Аскорбат играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только вышли на свет в последние годы. Здесь мы опишем средне-пропускную способность, конкретное и недорогой микропланшетного анализ для определения как внутри-и внеклеточной аскорбиновой кислоты в клеточной культуре.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Витамин С (аскорбиновая кислота) играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только приходят на свет в последние годы. Например, в головном мозге, аскорбиновая кислота действует в нейропротективного и нейромодуляторного образом, что включает в себя аскорбат велосипеде между нейронами и вицинальных астроцитов - отношения, которые, как представляется, решающее значение для мозга аскорбат гомеостаза. Кроме того, новые данные наводит на мысль, что аскорбиновая кислота имеет значительно расширенную роль в регуляции клеточного и системного метаболизма железа, чем в классическом признается. Растущее признание интегральной роли аскорбиновой кислоты в нормальной и разрегулированной клеточном и организменном физиологии требует ряд средне-пропускной и высокочувствительных аналитических методов, которые могут быть выполнены без необходимости сильно дорогой специального оборудования. Здесь мы предлагаем четкие инструкции для средней пропускной, конкретные и относительно недорогой микропланшетного анализ для определения бой внутри-и внеклеточной аскорбиновая кислота в клеточной культуре.
Введение
Открытие химической природы аскорбиновой кислоты (витамин С), и его идентификации в качестве долгожданного "антицинготными фактора», Альберт Сент-Дьерди и другие в статьях, опубликованных с 1928 по 1934 1 были знаковые события в истории биохимии. В самом деле, эти открытия способствовали Сент-Дьерди присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1937 году. Постоянно расширяющийся набор ролей для аскорбиновой кислоты в животных и физиологии растений, а также на здоровье человека, по-прежнему являются субъекты активная научная Расследование и споры.
L-аскорбат является обильное физиологи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определите внутриклеточных аскорбиновая кислота в культивируемых клетках
- Клеточная культура и сбор урожая
- Расти суспензии (например эритролейкемии человека, К562) или прилипшие клетки (например, первичные астроциты) с использованием стандартных процедур культуры 19-21,32,38. Примечание: для обеспечения клетки содержат аскорбиновой кислоты, загрузить культивируемых клеток с аскорбиновой кислотой либо как аскорбиновая кислота или DHA 33,39.
- Создайте аскорбат содержащих клеточного экстракта
- Инкубировать соответствующее количество забуференного фо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Определение внутриклеточного аскорбат в культуре клеток суспензии
В первом тесте (рис. 1), внутриклеточный аскорбат определяется после аскорбат конкретным (т.е. АО-чувствительных) уменьшение феррицианида чтобы ферроцианид, используя высокочувствительный определение ферроцианидом по ранее опубликованной процедуры 37. Обнаружение аскорбата основана на колориметрического комплексообразования двухвалентного железа, полученного с помощью аскорбат-зависимой снижен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье мы представляем два быстрых, конкретных и относительно чувствительных колориметрических микропланшета тесты для определения аскорбиновой кислоты, полученной из внутри-и внеклеточных отсеков в культивируемых клетках. Анализы могут комплектоваться доступа к стандартным лабораторным оборудованием и реактивами. Только умеренно дорогостоящий реагент, необходимое для анализа является АО, который имеет важное значение, поскольку это придает высокую степень специфичности к аналита L-аскорби.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны доктору Стивену Робинсон и г-жи Хании Czerwinska (Monash University) за щедрую поставку астроцитов культур.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Nunc 96-луночный планшет с плоским дном | Thermo | 269620 | Любой плоскодонный 96-луночный планшет может быть использован |
| Охлаждаемая настольная микроцентрифуга | Eppendorf | 5415D | Также может использоваться неохлаждаемая микроцентрифуга, которая была выровнена по температуре в холодном помещении |
| Охлаждаемая настольная центрифуга | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Микропланшетный спектрофотометр | Bio-Rad | Любой микропланшетный спектрофотометр, способный считывать показания на длине волны 593 нм, может использоваться и рекомендуется. Если используется считыватель пластин на основе фильтра, выберите ближайшую возможную длину волны и используйте метод стандартной кривой. | |
| Ependorf MixMate (микропланшетный орбитальный смеситель) | Eppendorf | Это очень универсальный и надежный микропланшетный смеситель, который очень хорошо подходит для следующих анализов | |
| : | |||
| Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4 | |||
| MOPS-буферный физиологический раствор (MBS); 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 15 мМ MOPS-Na+, pH 7,3 | |||
| MBS + 5 мМ D-глюкоза (MBS/D) | |||
| HEPES-буферный физиологический раствор + 5 мМ D-глюкоза (HBS/D); 137 мМ NaCl, 5,2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2• 2 H2O, 0,8 мМ MgSO4• 7 H2O, 5 мМ D-глюкоза, 20 мМ HEPES-Na+, pH 7,3) | |||
| Буфер для пермеабилизации клеток (CPB; 0,1% сапонин в PBS) | |||
| Общие химикаты | |||
| L-аскорбиновая кислота или L-аскорбат натрия | Sigma-Aldrich | Должны быть получены препараты высочайшей чистоты | |
| Димер дегидро-L-аскорбиновой кислоты (ДГК) | Sigma-Aldrich | 30790 | Водные растворы теоретически дают 2 моля мономера ДГК на моль димера ДГК |
| Цитохалазин B | Sigma-Aldrich | C6762 | Стоковые растворы, приготовленные в ДМСО или этаноле |
| Аскорбатоксидазы (АО) | Sigma-Aldrich | A0157 | Стоковые растворы (120 ЕД/мл) могут быть приготовлены в PBS или MBS, а затем заморожены в аликвотах |
| Феррицианид калия (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | тригидрат |
| ферен-S (3-(2-пиридил)-5,6-ди(2-фурил)-1,2,4-триазин-5&прайм;,5&прайм; ′-дисульфоновая кислота динатриевая соль) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| L-глутамат натрия | Sigma-Aldrich | ||
| L-глутамин | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Приготовьте 0,1% стоковый раствор |
| Стоковые растворы для внутриклеточного определения аскорбата анализ | |||
| 3 М ацетат натрия (рН 6,0) | |||
| Ледяная уксусная кислота | |||
| 0,2 М лимонная кислота | |||
| 3,3 мМ FeCl<суб>3 в 0,1 М уксусная кислота | |||
| 30 мМ ферен-S | |||
| 50% (v/v) уксусная кислота + 30% (w/v) трихлоруксусная кислота (TCA) | |||
| Стоковые растворы для аскорбат-эффлюксного | |||
| АО (120 Ед/мл) | |||
| 2,4 мМ ферен-S | |||
| 0,12 мМ FeCl<суб>3 в 0,6 мМ натрия-цитрата |
Ссылки
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
