Методическая статья

Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

DOI:

10.3791/51322

⸱

11 апреля 2014 г.

 , 
1Molecular Pharmacology and Pathology Program, Department of Pathology & Bosch Institute, University of Sydney, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Biomedical Sciences, Monash University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аскорбат играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только вышли на свет в последние годы. Здесь мы опишем средне-пропускную способность, конкретное и недорогой микропланшетного анализ для определения как внутри-и внеклеточной аскорбиновой кислоты в клеточной культуре.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Витамин С (аскорбиновая кислота) играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только приходят на свет в последние годы. Например, в головном мозге, аскорбиновая кислота действует в нейропротективного и нейромодуляторного образом, что включает в себя аскорбат велосипеде между нейронами и вицинальных астроцитов - отношения, которые, как представляется, решающее значение для мозга аскорбат гомеостаза. Кроме того, новые данные наводит на мысль, что аскорбиновая кислота имеет значительно расширенную роль в регуляции клеточного и системного метаболизма железа, чем в классическом признается. Растущее признание интегральной роли аскорбиновой кислоты в нормальной и разрегулированной клеточном и организменном физиологии требует ряд средне-пропускной и высокочувствительных аналитических методов, которые могут быть выполнены без необходимости сильно дорогой специального оборудования. Здесь мы предлагаем четкие инструкции для средней пропускной, конкретные и относительно недорогой микропланшетного анализ для определения бой внутри-и внеклеточной аскорбиновая кислота в клеточной культуре.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Открытие химической природы аскорбиновой кислоты (витамин С), и его идентификации в качестве долгожданного "антицинготными фактора», Альберт Сент-Дьерди и другие в статьях, опубликованных с 1928 по 1934 1 были знаковые события в истории биохимии. В самом деле, эти открытия способствовали Сент-Дьерди присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1937 году. Постоянно расширяющийся набор ролей для аскорбиновой кислоты в животных и физиологии растений, а также на здоровье человека, по-прежнему являются субъекты активная научная Расследование и споры.

L-аскорбат является обильное физиологический восстановитель и кофактор фермента в системах млекопитающих, и вносит свой ​​вклад в многочисленных хорошо определенных ферментативных реакций с участием коллагена гидроксилирование, карнитин и норадреналина биосинтез, метаболизм и тирозина пептидного гормона, амидирование 2. Интересно, монтаж evideNCE предполагает, что аскорбат играет важную роль в стимулировании других железа зависит от диоксигеназ, такие как пролил и аспарагинила гидроксилазы, вовлеченных в гидроксилирование и ориентации из гипоксии-индуцируемых факторов (ОПО) 1α 2α и 3. В недавнем докладе о том, что аскорбиновая кислота играет важную роль в Т-клеточной созревания до влияние хроматина деметилирования через его деятельности в стимулировании ядерных гидроксилаз, Jumonji C (JmjC) белки домена; последний из которых, кажется, требуют аскорбат для полноценной деятельности 4. Действительно, стимуляция таких ферментов по аскорбат-видимому, происходит такой же механизм для стимуляции аскорбата из HIF и коллагеновых гидроксилазы. Среди других классических эффектов, аскорбат вносит значительный вклад в клеточной антиоксидантной качестве водорастворимого цепи разорвать акцептора радикалов 5 и утилизации плазматической мембраны α-токоферол (витамин Е) через снижению α-tocopheroxyl радикал 6, шHICH играет важную роль в защите от перекисного окисления липидов мембраны 7. Важно отметить, что хотя большинство млекопитающих способны процессов нового печени синтеза аскорбиновой кислоты из D-глюкозы, высшие приматы, морские свинки и некоторые летучие мыши зависит от пищевых источников витамина 8. Это связано с инактивации гена Gulo, то ортологи которых в незатронутых млекопитающих кодирует фермент, γ-лактон gulono-оксидазы 9-13. Этот фермент необходим для окончательного реакции в аскорбат биосинтеза глюкозы из 13.

После транспортера-опосредованной всасывания из просвета кишечника в организме человека, аскорбиновая кислота распространяется по всему телу по кровеносной системе. Витамин обычно можно найти в восстановленной форме в миллимолярных концентрации внутри клеток (с исключением эритроцитов, в которых концентрации обычно похож на преобладающей концентрации в плазме), и в микромолярном концentrations (например 50-200 мкМ) в большинстве внеклеточных жидкостях 14,15.

