что играет существенную роль в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции 2,3. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что TM4SF1 локализуется в perinucLear пузырьки и в плазматическую мембрану, и обогащен ТМ 4SF1 электронных nriched микро г omains (Tmed). Tmed якорь nanopodia к матрице и присутствует в регулярно расположенные Banded рисунком 1-3 длины Tmed / мкм из nanopodia. Nanopodia обычно простираются от переднего фронта клетки и конце задней течение поляризации клеток для движения. В связи с твердым приверженцем природы Tmed, nanopodia не в состоянии отказаться обратно в камеру, как она движется в сторону; брошенные остатки nanopodia таким образом проследить путь сотовой движения. Nanopodia обеспечить мембранные каналы для F-актина выдвижения и втягивания, и являются местами межклеточных взаимодействий и коммуникаций 2,3. Эти характеристики означают, что nanopodia предоставляют уникальную возможность для изучения механизмов, лежащих F-сборку актина во время клеточного поляризации, клеточном зондирования окружающей среды, определения пути и направления движения клеток и межклеточных взаимодействийй коммуникации.
В связи с высокой гидрофобной природы Tmed и тонкой и хрупкой мембранного природы nanopodia, особое внимание должно быть принято в целях сохранения Tmed и nanopodia. Разрушение nanopodia и удаления Tmed по распространенных методов лабораторных является возможная причина, почему только шестьдесят три публикации появились на TM4SF1 с момента своего первого открытия в 1986 1 и для полного незнания TM4SF1 обогащения в 100-300 мкм микродоменов на клеточной поверхности до доклада TM4SF1 в эндотелиальных клетках в 2009 году 2.
Обычные методы иммунным окрашиванием обычно используют органические растворители, как этанол, метанола, ацетона или исправить клетки и используют 0,1% или более высокую концентрацию Triton X-100 в проницаемыми клеткам 5. Исследования, описанные здесь реализуется три основных изменения с обычным способом выявить Tmed и nanopodia: (я) использовать 37 ° C 4% PFA и исправить клеток в 3776; C инкубатор, (II) нежный комнатной температуры стирки PBS, и (III) используют менее 0,03% Triton X-100 только кратко проницаемыми клетки перед добавлением первичного антитела, как Triton X-100 выше, чем 0,03% извлечет TM4SF1.
Все tetraspanins образуют микродомены на клеточной мембране 6 и некоторые локализуются с Tmed в эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3. Как tetraspanins как CD9, CD81, CD151 и экспрессируются повсеместно, протокол окрашивания описанный здесь, может быть продлен до многих различных типов клеток, которые не имеют TM4SF1 для исследований функции nanopodia.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток на коллаген стекла с покрытием диска
- Место стеклянные диски (12 мм в диаметре) в стеклянной банке (4 унции) и автоклав для стерилизации диски.
- Положите 25 мл 70% этанола в 50 мл трубки Сокол и поместить его в капот культуре клеток. Это решение может быть повторно использован многократно, пока уровень раствора не падает до 20 мл.
- Поместите острые щипцы с дополнительной тонкой точке в 70% этанола в течение 5 мин перед использованием его для обработки стекла диск.
- Осторожно снимите щипцы из трубки и закройте крышку, затем аккуратно поместите этанола обрабатывают щипцами на верхней части трубки высохнуть на воздухе в течение 2 мин. Не допускайте, чтобы кончик пинцетом касаться чего-либо в капюшоне.
- Используйте стерильного пинцета, чтобы захватить один стерильный стеклянный диск из стеклянной банке и поместить его в лунку для культивирования клеток пластины 24-а. Повторяйте, пока желаемое количество скважин не была заселена с дисками.
- Поместите 500 мкл раствора бычьего коллагена (50 нг / мл) в каждую лунку, которая содержит стеклянную диск и поместить его в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора клеток культуры, по крайней мере 30 мин. Там нет никакого вреда в долгосрочной инкубации.
