Method Article

Juxtasomal Biocytin Маркировка для изучения структуры-функции и отношение отдельных корковых нейронов

DOI:

10.3791/51359

⸱

February 25th, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Neurophysiology, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы понять структуру нейронных сетей, функциональный и морфологическое описание отдельных нейронов является необходимостью. Здесь мы демонстрируем juxtasomal biocytin маркировку, которая позволяет электрофизиологические записи во внеклеточной конфигурации, все же сохраняя способность внутриклеточно маркировать нейрон для пост специальной реконструкции дендритных и аксонов архитектуры.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кора головного мозга характеризуется множественными слоями и многих различных типов клеток, которые в совокупности как сеть ответственных за многих высших когнитивных функций, включая принятие решений, сенсорной наведением поведения или памяти. Чтобы понять, как такие сложные нейронные сети выполнять такие задачи, важным шагом является определение функции (или электрическую активность) отдельных типов клеток внутри сети, преимущественно, когда животное выполняет соответствующую познавательную задачу. Кроме того, не менее важно определить анатомическую структуру сети и морфологического архитектуры отдельных нейронов, чтобы позволить обратного проектирования кортикальной сети. Технические прорывы, доступных сегодня позволяют записывать клеточную активность в просыпаются, ведут себя животные с ценным возможностью постфактум идентифицирующей записанные нейронов. Здесь мы демонстрируем технику маркировки juxtasomal biocytin, которая включает действия записи Potentiаль пики в конфигурации внеклеточный (или плохо-патч), используя обычные патч пипетки. Конфигурация записи juxtasomal является относительно стабильным и применимы ко поведенческих условий, в том числе под наркозом, в отключке, проснулся голова фиксирована, и даже в свободно движущейся животного. Таким образом, этот метод позволяет подключить сотового типа конкретных действий потенциального пики во время поведения животных к реконструкции отдельных нейронов и в конечном счете, всей корковой микросхемы. В этом видео рукописи, мы покажем, как отдельные нейроны в конфигурации juxtasomal могут быть помечены biocytin в уретанакрилового наркозом крысы для идентификации сообщение специальной и морфологической реконструкции.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронные сети состоят из нескольких типов клеток, характеризующихся высокой специфичностью морфологических и физиологических свойств 1-7. Как следствие, отдельные типы клеток выполнять специальные задачи в рамках сети (см., например Женте соавт. 8 и Burgalossi соавт. 9). Мы только начинаем понимать, типоспецифические функции клеток через нейронных сетей и многое еще предстоит открыть. С этой целью многие лаборатории реализации экспериментальных подходов, которые позволяют анализ морфологических свойств одного и того же нейронов популяции, из которой физиологические параметры были получены 1,10-15. Здесь мы демонстрируем технику маркировки juxtasomal 16,17, который включает электрофизиологические записи, используя обычные патч пипетки во внеклеточной (таким образом неинвазивной) конфигурации в сочетании с электропорации записанного нейрона с biocytin.Основное преимущество этого подхода состоит в том, что неинвазивный характер гарантирует, что потенциал действия пики из отдельных нейронов записывается без изменения (например, диализом) внутриклеточное содержание ячейки. Вслед за электропорации, подход juxtasomal предоставляет возможность постфактум идентификации клеток и реконструкции на ссылку функцию (физиология) структуре (морфологии). Как правило, морфологическая реконструкция включает в себя реконструкцию дендритных и аксонов морфологии который может быть продлен до количественной оценки плотности позвоночника и / или Bouton или даже реконструкции нейронов морфологии в нанометровым разрешением с помощью электронной микроскопии. Методика записи juxtasomal может быть использован для записей в естественных условиях различных типов клеток по всей слоев коры или в суб-области коры головного мозга в диапазоне видов, хотя большинство исследований применен метод в мелких грызунов, таких как мыши или крысы. Наше исследование сосредоточено на записи и маркировка нейроныкрысы первичной соматосенсорной коры (S1) и включает в себя визуальную идентификацию зарегистрированных нейронов 18, дендритные реконструкции в сочетании с точной регистрации в стандартизированной системе отсчета перепроектировать корковых сетей 4,19 и подробную реконструкцию аксонов архитектуры охарактеризовать тип конкретных клеток местный и проекция дальний цели 20.