В физиологических условиях, аскорбиновая кислота обычно претерпевает обратимое одноэлектронную окисление в аскорбил свободных радикалов (AFR, также известный как monodehydroascorbate или semidehydroascorbate). В то время как AFR является относительно стабильный радикал 16, в отсутствие его быстрого одноэлектронного снижению ферментативной обратно в аскорбат, два AFRs может дополнительно dismutate одному аскорбата и один дегидроаскорбат (DHA) 9,13,17. В внутрь клетки, окисление продукта двухэлектронного аскорбата, DHA, могут быть быстро снижается обратно в аскорбат на глутатион-и NAD (P) H-зависимой ферментной и не ферментативных реакций 13.

В то время как в классическом принято считать, что только значительную роль аскорбиновой кислоты в метаболизме железа является стимулирование диетическое всасывание не тема железа 18, мы и другие предоставили доказательств сtrongly предполагая, что аскорбат играет значительно более значительную роль в метаболизме этого металла. Во-первых, аскорбат, который высвобождается аскорбата-изобилует клеток по-видимому, играют важную роль в модуляции поглощения не-трансферрином железа связаны клетками 19,20, и совсем недавно данные показывают, что аскорбиновая кислота также модулирует поглощение трансферрином железа неизбежно 21 клетками, последний из которых соответствует основным физиологическим захватывающие железо маршрута 22.

Аскорбат необходим для нормального центральной нервной системной функции у млекопитающих 23,24. Вместе с коры надпочечников, гипофиза, вилочковой, сетчатки и желтого тела, мозг содержит высокие концентрации аскорбата по отношению к другим тканям организма 23,25-27. Кроме того, воздействие как астроциты 28,29 и нейроноподобных элементов 30 на глутамат, как известно, вызывают высвобождение аскорбата во внеклеточное пространство, где ascorbatе, как полагают, чтобы помочь защитить нейроны против индуцированной глутаматом нейронов дисфункции 31. В то время как точный механизм глутамат-индуцированный аскорбат выхода из астроцитов неизвестно, недавно мы представили доказательства, указывающий участие клетки опухоль, вызванная захвата глутамата на астроцитов глутамата и аспартата транспортера (GLAST, также известный возбуждающих аминокислот транспортер изоформы 1 [EAAT1 ] у людей) и, как следствие активация объема чувствительных осмолита и анионных каналов (VSOACs), которые проницаемы для малых органических анионов, таких как аскорбиновая кислота 32. Молекулярные тождества плазменных мембранных каналов, участвующих в образовании VSOAC остаются должны быть определены 33,34.

Хотя многие тесты были разработаны для определения аскорбиновой кислоты в биологических образцах, которые включают в спектрофотометрических, флуорометрические и хроматографические анализы 35,36, есть много изменчивость в специфичности, чувствительности, interferencэ на химических загрязнителей, эффективного линейного диапазона и стабильности аналита конечной точки. Кроме того, другие важные факторы, влияющие на выбор анализа являются быстрота, простота в использовании и доступ к относительно специализированного оборудования, таких как жидкостной хроматографии высокоэффективной (ВЭЖХ) аппарата.

Здесь мы приводим простой и очень специфический колориметрический микропланшет-анализ для определения внутриклеточного аскорбата в культивируемых клетках, а также в качестве отдельного анализа для определения аскорбат-отток из культивируемых клеток. Последний анализ направлен на обойти проблему недооценки аскорбат освобождение от клеток из-за быстрого обратного захвата высвобожденного аскорбата по транспортеров аскорбата натрия (в зависимости от SVCTs). Хотя оба этих метода появились в некоторых из наших предыдущих публикаций 19,20,32,37,38, эта рукопись обеспечивает явное набор инструкций и руководящих принципов для их эффективного выполнения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Определите внутриклеточных аскорбиновая кислота в культивируемых клетках

