Протокол добыча общего белка с использованием мочевины / тиомочевины / SDS буфера для человека и мышей мозговой ткани позволяет Идентификация белков по 2D-Dige и их последующей характеристики по мини 2DE иммуноблоттинга. Этот метод позволяет получить более воспроизводимые и надежные результаты от человека биопсии и экспериментальных моделей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Электрофорез Двумерная гель (2DE) является мощным инструментом, чтобы раскрыть Proteome изменения потенциально связанные с различными физиологическими или патологическими состояниями. В основном, этот метод основан на разделении белков в соответствии с их изоэлектрической точке на первой стадии, а во-вторых в соответствии с их молекул рной массы методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). В этом докладе оптимизирован протокол пробоподготовки для небольшого количества человеческой посмертного и мышь мозговой ткани описывается. Этот метод позволяет выполнять как двумерный электрофорез разница флуоресценции геля (2D-Dige) и мини-2DE иммуноблоттинга. Сочетание этих подходов позволяет не только найти новые белки и / или модификации белка в их экспрессии, благодаря его совместимости с массовой обнаружения спектрометрии, но и новый взгляд на проверки маркеров. Таким образом, мини-2DE сочетании с западными блоттинга разрешений для идентификации и проверки постЦионные модификации, белки катаболизм и обеспечивает качественное сравнение между различными условий и / или лечения. В данном случае мы предлагаем способ для изучения компонентов белковых агрегатов, найденные в БА и деменцию с тельцами Леви, такие как бета-амилоида пептида и альфа-синуклеина. Наш способ может быть адаптирован таким образом, для анализа протеома и нерастворимые белки извлечь из мозговой ткани и мышей моделей человека слишком. Параллельно, он может дать полезную информацию для изучения молекулярных и клеточных путей, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, а также потенциальных биомаркеров новых и терапевтических целей.
Введение
Психические и неврологические расстройства составляют 13% от глобального бремени болезней, новые проблемы как патофизиологических механизмов, факторов риска и продромальными биомаркеров должны быть изучены 1. В соответствии с этой целью, протеомики исследования человеческого мозга стали незаменимыми, чтобы раскрыть молекулярные пути, участвующие в таких процессах, как память, поведение, эмоции и нейронной пластичности, например, не только для физиологического, но и для патологических состояний. Таким образом, использование животных моделей и, в частности трансгенные мыши, приносит широкий спектр возможностей, чтобы имитировать этиологии нейродегенеративных....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Гомогенизация и общего белка Добыча человека и мыши, ткани головного мозга
- Мозговая ткань гомогенизации. Однородный ткани головного мозга 10% (вес / объем) в 8 М мочевине, 2 М тиомочевины и 1% вес / объем SDS буфера (ОТС) с использованием Поттер стекло (для образцов человека) или гомогенизатор Teflon (для мышей образцов). Разрушать ультразвуком при 60 Гц 30 импульсов с ультразвуковым генератором, применяющие 0,5 сек для полного ткани распада 13, 14.
- Определить концентрацию белка с Бредфорда, используя BSA в качестве стандарта. Это UTS добыча буфер полностью совместим с одним размерности SDS-PAGE, пока лизаты не чрезмерно нагревается,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протеомика на ткани головного мозга остается сложной, так как существует идеального буфер не существует, чтобы восстановить 100% белков, особенно ассоциированных с мембранами или цитоскелета белки. Первый набор экспериментов были сосредоточены на поиске подходящего буфера для лизиса, совместимой с этими двумя подходами и что позволяет восстановить большую панель белка. Таким образом, три лизиса буферы были проанализированы, чтобы определить наиболее подходящую. Во-первых, он был использован общий биохимических и молекул.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Открывая патологические изменения экспрессии белков, поиск биомаркеров и модуляция потенциальных путей фармакологических мишеней являются одними из целей neuroproteomics подходы 30. На фоне развивающихся инструментов, поле 2DE добавляет многообещающее ожидаемый. Тем не менее, консенсус должен быть достигнут, чтобы минимизировать вариабельность и повысить воспроизводимость в экспериментах. В соответствии этой идеи стандартизированный протокол для выполнения 2D-Dige (рис. 2) и последующее 2DE и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов объявить.
Благодарности
Эта работа была поддержана Inserm, Университет Лилль 2, MEDIALZ, LabEx (совершенство лаборатории, программа инвестировать в будущее) и DISTALZ (Разработка инновационных стратегий для Transdisciplinary подхода к болезни Альцгеймера). FJ.FG в настоящее время является получателем общение ANR (Французское национальное агентство Исследования / NeuroSplice де Тау Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), но эта работа была также при поддержке гранта от JCCM (Испания).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 нмоль 1 * 5 нмо | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Референс в зависимости от интервала/размера pH | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Референс в зависимости от желаемого интервала pH | |
| AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 л | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 | Пластиковая коробка для проведения пассивной регидратации |
| MILLEX GS Фильтр | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Сборные гели 13,3 x 8,7 см (Ш x Д) | Bio-Rad | Референс в функции СВЧ для разделения | |
| изоэлектрического фокусирующего блока IPGphor III | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Большая система электрофореза | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 мм | Гель фирмы | P2D1.5 |
Ссылки
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
