Method Article

Протокол для анализа вируса гепатита С репликации

DOI:

10.3791/51362

⸱

June 26th, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С (ВГС) является основным патогеном человека, вызывающим заболевания печени, включая цирроз и рак. Система культивирования инфицированных клеток ВГС имеет важное значение для понимания молекулярного механизма репликации ВГС и разработки новых терапевтических подходов. Здесь мы описываем протокол для исследования различных стадий цикла репликации ВГС.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С (HCV) влияет 3% населения мира и вызывает серьезные заболевания печени, включая хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярной карциномы. ВГС оболочечным РНК вируса, принадлежащий к семейству Flaviviridae. Современное лечение не полностью эффективными и вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Там нет ВГС вакцина. Таким образом, по-прежнему требуются усилия для разработки вакцины и лучшую терапию. Система HCV культуры клеток имеет решающее значение для изучения различных стадий роста ВГС в том числе вирусного входа, репликации генома, упаковки и выхода. В текущей процедуры, представленной мы использовали дикого типа intragenotype 2а химерный вирус, FNX-HCV, и рекомбинантный вирус FNX-Rluc, несущий ген-репортер люциферазы Renilla изучать репликацию вируса. Клеточной линии гепатомы человека (Хух-7 на основе) был использован для трансфекции в пробирке транскрипции ВГС геномных РНК. Бесклеточные супернатанты культуры, белковые лизаты и тг о РНК собирали в разное время указывает после трансфекции для оценки роста HCV. HCV геном состояние репликации оценивали путем количественного RT-PCR и визуализации на присутствие вируса гепатита двухцепочечной РНК. Экспрессии белка ВГС была проверена Вестерн-блот и иммунофлюоресценции анализов с помощью антител, специфичных для HCV NS3 и NS5A белков. РНК ВГС трансфицированные клетки выпущенные инфекционных частиц в культуральном супернатанте и титра вируса была измерена. Люциферазы анализы были использованы для оценки уровня репликации и инфекционность репортера ВГС. В заключение приведем различные вирусологических анализов для характеристики различных этапов цикла репликации ВГС.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С (HCV) вызывает цирроз печени и рак печени. Это влияет 170 миллионов человек во всем мире с 350 000 человек умирают ежегодно 1-3. ВГС является положительным нить РНК вируса с размером генома 9,6 кб. Геном HCV переводится как единое полипротеина ~ 3000 аминокислотных остатков, который протеолитически расщеплен на различных клеточных и вирусных протеаз в 10 полипептидов. ВГС является вирус прототип в род Hepacivirus и принадлежит к семейству Flaviviridae 4. Под воздействием, ВГС устанавливает хронической инфекции в 80% лиц. Инфекция в основном бессимптомно и своевременная диагностика может позволить терапевтического вмешат....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая схема протокола показан на рисунке 1.

1. Клетки

  1. Подготовить всю питательной среды, которая содержит 10-15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ заменимые аминокислоты, 10 мМ Hepes, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицином (100 мг / мл) и 2 мМ L-глутамина.
  2. Поддерживать Хух-7.5.1 ячеек 13 в полной среды роста, содержащих вышеуказанные добавки для анализа в пробирке гепатита С вирусной цикла репликации.
  3. Культура вирусных штаммов в Хух-7.5.1 клеток с заданным дополненной питательной среды при 37 ° С с 5% CO 2.

2. Вирус и Пл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С является РНК-содержащий вирус. Таким образом, для генетической манипуляции цели HCV геномной кДНК была клонирована в плазмидный вектор бактериальной. Т7 РНК-полимераза последовательность промотора была введена непосредственно перед 5'-конце генома ВГС. Общая схема анализа HCV процесса представлена ​​на рисунке 1. Для генерации HCV геномной РНК с точным 3 'конце, геном ВГС содержащей плазмиды разрезают Xba I рестриктазы и сгенерированный одноцепочечной свес был притупляются с ма.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта иллюстрация описывает способ анализа цикл репликации вируса гепатита С. ВГС является человеческий патоген, и предписанная протокол биобезопасности должны быть строго соблюдены. Инфекционные системы HCV клеток культуры были описаны ранее 11-13,16,17. Есть несколько важных моментов мы внедряем, когда после иллюстрированный протокол. Во-первых, это имеет большое значение, чтобы иметь хорошее качество неповрежденной полной длины вирусной геномной РНК для последующих исследований. Входной плазмида, несущая вир.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим F. Chisari за предоставление клеточной линии Huh-7.5.1. Мы хотели бы поблагодарить Жюстин Хо за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана премией Медицинского центра Седарс-Синай за институциональные программные исследования и Национальным центром развития трансляционных наук, грантом UL1TR000124 V.A.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Дульбекко s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Заменимая аминокислотаFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Восстановленная сывороточная среда, без фенола RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1Научно-исследовательский институтКлеточная линия была любезно предоставлена доктором Фрэнсисом Чизари доктору Арумугасвами в рамках выполненного MTA между Научно-исследовательским институтом Скриппса и Медицинским центром Седарс-Синай
Плазмиды (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc и pFNX-Rluc Pol null) Седарс-СинайПлазмиды ВГС были синтезированы доктором Арумугасвами с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов.
XbaIНовая Англия Биолабс Инк.R0145S
Нуклеаза бобов мунгНовая Англия Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Система для производства РНК в больших масштабахPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Электропорация кювета (4 мм)BioexpressE-5010-4
Генный генератор Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
мышиное моноклональное антитело к дцРНК J2 Английский & ООО «Научный консалтинг»
Козий антикролиачий IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Козий антикролиацкий IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF мембранный пакетBio-Rad162-0263
Блокатор блоттинга Обезжиренное сухое молокоBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Антитело NS3 к вирусу гепатита С [8 G-2]Abcamab65407
Антитело к вирусу гепатита С NS3 [H23]Abcamab13830
Козий антимышиный IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) Джексон Иммуноисследовательские лаборатории Инк.115-035-003
Амершам ECL Prime Western Блоттинг Детектирующие реагенты GE Здравоохранение Медико-биологические наукиRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 система для ПЦР в реальном времениLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase Assay System kitPromegaE2810
РНКаза ДНКазаPromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (Люминометр)Компания Promega
Скриппса Медицинский центр 10010200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis C VirusHCV ReplicationViral RNA TransfectionQuantitative RT PCRWestern BlotImmunofluorescence AssayViral Titer MeasurementLuciferase AssayCell Culture SupernatantHuh 7 Cells

Related Articles