  1. Клеточная культура и сбор урожая
    1. Расти суспензии (например эритролейкемии человека, К562) или прилипшие клетки (например, первичные астроциты) с использованием стандартных процедур культуры 19-21,32,38. Примечание: для обеспечения клетки содержат аскорбиновой кислоты, загрузить культивируемых клеток с аскорбиновой кислотой либо как аскорбиновая кислота или DHA 33,39.
  2. Создайте аскорбат содержащих клеточного экстракта
    1. Инкубировать соответствующее количество забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) промывают суспензии или адгезивные клетки с 450 мкл охлажденного на льду буфера проницаемости клеточной мембраны [КПБ; 0,1% (вес / объем) сапонин в PBS; 4 ° C]. Примечание: Определить количество клеток, необходимых для получения значения оптической плотности в пределах линейного диапазона анализа (см. ниже) эмпирически конечному пользователю. Примечание: можно также использовать тканевые экстракты (см. Обсуждение для получения дополнительной информации).
    2. AgitaTE клетки на льду в течение 10 мин, чтобы обеспечить тщательное клеточный лизис.
    3. Создание осветленного аскорбат, содержащие внутриклеточный экстракт удалением клеточного дебриса путем центрифугирования неочищенного лизата при 16000 х г в течение 5 мин в микроцентрифуге охлажденном (4 ° C).
    4. Осторожно удалить 4 х 100 мкл аликвоты из каждого образца и добавить к горизонтальной последовательности скважин в 96-лунками с плоским дном, который содержит либо 25 мкл / лунку PBS ("-АО") или только 25 мкл / лунку 45,5 U / мл маточного раствора L-аскорбиновая кислота-оксидазы (АО) в PBS ("+ АО"). Примечание: это должно быть сделано параллельно с подготовкой стандартов (см. ниже).
  3. Аскорбат строительство стандарт-кривой (должен быть построен заново для каждого анализа)
    1. Подготовка исходного раствора 10 мм аскорбиновой кислоты в ледяной PBS. Примечание: Убедитесь, концентрацию аскорбиновой кислоты спектрофотометрически с использованием кварцевой кювете с 1см путь длиной в 265 нм (коэффициент ослабления = 14,5 мМ -1 см -1) 40.
    2. Тщательно подготовить серию стандартов аскорбиновой кислоты от 0 до 20 мкм.
    3. Параллельно с шагом 1.2.4, осторожно удалить 4 × 100 мкл аликвоты из каждого стандарта и добавить к горизонтальной последовательности скважин в 96-лунками с плоским дном, содержащего 25 мкл / лунку PBS ("-АО") или 45,5 Ед / мл стоковый раствор АО в PBS ("+ AO"). Примечание: 100 мкл вышеуказанных стандартах аскорбата будет содержать 0-2 нмоль аскорбата. Пожалуйста, обратите внимание, цель АО является контроль за вклад без аскорбиновой кислоты восстановителей в феррицианида снижение.
  4. Определите внутриклеточный аскорбат - Шаг 1: выборочно удалить аскорбат и количественно окисляется аскорбат с феррицианида
    1. Траекторно смешать 96-луночного планшета при 550 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин в темноте, покрывая пластину в фольге. Примечание: Тего шаг должен окислять все аскорбат в "+ АО" скважин до ДГК. Скважины "-АО" должен быть неизменным.
    2. Добавить 50 мкл 3,5 мМ кровяной соли (далее по тексту "феррицианида") в PBS в каждую лунку. Конечный [феррицианид] = 1 мМ. Примечание: Используйте multipipettor.
    3. Траекторно смешивать пластины при 550 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение еще 5 мин в темноте. Примечание: Этот шаг должен привести к снижению феррицианида в ферроцианид на аскорбата в стехиометрическом соотношении 2 молекулы феррицианида снижение на 1 молекулу аскорбиновой кислоты окисленного.
    4. Сразу же добавить 25 мкл свежеприготовленного построенной раствора, содержащего 50% (об / об) уксусной кислоты и 30% (вес / объем) трихлоруксусной кислоты (ТСА). Примечание: Используйте multipipettor.
  5. Определите внутриклеточный аскорбат - Шаг 2: количественного количество ферроцианидом формируется 37
    1. Добавить 100 мкл ферроцианид решения определения 37 еACH хорошо. Примечание: рабочий раствор следует непосредственно перед использованием: 2 мл 3 М Na-ацетата (рН 6,0); 0,5 мл ледяной уксусной кислоте (~ 17,4 М уксусной кислоты); 2 мл 0,2 М лимонной кислоты; 2 мл 3,3 мм FeCl 3 в 0,1 М уксусной кислоты; 1 мл 30 мМ ferene-S. Конечный объем данного рабочего раствора должна быть 7,5 мл.
    2. Траекторно смешивать пластину в темноте при 550 оборотах в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Считать значения поглощение лунки при 593 нм (то есть поглощение максимум Fe (II) (ferene-S) 3 комплекс).
    4. Рассчитайте количество внутриклеточного аскорбиновой кислоты в качестве нмоль аскорбиновой кислоты на миллион клеток изначально вычитания нм значения 593 для колодцев в '+ АО' из соответствующих - скважин 'АО' для каждого образца, а затем интерполяции по калибровочной кривой аскорбат (см. шаг 1.3 ). При построении стандартной кривой, построить эту «разность значение" для каждого стандарта против размере ascorbели на лунку.

