Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий

20.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51354

⸱

30 апреля 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

В этой статье

Краткое содержание

В пробирке культуры системы оказались незаменимым для понимания позвоночных миогенеза. Однако многое еще предстоит узнать о nonmammalian развития скелетных мышц и роста, особенно в базальных таксонов. Эффективный и надежный протокол для выделения взрослых стволовых клеток этой ткани, миогенных клеток-предшественников (ПДК), и поддержание их самообновление, пролиферацию и дифференциацию в первичной настройке культуры позволяет для идентификации консервативных и расходящихся регуляторных механизмов на протяжении позвоночные линий.

Аннотация

Из-за присущего сложности и времени, с изучением миогенную программу в естественных условиях, основные системы культуры, полученные из резидентов взрослых стволовых клеток скелетных мышц, миогенных клетки-предшественники (ПДК), доказали, незаменимым для понимания млекопитающих развития скелетных мышц и рост. Особенно среди базальных таксонов позвоночных, однако, данные ограничены описания молекулярных механизмов, контролирующих самообновление, пролиферацию и дифференцировку ПДК. Особый интерес представляют возможные механизмы, лежащие в основе способности базальных позвоночных пройти значительное постларвальных скелетных мышечное волокно гиперплазии (т.е. костистых рыб) и полный регенерации следующие придаток потери (т.е. urodele земноводных). Кроме того, использование культивируемых миобластов может помочь в понимании регенерации и обобщенная информация о миогенного программы и различия между ними. КС этой целью мы подробно надежную и эффективный протокол (и вариации в нем) для выделения и поддержания ПДК и их потомство, миобластов и незрелых мышечных трубках, в культуре клеток в качестве платформы для понимания эволюции миогенной программы, начиная с более базальные позвоночных. Капитализация на модели статуса организма от рыбок данио (Danio рерио), мы сообщаем о применении настоящего Протокола на небольших рыб карповых клады Danioninae. В тандеме, этот протокол может быть использован для реализации более широкого сравнительного подхода, изолируя ПДК от мексиканской аксолотля (Ambystomamexicanum) и даже лабораторных грызунов. Этот протокол в настоящее время широко используются при изучении миогенез в нескольких видов рыб, в том числе, радужной форели, лосося и морского леща 1-4.

Введение

Значительное понимание миогенеза млекопитающих была получена через репризе этого процесса в обоих первичного мышь (Mus Musculus) миобластов культур и хорошо описанной мыши происхождения клеточной линии, C2C12 5. Начиная с 1950-х годов 6, эти культуры привели к большому прогрессу в понимании murinemyogenic программы и, как следствие, миогенеза у других позвоночных. Кроме того, одной клетки методы миофибрилл эксплантов увеличились из понимания взаимодействий между сателлитных клеток и окружающих мышечных волокон 7-9. Культуры клеток особенно привлекательным для исследований миогенеза из-за короткого времени предшественника к дифференцированному ячейки 10, относительной легкости трансфекции для РНК-интерференции 11-14, трансгенные 15,16 и избыточная экспрессия исследования 14,17,18, расширение в пробирке с последующей трансплантацией в естественных условиях 18-20, и даже получения оценочногоАрисон миогенных клеток-предшественников и их агентов регулирующих всей таксонов 21,22. В то время как различия, связанные с искусственной среде системе культуры были описаны 5,23, системы эти в пробирке оказались незаменимым в нашей рассечения сложной программы, регулирующей формирование многоядерные, терминально дифференцированных myofibersfrom Мононуклеированные пролиферативные клетки-предшественники, известные как myosatellite клетки (МСК) среди млекопитающих.

