Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг

Summary

Протокол добыча общего белка с использованием мочевины / тиомочевины / SDS буфера для человека и мышей мозговой ткани позволяет Идентификация белков по 2D-Dige и их последующей характеристики по мини 2DE иммуноблоттинга. Этот метод позволяет получить более воспроизводимые и надежные результаты от человека биопсии и экспериментальных моделей.

Abstract

Электрофорез Двумерная гель (2DE) является мощным инструментом, чтобы раскрыть Proteome изменения потенциально связанные с различными физиологическими или патологическими состояниями. В основном, этот метод основан на разделении белков в соответствии с их изоэлектрической точке на первой стадии, а во-вторых в соответствии с их молекул рной массы методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). В этом докладе оптимизирован протокол пробоподготовки для небольшого количества человеческой посмертного и мышь мозговой ткани описывается. Этот метод позволяет выполнять как двумерный электрофорез разница флуоресценции геля (2D-Dige) и мини-2DE иммуноблоттинга. Сочетание этих подходов позволяет не только найти новые белки и / или модификации белка в их экспрессии, благодаря его совместимости с массовой обнаружения спектрометрии, но и новый взгляд на проверки маркеров. Таким образом, мини-2DE сочетании с западными блоттинга разрешений для идентификации и проверки постЦионные модификации, белки катаболизм и обеспечивает качественное сравнение между различными условий и / или лечения. В данном случае мы предлагаем способ для изучения компонентов белковых агрегатов, найденные в БА и деменцию с тельцами Леви, такие как бета-амилоида пептида и альфа-синуклеина. Наш способ может быть адаптирован таким образом, для анализа протеома и нерастворимые белки извлечь из мозговой ткани и мышей моделей человека слишком. Параллельно, он может дать полезную информацию для изучения молекулярных и клеточных путей, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, а также потенциальных биомаркеров новых и терапевтических целей.

Introduction

Психические и неврологические расстройства составляют 13% от глобального бремени болезней, новые проблемы как патофизиологических механизмов, факторов риска и продромальными биомаркеров должны быть изучены ^1. В соответствии с этой целью, протеомики исследования человеческого мозга стали незаменимыми, чтобы раскрыть молекулярные пути, участвующие в таких процессах, как память, поведение, эмоции и нейронной пластичности, например, не только для физиологического, но и для патологических состояний. Таким образом, использование животных моделей и, в частности трансгенные мыши, приносит широкий спектр возможностей, чтобы имитировать этиологии нейродегенеративных....

Protocol

1. Гомогенизация и общего белка Добыча человека и мыши, ткани головного мозга

1. Мозговая ткань гомогенизации. Однородный ткани головного мозга 10% (вес / объем) в 8 М мочевине, 2 М тиомочевины и 1% вес / объем SDS буфера (ОТС) с использованием Поттер стекло (для образцов человека) или гомогенизатор Teflon (для мышей образцов). Разрушать ультразвуком при 60 Гц 30 импульсов с ультразвуковым генератором, применяющие 0,5 сек для полного ткани распада ^{13, 14.}
   1. Определить концентрацию белка с Бредфорда, используя BSA в качестве стандарта. Это UTS добыча буфер полностью совместим с одним размерности SDS-PAGE, пока лизаты не чрезмерно нагревается,....

Results

Протеомика на ткани головного мозга остается сложной, так как существует идеального буфер не существует, чтобы восстановить 100% белков, особенно ассоциированных с мембранами или цитоскелета белки. Первый набор экспериментов были сосредоточены на поиске подходящего буфера для лизиса, совместимой с этими двумя подходами и что позволяет восстановить большую панель белка. Таким образом, три лизиса буферы были проанализированы, чтобы определить наиболее подходящую. Во-первых, он был использован общий биохимических и молекул.......

Discussion

Открывая патологические изменения экспрессии белков, поиск биомаркеров и модуляция потенциальных путей фармакологических мишеней являются одними из целей neuroproteomics подходы ^30. На фоне развивающихся инструментов, поле 2DE добавляет многообещающее ожидаемый. Тем не менее, консенсус должен быть достигнут, чтобы минимизировать вариабельность и повысить воспроизводимость в экспериментах. В соответствии этой идеи стандартизированный протокол для выполнения 2D-Dige (рис. 2) и последующее 2DE и.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 нмоль 1 * 5 нмо	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Референс в зависимости от интервала/размера pH
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Референс в зависимости от желаемого интервала pH
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 л	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Пластиковая коробка для проведения пассивной регидратации
MILLEX GS Фильтр	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Сборные гели 13,3 x 8,7 см (Ш x Д)	Bio-Rad		Референс в функции СВЧ для разделения
изоэлектрического фокусирующего блока IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Большая система электрофореза	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 мм	Гель фирмы	P2D1.5