Здесь мы опишем протокол, используя мини-himar1 моряка транспозонов-опосредованной мутагенеза для генерации вставки высокой плотности мутантный библиотеку для экрана, изолировать и идентифицировать новые регуляторы альгината в прототипического синегнойной палочки штамма PAO1.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Идентификация новых генов, ассоциированных с альгината производства в
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Синегнойная палочка является грамотрицательная, окружающей бактерию с универсальными метаболических возможностей. П. палочки является оппортунистической бактериальный патоген, который устанавливает хронические легочные инфекции у пациентов с кистозным фиброзом (CF). Перепроизводство в капсульного полисахарида под названием альгинат, также известный как mucoidy, способствует образованию слизистых биопленок, которые более устойчивы, чем планктонных клеток к химиотерапии антибиотиков и защитных сил организма. Кроме того, переход от nonmucoid к слизистой фенотипа является клиническим маркером наступления хронической инфекции в CF. Альгинат перепроизводство через Р. палочки является эндергонических процесс, который облагает большими налогами клеточной энергии. Таким образом, альгинат производство жестко регламентируется в P. палочки. Чтобы лучше понять, альгинат регулирование, мы опишем протокол с помощью мини-himar1 транспозонов мутагенеза для идентификации нового регулятора альгинатас в прототипического штамма PAO1. Процедура состоит из двух основных этапов. Во-первых, мы передали мини-himar1 транспозон (pFAC) от принимающей Е. палочка SM10/λpir в получателя P. палочки PAO1 через biparental сопряжения для создания вставки высокой плотности мутантный библиотеку, которые были отобраны на Pseudomonas изоляция пластин агара с добавлением гентамицина. Во-вторых, мы провели скрининг и изолировали слизистая колонии для отображения место введения посредством обратного ПЦР с использованием праймеров ДНК, указывающие наружу из кассеты гентамицина и секвенирования ДНК. Используя этот протокол, мы определили два новых регуляторов альгинат, mucE (PA4033) и kinB (PA5484), в штамм PAO1 с дикого типа Muca кодирующий фактор анти-сигма Muca для мастер-регулятора альгината AlgU (ALGT, σ 22) . Этот протокол мутагенеза высокой пропускной могут быть изменены для идентификации других генов вирулентности связанных вызывает изменения в колоNY морфология.
Введение
Способность оппортунистической, грамотрицательных патогенов синегнойной палочки перепроизводства альгинат является основным фактором в его способности установить биопленку. Перепроизводство альгинат представляет собой фенотип часто называют mucoidy. Изоляция слизистых колоний от мокрота лиц, страдающих муковисцидозом (CF) свидетельствует о хронической инфекции, и непосредственно связана с общим снижением здоровья пациента 1. В настоящее время, следует понимать, что регулирование и производство альгината в P. палочки в первую очередь происходит в двух оперонов. Первым из них является альгинат биосинтеза оперона, который содержит 12 генов (algD - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - Algi - algJ - algF - водоросль), которые отвечают за синтез и экспорта альгината полимера через периплазму с внеклеточным Environmeнт 2-5. Второй оперона является кластер генов начиная с альтернативной фактора сигма algU / T и продолжая Muca, mucB и mucD. AlgU / T является положительным регулятором, в то время как mucAB-D классифицируются как негативных регуляторов альгината производства 6-8. Кроме того, регуляторы транскрипции, такие как ALGB, AlgQ, AlgR и RpoN, а также пост-транскрипционного и пост-трансляционной модификации по катаболитной контроля репрессий, активности киназы (KinB) и внутримембранного протеолиза, также было показано, участвует в альгината регулирование 9-14.