- Урожай HUVEC (Human эндотелиальных клеток пупочной вены) или PC3 предстательной железы (опухолевые клетки), которые уже были выращены в 150 мм клеточной культуральной пластины с помощью обработки трипсином и блокируют активность трипсина, используя его полной культуральной среде. Сбор клеток в 15 мл сокола трубки.
- Подсчитайте количество клеток и убедитесь, что жизнеспособность более 90%.
- Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
- Используйте культуральной среды для разбавления клеток до 10 5 клеток / мл. Поместите клетки на льду.
- Аспирируйте коллагена в капот культуре клеток и осторожно поместить 500 мкл суспензии клеток в каждой лунке, в которой стекло диски были предварительно покрытый коллагеном. 5 х 10 4 клеток / лунку в 24-луночный планшет даст 60% конфluency для HUVEC и 30% слияния для клетках РС3. Примечание: добавить больше клеточной суспензии для более высокой плотности клеток.
- Культуры клеток в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение 1 часа, 2 часа, 4 часа, 6 часов, или 24 часов, чтобы отслеживать nanopodia деятельности и переход клеток. Как правило, клетки будут приложить к стеклянный диск в первые 30 мин, после чего можно будет поляризовать и мигрируют в течение первого часа, а также выполнять межклеточные взаимодействия и деление клеток в следующих часов.
2. Сотовый Фиксация
- Каждый хорошо понадобится 500 мкл 4% PFA (параформальдегида) для фиксации клеток. Либо коммерчески изготовлены или свежеприготовленные 4% PFA может быть использован. Рассчитать количество PFA, необходимое на основе количества скважин, приготовленных, и поместить PFA в 15 мл трубки сокола. ВНИМАНИЕ: параформальдегиде потенциальный канцероген.
- Положите трубки сокола в пенополистирола стенде, который был уже на месте в 37 ° C инкубаторе. Оставьте трубку в инкубаторе в течение 30 мин до войным до свободной зоны до 37 ° С.
- Поместите грелку в капот культуры и включите его.
- Выньте клеточной культуры пластину 24-а и нагретого PFA из инкубатора и разместить его на верхней части грелку.
- Одной рукой аспирации среды из скважины, и сразу же после использования другой рукой аккуратно сдвиньте 500 мкл PFA в колодец через а края. Для облегчения аспирации, наклонить культуральный планшет при температуре около 45 °, опираясь его против пенополистирола стенде так, что она стабильна под этим углом. Это будет способствовать стремление и добавления PFA решение колодца, не нарушая клетки в культуре. Это самый важный шаг, чтобы сохранить оригинальный клеточную структуру клеточных деятельности.
- Повторите процесс, пока все скважины с стеклянный диск не получили PFA. Примечание: все шаги, которые необходимо изменить уже существующие решения от колодца будет применять те же процедуры аспирации.
- Место пластины в 37 ° С в течение 5 мин.
- Возьмите тарелку обратно в капот культуры и наклона против пенополистирола как описано в шаге 2.5. Одной рукой осторожно перенести PFA из колодца в пробирку; использовать другую руку, чтобы сразу же после этого разместить по крайней мере, 500 мкл температуры в помещении PBS в скважине. После того как все колодцы были вымыты, вернуться и повторить промывку PBS еще раз в каждую лунку. Слейте собранную PFA в контейнер с опасными отходами.
- Подготовка блокирующий буфер ICC добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки в PBS. 0,04% азид натрия (разбавленный 20% от исходного раствора) добавляют в качестве консерванта. ВНИМАНИЕ: азид натрия является токсичным соединением. Буфер может быть сохранен в 4 ° С в течение длительного периода времени без бактериального заражения.