Вне классу млекопитающих, однако, сохранение и / или расхождение механизмов, контролирующих миогенез плохо изучены, в основном из-за трудностей в культивировании миогенные клетки-предшественники (ПДК) и миобластов из различных таксонов. В самом деле, первичные миобластов культуры описаны лишь в трех птиц 24-26, одного гада 27, несколько амфибий 28-30 и некоторых рыб 1,3,4,31-33. Непрерывные миогенные клеточные линии от векроме грызунов 34-36 rtebrates встречаются еще реже, с той лишь не-млекопитающих миогенной клеточной линии были построены на основе японского перепела (Cortunix японская), QM7 37. Несмотря на многочисленные попытки увековечения, костистых миогенной клеточная линия остается неуловимым и протокол для эффективной трансфекции этих клеток был только опубликован этот 15 год. Таким образом, четкие и хорошо оптимизированные протоколы для культивирования первичных ПДК и миобластов из различных позвоночных очень нужны не только дальнейшее расширение наших знаний о эволюции миогенной программы, но использовать силу сравнительной физиологии делать прорывы в лечение скелетных заболеваний и расстройств человека мышц.

В то время как в литературе имеются многочисленные сообщения о изоляции ПДК / миобластов 38-49, он является общим для авторов описать протоколы для таких выделений в краткой, часто неполные, форматов. Кроме того, наиболее поучительные протоколы репоrted были разработаны для мышей 50-53, и некоторые из них полагаются на выбор антител 54,55 или флуоресцентных трансгенов 56,57, что делает эти протоколы непригодным или непрактичные сокровенные видов не-грызунов, используемые мышечных биологов. С малоизвестный о Piscine, амфибии, рептилии и миогенеза, подробное и тщательное протокола, описанного с аудиовизуальной руководством и при продемонстрировали эффективности в отдаленно родственных видов, будет наиболее полезным для области.

Впервые описан Пауэлл и его коллеги в 1989 году 58, в следующем протокол изначально был разработан, чтобы изолировать ПДК и миобластов из лососевых рыб (а именно, радужной форели, радужная форель и семга, Salmo Salar) и некоторых крупных рыб семейства карповых (т.е. золотая рыбка, Carassiusauratusauratus) . В 2000 году Fauconneau и Paboeuf оптимизирован первичной культуры миобластов для радужной форели 59, и minoroptimizations маде этого протокола усвояемой в несколько более мелких пескарей в кладе Danioninae (данио, Danio рерио, и гигантский данио, Devario aequipinnatus) 32 в связи с многочисленными генетических инструментов, доступных для рыбок данио работы и, таким образом его близких родственников. Костистых рыб являются привлекательными организмы для исследования в связи с их расходящихся стратегии роста (по крайней мере у большинства видов). Большие лососевых, как и большинство рыб, растут неопределенно, с потенциалом роста свободной от асимптоты в конце срока, даже в пожилом возрасте 60-62. В отличие от рыбок данио, большие danionins такие как гигантский данио 63 и усатых потенциалов роста данио дисплей типичных костистых рыб, что делает их прямое сопоставление идеальной платформой для понимания, играет ли судьба клеток MPC выбор роль в скелетных мышц гиперплазии против гипертрофии.

Кроме того, мы показали, что этот протокол может быть использован с мышами и аксолотлях, с относительно высоким выходом клеток и viabСОСТОЯНИЯ индексы. Urodele саламандры, такие как мексиканский аксолотля (Ambystomamexicanum), обладают замечательной способностью к регенерации тканей, в том числе целых конечностей и хвостов 64-66. Эта особенность делает этих земноводных интересные модели скелетной атрофии мышц и старения. Используя протокол, описанный ниже, подобный подход может осуществляться как это было сделано во многих видов рыб, обеспечивая еще более широкий сравнительный контекст для таких исследований. Как и многие действительно сравнительные биологи оценить, наиболее значимые достижения в области фундаментальной биологии и поступательного биомедицины может быть сделано, когда данные анализируются в широком спектре (здесь, весь ветви позвоночных).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике: Все эксперименты с участием позвоночных животных, описанных здесь был утвержден заранее в Уходу за животными и использованию комитета университета Алабамы в Бирмингеме на и согласуется с руководящими принципами, установленными Управлением лабораторных животных обеспечения, Национальных Институтов Здоровья США Департамент здравоохранения и социальных служб.