Мини-himar1 транспозонов вектор известен как pFAC была создана в лаборатории доктора Mekalanos 'в Гарвардской медицинской школе 15. PFAC плазмида состоит из мобильных элементов между двух инвертированных повторов из 27 бит и гентамицина кассеты сопротивления в середине (aacC1: 534 п.н.), ген, кодирующий hyperactив моряка транспозазу 16 и ген, кодирующий β-лактамазы (бла) (рис. 1). Информация о последовательности для мобильных элементов из pFAC доступна на номер доступа GenBank: DQ366300 13. В pFAC, существует сайт множественного клонирования (MCS) за гена aacC1, который используется для идентификации месте установки хромосомной с помощью обратной ПЦР. Одно из главных преимуществ с помощью мини-himar1 транспозон никаких конкретных факторы хозяина не требуется для транспозиции (мутагенеза). Кроме того, существует высокая обилие динуклеотид сайтов вставки TA найденных во всем геноме P. палочки. Например, TA сайты встраивания динуклеотида происходит 94404 и 100229 раз в PAO1 (6264404 бит, GenBank номер доступа NC_002516.2) и PA14 (6537648 бит; номер доступа GenBank NC_008463) геномов, соответственно. Из-за обилия динуклеотида TA в геноме, мини-himar1 Транспозона могут привести к высокой плотности и случайного мутагенеза, который является особенно подходящим для анализа генов вирулентности и генов, которые высоко регулируемых. Теоретически, мини-himar1 транспозона можно вставить в любой несущественным гена в геноме P. палочки. Это обеспечивает приблизительно 18 участков вставки TA на открытой рамки считывания в PAO1 генома.
Здесь мы опишем протокол с помощью мини-himar1 транспозонов-опосредованной мутагенеза для идентификации новых регуляторов mucoidy в P. палочки. В частности, мы biparentally конъюгировали вектор pFAC содержащий мини-himar1 транспозон от Е. палочка SM10/λpir в nonmucoid прототрофным штамма PAO1. После транспозона интегрирован в геном штамма получатель культивировали на агаре Pseudomonas изоляции (PIA), содержащих триклозан, который ингибирует рост E. палочка. Таким образом, библиотека мутантов П. палочки могут быть выбраны по росту на PIA пластины с добавлением гентамицина и наличием слизистого фенотипа. Обратите внимание, что истинный транспозонов-опосредованной против интеграционного мутанта будет иметь фенотип, устойчивый и карбенициллина чувствительных гентамицин. В этом исследовании, около 80 тысяч вставки мутанты PAO1 были выделены через четыре отдельных сопряжений. Затем мы скрининг на слизистых изолятов, и определяется место вставки по ферментами рестрикции, лигирования и обратной ПЦР. Мы провели блот анализ с использованием гентамицина кассету сопротивления в качестве зонда, чтобы увидеть количество вставки на геном. Мы решили, что более 90% из полученных мутантов за сопряжения с помощью этого протокола было только одну копию himar1 в геноме и отображается на фенотип, устойчивый и карбенициллина чувствительных гентамицин. В общей сложности 32 мукоидных изолятов были определены, 22 из них были нанесены на карту к разным локусов P. палочки PAO1хромосома. Этот показатель вставки обеспечивает адекватного охвата определить несколько новых регуляторов альгината перепроизводства.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка бактериальных штаммов и Biparental Сопряжение
- Привить E. палочка SM10/λpir/pFAC в 5 мл Лурия бульон (LB) с добавлением 15 мкг / мл гентамицина и место дрожащим инкубаторе в течение ночи при 37 ° С
- Привить P. палочки штамма PAO1 в 5 мл LB, и место в дрожащей инкубаторе в течение ночи при 42 ° С
- Измерьте OD 600 из ночных культур и смешать равные количества PAO1 и Е. палочка pFAC таким образом, что конечный объем составляет от 1-1,4 мл.
- Центрифуга смесь при 6000 мкг в течение 5 мин.
- Между тем, сухой LB пластины для конъюгации: оставить открытыми пластин в инкубаторе при 37 ° С в течение 10-15 мин.
- Удалить все, кроме 50 мкл супернатанта из смеси клеток.
- Ресуспендируют осадок клеток в остальных 50 мкл супернатанта и пипетки на сухую LB пластины в одном компактном капли.
- Осторожно поместите пластину в вытяжном шкафу для просушки (IMPORTANT Примечание: Не позволяйте клетки распространяются по пластине, это значительно снижает эффективность сопряжения).