По сравнению с альтернативными естественных условиях методов в записи (внутриклеточных или целых клеток), juxtasomal записи относительно стабильны и поэтому могут быть применены через поведенческих состояний в том числе под наркозом 21,22, седативные 14, Awake головой фиксированной 23, или даже свободно движущихся Животные 9 . Здесь мы покажем juxtasomal маркировку в S1 из уретана наркозом крысы, хотя мы подчеркиваем общую применимость этого метода для многих препаратов выбора.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка животных

Все экспериментальные процедуры проводятся в соответствии с голландским законодательством и после оценки местным этическим комитетом на VU университета Амстердама, Нидерланды.

  1. Обезболить Вистар крыс (P25-P45, ♂ / ♀) изофлураном (2-3% кислорода), а затем уретаном (20% в 0,9% NaCl, 1,6-1,7 г / кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Оцените глубину анестезии путем мониторинга щепотку вывод, веко рефлексы и вибрисс движения.
  2. Администрирование дополнительную дозу уретана (10% от начальной дозы) в случае, если животное не достигнет достаточной глубины анестезии или всякий раз, когда Вибриссы подергивания наблюдаются в ходе эксперимента.
  3. Поместите наркозом животного на стереотаксической рамы, оснащенной грелку, вставить ректальной датчик температуры и поддерживать температуру тела животного при 37,5 ± 0,5 ° С на грелку.
    4. Расположите голову животного в стереотаксической рамы; обрезать волосы на верхней части головы с помощью ножниц, чтобы сделать кожу видимый.
  4. Введите 100 мкл 1% лидокаина (в 0,9% NaCl) подкожно для местной анестезии на месте эксплуатации и ждать 3-5 мин. Снимите кожу, покрывающую поверхность черепа за счет сокращения в направлении хвостовой-на-ростральной и очистить оставшиеся ткани.
  5. Очистите череп экстенсивно с 0,9% NaCl и впитывающих тампонов.
  6. Определить координаты целевой области на левом полушарии (для первичной соматосенсорной коры (S1): 2,5 мм задней и 5,5 мм сбоку от темени). Отметьте местоположение на черепе с хирургической маркера кожи пера.
  7. Очистите от кости осторожно бормашины от интересующей области, пока кость не станет прозрачной и кровеносные сосуды хорошо видны.
  8. Сделайте 0,5 мм х 0,5 мм трепанации черепа путем разрезания окно в утонченной черепа с помощью скальпеля (# 11), избегая повреждения твердой мозговой оболочкии кровеносные сосуды. Дополнительно: обозначая края трепанации черепа с использованием хирургического маркера кожи перо, чтобы улучшить видимость.
  9. Нанесите тонкий слой суперклея на сухой черепа, а затем зубным цементом построить ванну (т.е. записи камеры), окружающее трепанации черепа.
  10. Обрежьте усы на противоположной стороне ровно 5 мм от усов фолликула. Дополнительно: выделить обрезанные усы с черной туши.