1. Подготовка к культуре

  1. Подготовьте основной среды следующим образом: 9 мМ NaHCO 3 (1,51 г в 2 л), 20 мМ HEPES (9,53 г в 2 л) в среде DMEM (13,48 г / л; 26,96 г на 2 л).
    1. Определите рН и приспособиться к 7,40 с HCl или NaOH.
    2. Определите осмотическое давление и приспособиться к ~ 300 мосм с NaCl (при необходимости).
    3. Фильтр стерилизовать с помощью (2) системы 1 л вакуумной стерилизации и хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света до 2-3 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. таблицы 1 и 2 для полного реагента, инструменты, потребителименных и информационное оборудование.
  2. Подготовка поли-L-лизин-обработанных пластин растворением 5 мг γ-облучении поли-L-лизин (> 300000 Mw) в 50 мл ультрачистой стерильной водой. Осторожно перемешать с помощью инверсии в течение 10 мин при комнатной температуре, обеспечивая полную растворение лизина полимеров.
  3. Внесите необходимую сумму поли-L-лизин раствора в каждую лунку, в зависимости от типа пластины (табл. 3). Разрешить плиты стоять в капот ламинарного потока в течение 5 минут.
  4. Затем удалите поли-L-лизин раствор и дважды промывали стерильной водой. Разрешить пластин высохнуть на воздухе в капот ламинарного потока в течение 20 минут.
  5. Получение 1 мг ламинина (Engelbreth-Холм-рой происхождения) и растворить в 50 мл основной среды до конечной концентрации 20 мкг / мл. Применить ламинин решение поли-L-лизина обращению клеточных культур пластин при 2 мкг / см 2. (См. таблицу 3 для различных размеров пластин)
  6. Аккуратно водоворот решение, чтобы убедиться фуLL хорошо охват. Уплотнение пластин с лабораторной ленты и место в инкубаторе в течение 24 часов. Инкубатор должен быть установлен на соответствующей температуре в течение видов используемых (см. таблицу 7), и никакие дополнительные газы не должны быть добавлены в инкубаторе.
    Примечание: Laminin должно быть разрешено придерживаться пластин в течение 24 часов перед посевом клеток. Невыполнение этого требования приведет к бедным не клеточного присоединения.
  7. Подготовьте носитель, как описано в таблице 4. Полный СМИ является наиболее подготовленным в день использования.
  8. В рамках подготовки к изоляции ткани, собрать следующие предметы и автоклав: 300-500 мл стакан (ы); блюда стекло Петри; Скальпель ручки; щипцы (тонкого и грубого); рассечение ножницами; и несколько листов водоотталкивающий автоклавного бумаги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого человека оказывает помощь в процессе вскрытия, (2) скальпель ручки, (1) щипцы (тип в зависимости от личных предпочтений), (1) рассечение ножницами, и (5-10) листы водоотталкивающий автоклавного документе, являютсядостаточно.
  9. В дополнение к автоклавного пунктов выше, собрать 70% этанола, весовой баланс, стерильные конические пробирки 50 мл (количество зависит от размера культуры) и лед.