- После того, как капли сухой, инвертировать LB пластины и инкубировать при 37 ° С в течение 4-6 часов.
- В то время как смесь клеток инкубации, подготовить большое (150 OD х 15 мм) PIA пластины с 300 мкг / мл гентамицина. Перед использованием удаления остаточной влаги, поместив в термостате при 37 ° С в течение 15-20 мин.
- После инкубации смеси клеток завершена, сбора клеток с использованием стерильного прививки петли и в микроцентрифужных трубки, содержащей 1 мл LB и вихрь, или пипетку, чтобы тщательно перемешать.
- Распространение клетки равномерно на большой PIA пластины содержат 300 мкг / мл гентамицина. (ВАЖНО: Для этого шага, то лучше добавить возрастающих объемов смеси клеток, чтобы отделить пластины (например, плиты 1: 10 мкл, плиты 2: 50 мкл, плиты 3: 100 мкл, плиты 4: 500 мкл, и т.д.) .
- Выдержите в течение ночи при 37° C.
2. Обнаружение и выделение слизистая колоний
- Удалить пластины из инкубатора и изучить для слизистых колоний.
- Изолировать один слизистая колонию и полоса для изоляции на небольших пластин (100 OD х 10 мм) с PIA и 300 мкг / мл гентамицина.
- Выдержите в течение ночи при 37 ° С
- Повторите шаг 2.2 на предыдущей ночной культуры.
- Повторите шаги 2.2-2.4 два более раз, чтобы определить устойчивость слизистой изолята.
- После конечной стадии изолята, инокуляции 4,5 мл LB с одним слизистые колонии и инкубировать в шейкере в течение ночи при 37 ° С.
- На следующий день, этикетка 3 микроцентрифужные пробирки для каждого мукоидного мутанта.
- Приготовьте два 1,25 мл аликвоты ночной культуры на 2 трубы для геномной выделения ДНК и идентификации месте введения транспозонов (см. протокол 3).
- Кроме того, архив каждый слизистая мутанта с помощью пипетки 1 мл ночной культуры в appropriatEly меченных криопробирку содержащий равный объем 10% обезжиренного молока. Хранить при -86 ° С.
3. гДНК Ограничение Пищеварение и перевязка
- Выписка гДНК от мукоидного мутанта, используя любой предпочтительный способ (например,. Фенол-хлороформ, спин колонки и т.д.).
- Определить концентрацию гДНК, переварить в общей сложности 2 мкг с 1 мкл рестриктазы SalI, 0,5 мкл бычьего сывороточного альбумина, 5 мкл фермента SalI буфера (100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl 2 , 1 мМ Dithiothrietol (DTT), рН 7,9 при комнатной температуре), и соответствующий объем дН 2 O для достижения общего объема 50 мкл.
- Дайджест ДНК в течение ночи при 37 ° С (ВНИМАНИЕ:. В зависимости от эффективности фермента рестрикции, это может быть необходимо добавить дополнительный 1 мкл в течение ночи дайджеста и инкубируют при 37 ° С в течение 1-2 ч. Это в дополнение к ночной дайджеста).
- Очищают DigeSTED ДНК с помощью любого предпочтительный способ (например, агарозном очистки гель, спин колонок) и элюирования с 25 мкл буфера.
- Лигируют с расщепленной ДНК смешиванием 11 мкл очищенной ДНК с предпочтительным концентрации ~ 10-20 нг / мкл, 1,5 мкл буфера дл лигировани (330 мМ Трис-ацетат, рН 7,5, 660 мМ ацетата калия, 100 мМ ацетат магния, 5 мМ ДТТ), 1,5 мкл 100 мМ АТФ и 1 мкл ДНК-лигазы.
- Выдержите смесь в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем инактивации фермента путем инкубации в течение 15 мин при 70 ° С (Примечание: инкубирования смеси при комнатной температуре в течение дольше может увеличить успех лигирования).