- С планшета для культуры еще наклоненной против подставке, еще раз перебирать каждую лунку аспирационных удалить PBS и сразу же после этого, добавив 500 мкл ICC блокировки буфера. Клетки готовы к иммунофлуоресцентного окрашивания. При необходимостификсированные клетки могут быть сохранены в 4 ° С холодильником в течение недели без значительной потери TM4SF1 белка.
3. TM4SF1 Иммунофлуоресценции Окрашивание Nanopodia
- В каждой лунке заменить 500 мкл ICC блокирующий буфер с новым блокирующем буфере, содержащем 0,01% Triton X-100 и оставьте при комнатной температуре в течение 1 часа. Не следует использовать выше, чем 0,03% Triton X-100, как это будет удалить TM4SF1 из клеточных мембран. PBS клетки промывали с шагом 2,10 может быть непосредственно перемещается в блокирующем буфере, содержащем Triton если окрашивание готов быть начата немедленно.
- Развести первичного анти-TM4SF1 (или анти-CD9) антитела с 0,5 мкг / мл в блокирующем буфере ICC.
- В каждую лунку, удалите ICC/0.01% Triton буфер и заменить его 300 мкл анти-TM4SF1-антител решения. Инкубировать 2 часа при комнатной температуре или оставить на ночь при 4 ° С.
- Вымойте каждую лунку с не менее 500 мкл PBS. Повторите 3 раза; каждый раз дают в леаст 5 мин времени инкубации.
- Подготовка вторичного антитела и фаллоидином решение в ICC блокирующем буфере, используя 1000 раз разведение в Alexa 488 помечены осел против мышиного вторичных антител (2 мкг / мл конечной концентрации) и 1000 х разбавление фаллоидином (50 нг / мл конечная концентрация).
- Удалить PBS и добавьте 300 мкл вторичного антитела и фаллоидином раствора в каждую лунку и инкубировать в течение 2 часов или оставить его на ночь при 4 ° C.
- Повторите промывание PBS с по крайней мере 5 мин инкубации в стирке. В последней промывки оставить каждую лунку PBS в течение 1 часа.
- Оставьте ни капли (~ 10 мкл) анти-выцветанию монтажа СМИ на предметное стекло.
- Согните кончик 19 G 1 ½ в иглу шприца 90 °, нажав аккуратно на твердую поверхность. Одной рукой удерживайте согнутых иглу и осторожно поднимите стеклянную диск из колодца, и использовать другую руку, чтобы схватить диск с помощью острых щипцов.
- Поверните стеклянный диск &# 160; лицом вниз позволяя боковую клеток контакт монтажа медиа на предметное стекло. Аккуратно поместите стеклянную диск и дайте ему высохнуть в течение ночи в темном месте при комнатной температуре.
- Перейдите к изображению иммунофлюоресценции окрашенных nanopodia или хранить слайды в режиме слайд-поле при температуре -20 ° С. Слайды останется просмотра в течение нескольких месяцев в -20 ° C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для Шаг 1:
Если клетки (например, HUVEC и PC3 используемые в данном исследовании) способны нормально расти, клетки будут приложить к коллагена покрытием диска в течение 30 мин после того как они высевают, поляризовать и становятся подвижными вскоре, и расширить nanopodia впереди своего пути передвижения. фиг.1А и 1В соответственно показывает поляризованы и пролиферирующих HUVEC. Фиг.2А показывает поляризованных клетках РС3 в подвижном состоянии...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Nanopodia тонкие клеточной мембраны каналы, которые прочно прикрепить к матрице через Tmed и может расширить более 100 мкм от поляризованного мобильного клетки ощутить окружающую среду и посредником межклеточные взаимодействия 2,3. Nanopodia придерживаться матрицы так прочно, что остатки остались позади, как клеточных уходит (рис. 1 и 2). Таким образом, Nanopodia позволяют нам изучить, как клетки воспринимают окружающую их среду и определить путь движения клетки, и как движен...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы признаем, Д-р Гарольд Дворжака за полезные обсуждения в том числе по предложению попробовать фиксацию в 37 ° C PFA. Эта работа была поддержана NIH грант P01 CA92644 и договором с Национальным фондом по исследованию рака.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стеклянные диски | Fisher Scientific | 12-545-82 | Стеклянная банка диаметром 12 мм |