2. Рассечения тканей

  1. Прежде чем начать, убедитесь, что достаточный запас рыбы доступно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: возраст рыбы, которые будут использоваться имеет решающее значение. В то время как рыба из двух разных видов может быть подобных весов, младший рыбы одного вида будет обладать более ПДК, чем старой рыбы другого вида. Как правило, молодой рыбы, особенно при работе с лососевых, являются лучшими. Для danionins, рыба же стара, как один год может быть использован оптимально, а лососевые в возрасте 4-6 месяцев или молодого (до 15 г) являются оптимальными.
  2. Для каждого 5 г ткани, которая будет расчлененный, аликвоту 25 мл изоляции среды в стерильный 50 мл коническую трубку.
  3. Взвесьте, запись массу, и число трубку (ы). Поместите пробирки на лед.
  4. Усыпить 2-3 рыбув то время, путем погружения в> 300 мг / л бикарбоната натрия буфером Tricaine метансульфонат. Разрешить оперкулярной прекратить движение для> 5 минут и затем погружать рыбы в 70% этаноле (содержащейся в стерильных стаканах) в течение 30 секунд.
  5. Удалить рыбу из 70% этанола и поместите на воде-репеллент автоклавного бумаги. Непосредственно за opercula, использовать скальпель, чтобы сделать поверхностный, неглубокий надрез. Удалите весы и кожу, держа кожу в вышеупомянутой разрез и тянуть в сторону хвоста рыбы.
  6. После удаления кожи, акцизного эпаксиальных, быстро гликолитический 'белый' мышцы рыбы с обеих сторон (избегая медленно-окислительный «красный» мышца, расположенная недалеко от боковой линии) и место в изоляции среды. Откажитесь оставшуюся часть рыбы в соответствии с требованиями организации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, вполне возможно, в культуре ПДК, происходящих из красной мышцы, почти каждый публикация помощью костистых ПДК использовала клетки, выделенные из эпаксиальной мyotome.
  7. Повторите этапы 2,4-2,6 пока достаточное количество мышц не будет получена. Во время вскрытия, убедитесь, что складочном мышечной ткани остается на льду для поддержания жизнеспособности клеток.

3. Механическая диссоциация

  1. Налейте один тюбик 25 мл / 5 г мышечной ткани в стеклянную чашку Петри. Использование двух скальпель ручки с прикрепленными # 10 лезвий скальпеля, фарша ткани к суспензии или пюре консистенции. "Назад и вперед" движение потянув лезвия скальпеля мимо друг друга лучше всего работает.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как ткани гомогенизаторы может показаться необходимости, количество жизнеспособных клеток будет резко сократилось, если не отменено.
  2. Использование 25 мл серологические пипетки и серологическое пипетки, удалите суспендируют ткани и заменить в оригинальной коническую трубку.
  3. Повторите шаги 3.1-3.2, пока все ткани во всех трубок не было механически диссоциируют.
  4. Центрифуга ткани в течение 5 минут при 300 мкг в и 10 ° С.
  5. Фолляблагодаря центрифугирования, отказаться от 25 мл медиа супернатанта с 25 мл серологические пипетки, вакуумный аспиратор, или путем тщательного декантации.
  6. Добавить 25 мл промывочной среды в каждую пробирку, ресуспендируют ткани и recentrifuge как описано выше.
  7. Мыть два раза с тазиком среды, удаления жидкости каждый раз.