4. Обратная ПЦР (IPCR) и Анализ последовательности
- Выполните IPCR на перевязки продукта с использованием следующих прямого и обратного праймеров и термоциклировании условия:
-Прямой праймер (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Обратный праймер (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Термоциклеры Кондизаказчиком:
1. 94 ° С в течение 1 мин.
2. 94 ° С в течение 1 мин.
3. 58 ° C в течение 2 мин.
4. 72 ° С в течение 2 мин.
5. 72 ° С в течение 8 мин.
6. 10 ° C удержания.
Повторите шаги 2-4 для 34 циклов.
(ПРИМЕЧАНИЕ: продукты Усиленный IPCR можно хранить при 4 ° С) - Выполнение электрофореза в агарозном геле, чтобы подтвердить успешной амплификации IPCR.
- Выполните последовательности от продукта IPCR использованием праймеров Gm3OUT и Gm5OUT. Сайт вставки и ориентация himar1 которые наметили.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как показано на рисунке 1, мини-himar1 моряк транспозонов вектор, pFAC, содержит два 27 б.п. инвертированные повторы с сайты встраивания TA фланговые сопротивления кассету aacC1 гентамицин, с его σ 70-зависимого промотора, и сайтом множественного клонирования (MCS). Кроме того, вектор pFAC содержит гены, кодирующие высокоактивной himar1 транспозазу, β-лактамазы (BLA), а передача TRA оперон. Сайты вставки TA обеспечивают эффективное интеграции в ген...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Важно отметить, что этот метод может быть использован в других видов Pseudomonas с этими изменениями: инкубировать P. флуоресцирующей и П. putida при 30 ° С и P. stutzeri при 42 ° С; П. stuzeri должны быть культивированы на LB пластины с добавлением 150 мкг / мл гентамицина; на шаге 1,11, P. stutzeri клетки должны быть переданы в 500 мкл LB вместо 1 мл. Кроме того, есть два важных шагов для этого протокола. Во-первых, штамм-реципиент должен быть культивированы при со...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор Хонгвей Д. Ю. является главный научный сотрудник и соучредитель прогенез технологий, ООО.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным аэронавтике и исследованию космического пространства Западной Вирджинии космических грантов консорциума (НАСА WVSGC), Муковисцидоз Фонда (CFF-YU11G0) и NIH P20RR016477 и P20GM103434 к идее сети Западной Вирджинии для биомедицинских исследований передового опыта. Мы благодарим Vonya М. Айзингер за техническую помощь с этой работой.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бульон Luria | Difco | 240230 | через Fisher Scientific |
| Pseudomonas изоляционный агар | Difco | 292710 | через Fisher |
| Scientific Маленькие пластины (100 O.D. x 10 мм) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Большие пластины (150 O.D. x 15 мм) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Глицерин | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Настольный встряхивающий инкубатор | Нью-Брансуик Scientific | Innova 4080 | встряхивание при 200 об/мин |
| Кабинетный инкубатор | VWR | 1540 | |
| Настольная микроцентрифуга | Sorvall | 75-003-287 | через |
| спектрофотометр | Bio-Rad | 170-2525 | или предпочтительный метод/поставщик |
| Одноразовые петли для инокуляции | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1,5 мл Микроцентрифужные пробирки | Fisher | Scientific 05-408-129 | |
| 2,0 мл Криогенные флаконы | Corning | 430659 | через Fisher Scientific |
| 15 мл Пробирки | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Обезжиренное молоко | Difco | DF0032-17-3 | через Fisher Scientific |
| DNeasy Кровь и ткань (250) | Qiagen | 69506 | или предпочтительный метод/поставщик |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | или предпочтительный метод/поставщик |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | или предпочтительный метод/поставщик |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | через блок Fisher Scientific |
| Accu Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | через Fisher Scientific |
| Sal1, эндонуклеазу рестрикции | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | через Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, термоциклер | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Геномат | 3120-500 | через Fisher Scientific |
| гентамицина сульфат | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2,0 мл Криогенные флаконы | Corning | 430659 | через Fisher Scientific |
Ссылки
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