2. Juxtasomal Записи и маркировка Biocytin

  1. Сделать патч пипетки из боросиликатного стекла с внутренним диаметром кончика ~ 1 мкм, изготовив электроды 3-5 сопротивления МОм. Примечание: Идеальный пипетки морфология для записи juxtasomal постепенное стройная конус, низкий угол конуса, и ~ 1 мкм наконечник (рис. 1).
  2. В зависимости от глубины записи (по отношению к поверхности пиальных), размеры конусность регистрирующего электрода должна быть скорректирована. Критически важным является то, что тон сужаются диаметр должен быть меньше 75 мкм в пункте въезда в мозге, чтобы избежать механического повреждения или стресс в области записи. Это означает, что для поверхностных корковых записи, конусность 300-500 мкм с внешним диаметром 75 мкм макси-мально не требуется (рис. 1А), тогда как записи с относительно глубоких слоев коры требуют более длительного конусность 1500-1800 мкм, снова Максимальный наружный диаметр 75 мкм (при 1800 мкм от конца электрода).
  3. Загрузите патч пипетки с нормальной крысиной звонка (NRR) с добавлением 2% biocytin (см. Таблицу 1 для решений и реагентов) и установите патч пипетки на голове этапе, прикрепленной к микроманипулятора.
  4. Установите угол держатель электрода до 34 ° по отношению к сагиттальной плоскости непосредственно для столбца D2 крысиного S1.
  5. Подключите этап головы к усилителю в бридж-режиме (т.е. ограничения тока).
  6. Установите патчпипетки в непосредственной близости от трепанации черепа. Наполните ванну с 0,9% NaCl и определить сопротивление электрода, который должен быть между 3-5 МОм, начисленных с применением прямоугольный импульс с положительной инжекции тока (1 нА, 200 мс вкл / выкл).
  7. Создание избыточного давления 100-150 мбар и продвижения патч пипетки в 1 мкм шагов при применении положительный ток как прямоугольных импульсов (1 нА, 200 мс вкл / выкл). Следить за надежную изменение сопротивления при установлении контакта с твердой мозговой оболочки. На данный момент, установить координаты микроманипулятора на "ноль", чтобы позволить точные измерения глубины.
  8. Авансовые в 1 шаге режиме мкм, пока патч пипетки не проникает в твердую мозговую оболочку, указанную внезапного падения сопротивления электродов. Извлеките удерживающий давление пипетки.
  9. Искать отдельных единиц при продвижении в 1 мкм шагов. Монитор сопротивление электрода непрерывно, применяя 200 мс вкл / выкл импульсов. Увеличение электрода сопротивления Typicсоюзником указывает близость одного нейрона. Продвиньте электрод, пока положительный потенциал действия (AP) формы волны ~ 2 мВ записываются (рис. 2А и 2В).
  10. Дополнительно: Запись спонтанное пики образец нейрона и определить, усов, вызываемой пики путем, например, каудально отклонения отдельных усы в течение 200 мс под углом 3,3 ° использованием пьезоэлектрического устройства 18.
  11. Авансовые электрод, пока сопротивление не составляет 25-35 МОм и шипы имеют амплитуды 3-8 мВ для получения оптимальных условий заполнения juxtasomal. Начните заполнение juxtasomal применяя прямоугольные импульсы положительной тока (1 нА, 200 мс вкл / выкл). Медленно и постепенно увеличивать ток с шагом 0,1 нА при мониторинге AP сигнала и частоту (фиг.2А и 2В).
  12. Следить за открытие мембраны в виде прозрачного увеличением частоты ЗС в рамках на-фазы блока импульса (рис. 2С ). Шип сигнала при заполнении показывает повышенный ширину и снижение после-гиперполяризации (рисунки 2в, 2г). Дополнительные параметры включают в себя повышенный шум или небольшой (1-5 мВ) отрицательный сдвиг постоянного тока.
  13. Увеличение или уменьшение тока (1 нА) при заполнении, чтобы поддерживать стабильный biocytin настой. Уменьшить или прекратить импульсы тока при внезапном увеличении частоты А.П. чтобы избежать токсичности избыточным притоком внеклеточных ионов, таких как ионы натрия. Примечание: каждый нейрон по-разному реагируют ввода тока и juxtasomal параметры маркировки должны быть скорректированы в зависимости от индивидуальных условий съемки.
  14. Внимательно следить за сигнал после остановки подачу тока. Шип сигнала после сеанса заполнения обычно расширяется и показывает сильно снижается после гиперполяризации. Дождитесь восстановления нейрона, который является очевидным, когда шип сигнал возвращается к своим исходным свойствам (т.е. наличиенормальное состояние после-гиперполяризации, рисунок 2).
  15. Повторите biocytin заполнения сессий после полного восстановления нейрона увеличить biocytin нагрузку для улучшения качества окрашивания.
  16. Уберите патч пипетки с шагом 1 мкм до амплитуда всплеска не уменьшается, чтобы уменьшить любую механическую нагрузку в камеру. Подождите не менее 1 часа для biocytin диффундировать внутри клеток в то время как внимательно следит за температурой тела животного и дыхание.