4. Ферментативной диссоциации

  1. Во время этапа 3.4, подготовить коллагеназы решение путем объединения 0,22 г Тип IV коллагеназы и 44 мл основной среды (или достаточном количестве на 0,11 g/0.22 мл).
  2. Размешайте в стакане в течение 10-15 минут при 4 ° С. Фильтр стерилизовать с помощью шприца по 50 мл и шприцевой фильтр 0,45 мкм.
    Примечание: Более чем один шприц фильтр может быть необходимо, в зависимости от препарата коллагеназы. Коллагеназа получены из других, чем Уортингтон биохимической поставщиков представляет больше трудностей во время фильтрации. Коллагеназу используется для диссоциации пептидные связи в коллагене, составляющих эндомизии. Этопищеварение будет удалить, что защитный барьер из мышечных волокон.
  3. Для каждого г мышечной ткани, ресуспендируют ткани в 0,2%-ном растворе коллагеназы. Для 5 г мышечной ткани, добавляют 10 мл раствора коллагеназы и 15 мл основной среды.
  4. Добавить 10 мкл PSF на мл раствора коллагеназы / основной среды (например, 250 мкл до 25 мл). Убедитесь, что ткань хорошо подвешен, как это повлияет на эффективность ферментативного расщепления.
  5. Инкубировать в мышечную ткань коллагеназы в течение 60 минут при 18 ° С при осторожном качания. В зависимости от степени механической диссоциации и видов, расщеплением коллагеназой может быть продлен до 90 минут, хотя это может влиять на жизнеспособность клеток.
  6. После коллагеназой, центрифуги конические пробирки при 300 мкг в течение 5 минут при температуре 12 ° С. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют ткани в 25 мл промывочной среды.
  7. Recentrifuge при 300 х г в течение 5 мин при 126; С. Повторите с промывочной среды во второй раз.
  8. После промывки ткани в два раза, мышечная ткань ресуспендируют в 25 мл промывочной среды и растирают с 10 мл серологической пипеткой пока ткань / средний гомогенат не проходит в и из пипетки с относительной легкостью. 5-10 растирания обычно достаточно.
    1. Повторите с 5 мл серологические пипетки, а затем в 16 калибра металлической канюли, прикрепленной к шприца.
  9. Центрифуга конические пробирки при 300 мкг в течение 5 минут при 12 ° С. Слейте супернатант.
  10. В течение 5-минутного выше центрифугирования подготовить раствор трипсин-переваривание путем объединения 0,25 г трипсина 5 мл основной среды.
  11. Перемешивают при температуре 4 ° С в течение 10-15 мин и фильтруют стерилизовать с помощью шприца 20 мл и 0,45 мкм шприцевой фильтр.
  12. Получить конические пробирки и добавить 100 мкл раствора трипсина и 4,9 мл диссоциации среды на каждый 1 г мышечной ткани к каждому трубки. Для EXAmple, добавьте 500 мкл раствора трипсина и 24,5 мл диссоциации среды к 5 г мышечной ткани.
    Примечание: Трипсин является сериновой протеазой, которая будет отделить миогенные клетки-предшественники из базальной пластинки.
  13. Ресуспендируйте ткани в трипсин / диссоциации среда хорошо. Инкубировать в течение 20 минут при 18 ° С.
  14. После первой инкубации трипсином, конические пробирки центрифуги при 300 х г в течение 1 мин при 12 ° С.
  15. Нейтрализации системы трипсин путем комбинирования супернатантов с изолирующей среде при концентрации 1 объему надосадочной жидкости до 4 объемов изоляции среды. Хранить при 4 ° С в течение второго трипсин-переваривание.
  16. К оставшемуся осадку ткани, повторите шаги 4.12-4.15, сочетая супернатант Следующим шагом 4,15 с супернатант / изоляции среды от первого трипсина пищеварения.
  17. Альтернативно: коллагеназы и трипсин расщепление могут быть объединены, чтобы максимизировать урожай клеток. <ол>
  18. Чтобы сделать это, растирают коллагеназы переварить с помощью металлической канюлей (6 в длину и 16 датчик работает лучше), прикрепленный к 20 мл шприц, пока не гомогенат легко проходит через канюлю.
  19. Чтобы гомогената, добавьте 500 мкл раствора трипсина (полученного на этапе 4.10) и инкубируют при 18 ° С в течение 20 минут.
  20. После инкубации, центрифуги конические пробирки при 300 мкг в течение 1 минуты при температуре 12 ° С.
  21. Нейтрализации системы трипсин путем комбинирования супернатантов с изолирующей среде при концентрации 1 объему надосадочной жидкости до 4 объемов изоляции среды.
  22. Хранить при 4 ° С в течение второго трипсин-переваривание.
  23. Перейдите к шагу 4,18 как со стандартным протоколом.
  • Внесите окончательный супернатант / изоляции среднего смесь в 50 мл конические пробирки и центрифуги при 300 мкг в течение 10 минут при 12 ° С.
  • Удалить супернатант, стараясь не потревожить ячейкугранулы. Пипетка 2 мл полной среды в каждую пробирку, растворением каждого осадок клеток.
  • Смешайте клетки суспендировали в полной среде в одном 50 мл коническую пробирку.
  • Промыть каждую пробирку с 1 мл полной среды, в сочетании с пула клеток ресуспендировали ранее.
  • Растирают с металлической канюли и шприца в 5-10 раз.
  • Фильтр клеточной суспензии через 100 мкм ячейки фильтра, промывают полной среде.
  • Фильтр клеточной суспензии через сито 40 мкм клеток.
  • Добавьте достаточное количество полной среды до 50 мл и центрифуге при 300 мкг в течение 10 минут при 15 ° С