2. Определение аскорбиновой кислоты-оттока из культивируемых клеток

  1. Клеточная культура и сбор урожая
    1. Расти перерыве или прилипшие клетки, как описано выше (см. шаг 1.1). Примечание: проводить следующую анализа в формате платформы 24-и с подвеской и прилипшие клетки для достижения наилучших результатов.
    2. Ресуспендируют подвески клетки, или накладывать прилипшие клетки, с 400 мкл подогретого HEPES-буферного солевого раствора, с или без кальция и магния, и содержащего 5 мМ D-глюкозы (HBS / D, рН 7,3, 37 ° С) в скважинах из 24-луночный планшет. Добавить такой же объем HBS / D для указанных бесклеточных скважин на каждом 24-луночный планшет, подлежащих рассмотрению. Примечание: последний будет служить в качестве контроля бесклеточных для базового реакции (см. ниже).

3. Определить количество аскорбата выхода

  1. Следующие растворы должны быть готовы заранее: 120Ед / мл АО в HBS / D (подготовить свежий); 2,4 мм Ferene-S в HBS / D; 120 мкМ FeCl 3 и 600 мкМ Na-цитрат в HBS / D (подготовить непосредственно из более концентрированных растворов).
  2. Для начала реакции ferrireduction (конечный объем на лунку должно быть 600 мкл), добавьте следующие объемы реагентов к отдельным скважинам, уже содержащие 400 мкл HBS / D:
    1. Добавить 50 мкл АО (120 ед / мл) или HBS / D, чтобы в паре скважин в трех экземплярах. Конечная концентрация О. должно быть 10 Ед / мл. Примечание: Ярлык паре скважин как "- АО" и "+ АО".
    2. Смешайте таблички с нежным орбитальной перемешивания в течение 5 мин при 37 ° С
    3. Добавить 50 мкл 2,4 мМ ferene-S во все лунки. Конечная концентрация ferene-S должна быть 200 мкм. Смешайте пластины как выше в течение 5 мин при 37 ° С
    4. Добавить 50 мкл свежеприготовленного 120 мкм цитрат железа. Окончательный железо и цитрат концентрации должна составлять 10 мкМ железа и 50 мкМ цитрат. Все хорошо перемешать.
    5. В трех трех лунок контроля, аспирация лежащего среду и добавить 600 мкл HBS / D, содержащий 0,1% сапонина. Примечание: Они будут служить "100% клеток лизис" управлений для лактатдегидрогеназы (ЛДГ) релиз анализа, которые будут проводиться параллельно (см. ниже).
    6. Выдержите в течение 60 мин в темноте при 37 ° С
    7. В конце аскорбат-истечение анализа, быстро аспирации 500 мкл из каждой лунки и добавить к соответствующей маркировкой в ​​лунки 24-луночного планшета. Примечание: для суспензии клеток, первоначально удалить клетки центрифугированием при 4 ° С.
    8. Добавить 300 мкл аликвоты супернатанта в 96-луночный планшет и затем считывали при 593 нм.

    4. Определение внеклеточной аскорбат

    1. Прочитайте значения абсорбции лунок при 593 нм.
    2. Рассчитать количество внеклеточной аскорбата как нмоль аскорбата на мг белка (или на миллион клеток), как описано для определения внутриклеточного аскорбатав шаге 1.5.4. Примечание: конечный пользователь должны оптимизировать условия, чтобы аскорбат релиз не ограничивается внутриклеточного аскорбиновой кислоты.

    5. Определение ЛДГ релиз

    1. С остальных 200 мкл раствора из внеклеточной каждого образца проводить LDH анализа высвобождения 32,41, чтобы определить степень клеточного лизиса. Примечание: вычисления в% от общей съемной ЛДГ. Определить разъемное ЛДГ из образцов, которые были обработаны 0,1% сапонина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение внутриклеточного аскорбат в культуре клеток суспензии