| Fisher Scientific | 02-912-310 | Сертифицированные чистые прозрачные стеклянные банки с прямыми стенками, стеклянное стекло на 4 унции | |
| Fisher Scientific | 12-544-1 | Микроскоп премиум-класса Простые стеклянные предметные стекла Fisherfinest | |
| 50 мл Пробирка Falcon | BD Falcon | 352070 | 50 мл прозрачная полипропиленовая коническая центрифужная трубка, номинал 16 000 RCF. Стерильный. |
| 15 мл Falcon Tube с штативом из пенополистирола | Corning | 430790 | Corning 15 мл Центрифуга из полипропилена |
| Острые щипцы | Fisher Scientific | 13-812-42 | Рассекающие щипцы для особо тонкой заостренной осколки |
| 24-луночный Клеточный культуральный планшет | BD Bioscience | 353047 | 24-луночный Клеточный культуральный планшет |
| 150 мм Клеточный культуральный планшет | BD Bioscience | 353025 | 150 мм Клеточный культуральный планшет |
| 19 G 1 ½ Игла для шприца | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| Этанол | Декон Лабораториз, Инк. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| Collagen | раствор BD Bioscience | 354249 | Коллаген I, высокая концентрация, крысиный хвост, 100 мг |
| трипсина/ЭДТА | Cellgro | 25-053-CI | 0,25% трипсин-ЭДТА 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM с высоким содержанием глюкозы (1x), жидкий, с L-глутамином, без пирувата натрия |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 л | PBS, 10x раствор, pH 7,4 |
| PFA (параформальдегид) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% в PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Фетальная бычья сыворотка |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 базальная среда 500 мл и EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Факторы роста |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | растворяют в воде. 4% исходный раствор и рабочая концентрация 0,4%. |
| Мышиное антитело к человеческому антителу TM4SF1 | Millipore | MAB3127 | Epitope находится во внеклеточном домене |
| мышиного античеловеческого антитела CD9 | BD Bioscience | 555370 | Эпитоп расположен во внеклеточном домене |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd антитело | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| Anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Реагент Antifade с DAPI |
| 70% этанолом; | 17,5 мл этанола (200 пр)<бр/> 7,5 мл дважды деионизированной воды | ||
| 10x PBS (всего 200 мл) | 20 мл 10x PBS<бр/> 180 мл дважды деионизированной воды | ||
| 20% Triton X-100 (всего 20 мл) | 4 мл Triton X-100 16 мл дважды деионизированной воды | ||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | 1 г NaN3 25 мл дважды деионизированной воды | ||
| 50 нг/мл раствора бычьего коллагена в PBS (make 5 ml) | Стоковый раствор 50 мкм; г/мл (50 мл)<бр/> 830 г/мкм; л коллагена I (3 мг) 50 мл PBS | ||
| ICC Blocking Buffer (50 мл) | 49 мл PBS 2% FBS (добавить 1 мл) 0,04% NaN3 (добавить 100 μ l 4% NaN3) | ||
| ICC Blocking Buffer/0,01% Triton X-100 (make 50 ml) | 50 мл ICC Blocking Buffer 25 μ л 20% Triton X-100 | ||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| Шкаф | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (серия 60) |
| 37 ° C, 5% CO2 Инкубатор для клеточных культур | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Нагревательная прокладка для инкубатора с водяной рубашкой |
| K& H Manufacturing | 1020 | K& H Lectro Kennel Подогреваемая прокладка с чехлом из свободного флиса (www.amazon.com) | |
| Центрифуга | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Настольная центрифуга |
| гемоцитометр | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line гемоцитометр |
Ссылки
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