    • 5. Подсчет, разведение и посев клеток

    1. После заключительного центрифугирования в шаге 4,25, удалить супернатант тщательного декантации или с серологические пипетки. Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл полной среды.
    2. С клетки полностью ресуспендировали, удалить 20 мкл; Суспензии клеток и место в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    3. Добавьте 5 мкл трипанового синего красителя и подождите 5 минут. Использование гемоцитометра, определить количество жизнеспособных клеток.
    4. После определения, развести клетки к необходимой концентрации. Костистых ПДК лучше высевали в 150,000-200,000 клеток на см 2. Для шести хорошо обшивки стратегии, разбавляя клетки до 1,5 х 10 6 - 2,0 х 10 6 на мл поддерживает достаточную пролиферацию и дифференцировку.
    5. Получение поли-L-лизин-лечить, ламинин покрытием пластины и семенные клетки. (См. Таблицу 5 для пластинчатых конкретных разведения и объемов гальванических.) ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 6 изображает среднее число клеток, выделенных на грамм мышечной ткани, выделенной из различных видов костистых рыб. Радужная форель (О. форель), проявляют меньше ПДК на грамм мышечной ткани, чем сделать рыбок данио (Д. рерио) и тем самым требуют больше рыбы, чтобы изолировать от надлежащего посева.
    6. Уплотнительными пластинами с лабораторной ленты и место в инкубаторе охлаждения при соответствующей температуре. ПДК из всех видов, перечисленных здесь (за исключением мышей) можно инкубировать при нормальных атмосферных условиях без углекислого газа (CO 2) добавок. (См. таблицу 7).
    7. На выбор: Некоторые лаборатории приняли протокол, который предусматривает позволяя ПДК придерживаться культуры субстратов в течение 40 минут.
      1. Затем промыть пластины со стиральными СМИ, чтобы удалить любые свободно прикрепленные и неприкрепленных клеток. Предупреждение: Этот шаг очень важен, чтобы избежать "неспецифической" адгезию других клеток (например, фибробластов) к культуральной субстратов.
      2. Добавить полные информации и размещают клетки в инкубаторе и ухода за как описано ниже.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Через двадцать четыре часа после посева, миогенные клетки-предшественники (ПДК) должны быть видны прикреплен к субстрату ламинина (см. фиг.1А и 1D). После посева, клетки (ПДК) принять шпинделя-образную форму, что свидетельствует о этого типа клеток (рис. 1) и MyoD1 + (рис. 2). У видов данио, ПДК, кажется, более компактная с меньшими биполярных процессов, чем сделать ПДК от Oncorhynchus и Salmo видов. Тем не менее, в течение че...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Миогенной программа, в зависимости от того, изученных видов, может быть наиболее легко учился через систему в пробирке. В самом деле, при изоляции, миогенные клетки-предшественники (ПДК) в рыбе или myosatellite клеток (МСК) у млекопитающих легко войти в этот очень регламентированный процесс, включающий пролиферацию, вывод клеточного цикла и терминальной дифференцировки миобластов и слияние этих миобластов в зарождающихся мышечных трубках. Общее отсутствие трансгенных линий ген корреспондент Piscine видов (с воз...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Там нет ничего, чтобы раскрыть.