3. Перфузии Animal и извлечение мозга

  1. Подготовьте установку перфузии, промыть и предварительно загрузить трубопровод с 0,9% NaCl.
  2. Расположите животное на хирургическом лоток и закрепите с помощью стандартного маркировки ленты. Обеспечить достаточную глубину анестезии; ноги щепотку и веко рефлексы должны отсутствовать.
  3. Сделайте медиальнее боковой разрез (5-6 см) через брюшную стенку прямо под грудной клеткой и перейти в задне-переднем направлении, чтобы разоблачить грудины.Потяните грудины вперед и осторожно отделить печень от диафрагмы.
  4. Сделайте небольшой надрез в диафрагме, разрезать через нижние ребра и продолжить разрез по всей длине брюшной полости, чтобы разоблачить сердце.
  5. Снимите перикарда.
  6. Вставьте иглу в левый желудочек и сделать разрез в правом предсердии. не Заливать 0,9% NaCl (~ 8 мл / мин) до тех пор, обесцвечивание печень завершена.
  7. не Переключите настой в 4% параформальдегида (PFA), пока жесткости передней лапы и нижняя челюсти очевидна.
  8. Обезглавить крысу, используя ножницы
  9. Удалите оставшиеся мышцы шеи и подвергать черепа полностью.
  10. Расположите ножницы в стволе мозга на спинной стороне и тщательно вырезать кость вдоль стреловидного шва, поддерживая позицию спинной.
  11. Удалить кости с обеих сторон сагиттального шва подвергать мозг с помощью щипцов. Осторожно снимите твердую мозговую оболочку, чтобы избежать дAmage.
  12. Осторожно вставьте тупой лопаточкой, чтобы вентральной стороне мозга и удалить мозг мягко.
  13. После исправить весь одночасье мозга в PFA на 4 ° С. Переключите мозг до 0,05 М фосфатного буфера (PB) и хранить при температуре 4 ° C.

4. Разрезание мозг в тангенциальном разделах

  1. Возьмите мозг из 0,05 М PB и положил его на фильтровальной бумаге, обращенной кпереди. Используйте острый лезвие, чтобы отрезать мозжечок вдоль фронтальной плоскости и отделить полушария разрезанием вдоль по середине сагиттальной плоскости.
  2. Применить суперклей на монтажной платформе и смонтировать левое полушарие на его сагиттальной плоскости с передней облицовки прав. Закрепите монтажную платформу под углом 45 ° на Vibratome и погрузить мозг в 0,05 М PB.
  3. Безопасность лезвие на Vibratome и убедитесь, что первый контакт с поверхностью мозга находится в середине передне-задней плоскости полушарии. Вырезать 24 100 мкмсекций и собрать их в 24-луночный планшет, содержащий 0,05 M Pb.