В первом тесте (рис. 1), внутриклеточный аскорбат определяется после аскорбат конкретным (т.е. АО-чувствительных) уменьшение феррицианида чтобы ферроцианид, используя высокочувствительный определение ферроцианидом по ранее опубликованной процедуры 37. Обнаружение аскорбата основана на колориметрического комплексообразования двухвалентного железа, полученного с помощью аскорбат-зависимой снижен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем два быстрых, конкретных и относительно чувствительных колориметрических микропланшета тесты для определения аскорбиновой кислоты, полученной из внутри-и внеклеточных отсеков в культивируемых клетках. Анализы могут комплектоваться доступа к стандартным лабораторным оборудованием и реактивами. Только умеренно дорогостоящий реагент, необходимое для анализа является АО, который имеет важное значение, поскольку это придает высокую степень специфичности к аналита L-аскорби...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны доктору Стивену Робинсон и г-жи Хании Czerwinska (Monash University) за щедрую поставку астроцитов культур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Nunc 96-луночный планшет с плоским дномThermo269620Любой плоскодонный 96-луночный планшет может быть использован
Охлаждаемая настольная микроцентрифугаEppendorf5415DТакже может использоваться неохлаждаемая микроцентрифуга, которая была выровнена по температуре в холодном помещении
Охлаждаемая настольная центрифугаEppendorf5810RSwing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Микропланшетный спектрофотометрBio-RadЛюбой микропланшетный спектрофотометр, способный считывать показания на длине волны 593 нм, может использоваться и рекомендуется. Если используется считыватель пластин на основе фильтра, выберите ближайшую возможную длину волны и используйте метод стандартной кривой.
Ependorf MixMate (микропланшетный орбитальный смеситель)EppendorfЭто очень универсальный и надежный микропланшетный смеситель, который очень хорошо подходит для следующих анализов
:
Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4
MOPS-буферный физиологический раствор (MBS); 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 15 мМ MOPS-Na+, pH 7,3
MBS + 5 мМ D-глюкоза (MBS/D)
HEPES-буферный физиологический раствор + 5 мМ D-глюкоза (HBS/D); 137 мМ NaCl, 5,2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2• 2 H2O, 0,8 мМ MgSO4• 7 H2O, 5 мМ D-глюкоза, 20 мМ HEPES-Na+, pH 7,3)
Буфер для пермеабилизации клеток (CPB; 0,1% сапонин в PBS)
Общие химикаты
L-аскорбиновая кислота или L-аскорбат натрияSigma-AldrichДолжны быть получены препараты высочайшей чистоты
Димер дегидро-L-аскорбиновой кислоты (ДГК)Sigma-Aldrich30790Водные растворы теоретически дают 2 моля мономера ДГК на моль димера ДГК
Цитохалазин BSigma-AldrichC6762Стоковые растворы, приготовленные в ДМСО или этаноле
Аскорбатоксидазы (АО)Sigma-AldrichA0157Стоковые растворы (120 ЕД/мл) могут быть приготовлены в PBS или MBS, а затем заморожены в аликвотах
Феррицианид калия (FIC)Sigma-Aldrich455989тригидрат
ферен-S (3-(2-пиридил)-5,6-ди(2-фурил)-1,2,4-триазин-5&прайм;,5&прайм; ′-дисульфоновая кислота динатриевая соль)Sigma-Aldrich92940
L-глутамат натрияSigma-Aldrich
L-глутаминSigma-Aldrich
SaponinSigma-Aldrich47036Приготовьте 0,1% стоковый раствор
Стоковые растворы для внутриклеточного определения аскорбата анализ
3 М ацетат натрия (рН 6,0)
Ледяная уксусная кислота
0,2 М лимонная кислота
3,3 мМ FeCl<суб>3 в 0,1 М уксусная кислота
30 мМ ферен-S
50% (v/v) уксусная кислота + 30% (w/v) трихлоруксусная кислота (TCA)
Стоковые растворы для аскорбат-эффлюксного
АО (120 Ед/мл)
2,4 мМ ферен-S
0,12 мМ FeCl<суб>3 в 0,6 мМ натрия-цитрата
анализа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
  2. Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
  3. Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
  4. Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
  5. Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
  6. Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
  7. May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
  8. Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
  9. Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
  10. Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
  11. Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
  12. Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
  13. Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
  14. May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
  15. Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
  16. Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
  17. May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
  18. Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
  19. Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
  20. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
  21. Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
  22. Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
  23. Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
  24. Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
  25. Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
  26. Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
  27. Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
  28. Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
  29. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  30. May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
  31. Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
  32. Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
  33. Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
  34. Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
  35. Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
  36. Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
  37. Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
  38. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
  39. Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
  40. Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
  41. Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
  42. Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
  43. Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
  44. May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
  45. Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ferene SK562

Похожие статьи