    Благодарности

    Авторы хотели бы выразить большое спасибо д-ра. Хосеп Планас и Хуан Кастильо для их профессионального опыта в области разработки и применения этого протокола культуры малых рыб и амфибий. Мы также выражаем благодарность к огромного числа людей, которые неустанно помощь при вскрытии и диссоциации мышечной ткани от многих рыб (как в видов и количество), в том числе Мэтью зарядки, Delci Кристенсен, Захари Фаулер, Брук Францен, Натан Froehlich, Кира Маршалл, Бен Мейер, Этан Remily и Sinibaldo Ромеро. Эта работа была поддержана Университета Алабамы в Бирмингеме кафедры биологии стартовые средства, Центр протеазы Исследование NIH Грант # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Грант # R03AR055350 и NDSU продвижении вперед NSF Grant # HRD-0811239 для PRB. Была также оказана поддержка по UAB Питание Ожирение Research Center награда # P30DK056336, NIH NIDDK. Его содержание несут исключительно из авторов и не обязательнопредставляют официальную точку зрения NIH.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Таблица 1. Подробная информация о реагенте
    реактивов(предпочтительно против альтернативного)Номер в каталоге (предпочтительно против альтернативного)Количество на культуру
    &гамма;-облученный поли-L-лизинSigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 мг
    DMEM (с высоким содержанием глюкозы)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 л
    LamininBD Biosciences ( Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 мг
    бикарбоната натрия (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1,51 г
    HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9,53 г
    антибиотика/антимикотическогопрепарата Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 мл
    сульфатагентамицинаLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 мл
    донорской сыворотки для лошадейThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 мл
    фетального бычьего сыворотаThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 мл
    коллагеназы (тип IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189(C9891)0,44 г
    трипсина (из поджелудочной железы)MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
    Таблица 2. Расходные материалы, инструменты и оборудование
    РасходныематериалыОборудование
    Планшеты для культивирования клетокЩипцы (грубые)Серологическая пипетка
    стерильная 50 мл Конические пробиркиЩипцы (тонкие)pH-метр
    Лабораторная лентаРучки скальпеляОхлаждающий инкубатор (Echotherm)
    0,2 мкм; m Вакуумные стерилизационные системыСкальпельные лезвия (#10, #11)Ламинарный поток Капюшон
    Водоотталкивающий автоклавБумажные хирургические ножницыВакуумный коллектор
    Серологические пипеткиСтеклянные чашкиПетри Микроосмоляльность Измеритель
    12-16 г Канюли с замками
    Таблица 3. Оптимизированные объемы для покрытия планшетов для клеточных культур
    Размер планшетасм^2 на лункуПоли-L-лизин*Ламинин**
    6 лунок9,51,6 мл1
    24 лунки1,90,320,2
    48 лунки0,950,160,1
    96 лунки0,320,060,03
    *0,1 мг/млконцентрация** 0,020 мг/мл
    Таблица 4. Среда для выделения, диссоциации и культивирования
    реагентовИзоляцияПромывкаДиссоциация
    Базовая среда419,25 мл395,40 мл297,00 мл
    Гентамицина сульфат**0,75 мл0,60 мл
    Донорская сыворотка лошадей75,00 мл-
    -Фетальная сыворотка крупного рогатого скота****---
    * PSF: коктейль пенициллин/стрептомицин/фунгизона (100x); ** Концентрация 50 мг/мл; Characterized
    Таблица 5. Рекомендуемые объемы разведения и осаждения
    Размер планшетасм^2 на лунку ОбъемразбавленияОбъем покрытия
    6 лунок9,51,5-2,0x10^6 клеток/мл1 мл
    24 лунки1,91,5-2,0x10^6 клеток/мл250 μ L
    48 скважина0,951,5-2,0x10^6 клеток/мл150 μ L
    96 лунка0,321,5-2,0x10^6 клеток/мл50-100 μ L
    Таблица 6. Среднее количество клеток на г ткани
    ВидСреднее # клеток/г ткани
    Danio rerio6,400,000
    Danio dangila1,783,000
    Devario aequipinnatus1,797,000
    Oncorhynchus mykiss66,800
    Таблица 7. Рекомендуемая температура инкубации
    Температура вида
    Danio/ Devario spp.26 - 28 ° C
    Oncorhynchus/Salmo spp.10* - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum18° C
    * Более низкие температуры способствуют снижению скорости распространения.
    Компания по производству микроосмоляльности Люэра

    Ссылки

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345(2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    zebrafish
    Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.