5. Гистологические процедуры

  1. Выполнение гистологические протоколы для окрашивания цитохромоксидазы 24 и авидин-биотин-пероксидаза способа в соответствии с ранее описанными методами 25. Дополнительно: визуализировать biocytin используя флуоресцентный авидин / стрептавидин-Alexa конъюгатов. Это дополнительно позволяет двойного окрашивания с ретроградных или Антероградная методов розыска.
  2. Разделы Wash 5 х 5 мин 0,05 М PB и подготовить 3,-3'-диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB), содержащего решение для цитохромоксидазы окрашивания, чтобы визуализировать баррелей в слое 4 (L4) из S1 (см. таблицу 2 для решений и реагенты). Выдержите разделы 6-12 из Пиа в разогретой решения для 30-45 мин при 37 ° С
  3. Промыть разделы с 0,05 М PB для 6 х 5 мин и утолить активности эндогенной пероксидазы путем инкубации все разделы в 3% H 2 O 2 в 0,05 М PB в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
  4. Промыть секции с 0,05 М PB для 5 х 10 мин. Выдержите разделы в ABC-решения (см. таблицу 3 для решений и реагентов) в течение ночи при 4 ° С.
  5. Промыть секции с 0,05 М PB для 5 х 10 мин и подготовить DAB-решение для визуализации biocytin заполненные нейрона (см. таблицу 4 для растворов и реагентов). Инкубируйте разделы в отфильтрованного раствора в течение 45-60 мин при комнатной температуре.
  6. Промыть секции с 0,05 М PB для 5 х 10 мин. Mount разделы по микроскопа и крышки скольжения с Mowiol (см. таблицу 5 для растворов и реактивов).
  7. Определить качество маркировки с использованием световой микроскопии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Детальное знание на 3D структуры отдельных нейронов имеет решающее значение для выяснения организационные принципы нейронных сетей. Наш метод включает в себя трубопровод для достижения высокого качества biocytin маркировку от подготовки в естественных условиях, что позволяет постфактум нейронов классификацию и подробную реконструкцию дендритных и аксонов архитектуры отдельных нейронов с высоким разрешением. В зависимости от качества juxtasomal маркировки, нейроны извлекают с различными DAB-интенсивност...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод juxtasomal позволяет записывать в естественных потенциала действия пики от отдельных единиц по всей поведенческих условий (под наркозом, проснулся голова фиксированной или свободно перемещаться) с возможностью biocytin маркировки записанного нейрон для почтового типа Прямое клеток классификации и / или 3D-реконструкции. Основным преимуществом является получение физиологических параметров во внеклеточной (таким образом неинвазивной) конфигурации, но будучи в состоянии обозначить нейрон внутри клет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В authros нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить проф. Huibert Mansvelder и Берт Sakmann за всестороннюю поддержку, доктор Марсель Оберлендер за плодотворные обсуждения и предоставления нейронов трассировку и Брендан Лоддер для оказания технической помощи. Данные были приобретены с помощью ntrode VI для LabVIEW, щедро предоставленную Р. Бруно (Колумбийский университет., Нью-Йорк, США). Это исследование было поддержано Общества Макса Планка и Бернштейна Центра вычислительной неврологии, Тюбинген (финансируемого Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF; ФКЗ: 01GQ1002)) (RTN), Центр Neurogenomics и когнитивных исследований (CNCR) , неврологии Campus Амстердам (НКА), финансирование CPJdK (СВО-ALW # 822.02.013 и ENC-сеть # P3-c3) и VU университета Амстердама.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Система управления SM-6Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Манипуляторблок X2
Lynx-8 усилительNeuralynx
Axoclamp-2B усилительAxon Instruments
Osada модель EXL-M40Osada, Inc.
Пьезоэлектрическое устройствоPhysik InstrumentePL140.10
LabViewNational Instruments, Остин, Техас, СШАПрограммное обеспечение для сбора данных
LabView Ntrode Virtual Instrument Р. Бруно, Колумбийский университет, Нью-Йорк
Абсорбирующие тампоны SugiKettenbach30601
Цитохром C из сердца лошадиSigmaC2506
Каталаза из печени крупного рогатого скотаSigmaC9322
DABSigmaD5637
H2O2Boom7047
Vectastain стандартный ABC-kitVectorPK6100
Triton X100SigmaT9284
УретанSigmaU2500
IsofluranePharmachemie45.112.110
LidocaineSigmaL5647
Simplex rapid dental cementKemdentACR308/ACR924
БиоцитинМолекула36219518
ПФАМерк Миллипор8187151000
Основание ТризмыSigmaT4661
Mowiol 4-88Aldrich81381
Аналитический глицеринFluka49767
HEPESSigmaH3375
NaClSigma Aldrich31434
KClSigma Aldrich60130
CaClSigma Aldrich22,350-6
MgCl2Fluka63072

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
  4. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  5. Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
  6. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  7. Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
  8. Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
  9. Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
  10. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  12. Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
  13. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  14. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  15. Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
  16. Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
  17. Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
  18. de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
  19. Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
  20. Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
  21. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  22. de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
  23. de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
  24. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  25. Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
  26. O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  27. Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
  28. Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
  29. Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
  30. Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
  31. Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
  32. Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
  33. Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
  34. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Juxtasomal RecordingBiocytin LabelingCortical NeuronsAction Potential SpikingMorphological ReconstructionSensory CortexPatch PipettesCurrent InjectionsBiotin StainingDigital Reconstruction

Related Articles