Методическая статья

Протокол для анализа вируса гепатита С репликации

DOI:

10.3791/51362

⸱

26 июня 2014 г.

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С (ВГС) является основным патогеном человека, вызывающим заболевания печени, включая цирроз и рак. Система культивирования инфицированных клеток ВГС имеет важное значение для понимания молекулярного механизма репликации ВГС и разработки новых терапевтических подходов. Здесь мы описываем протокол для исследования различных стадий цикла репликации ВГС.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С (HCV) влияет 3% населения мира и вызывает серьезные заболевания печени, включая хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярной карциномы. ВГС оболочечным РНК вируса, принадлежащий к семейству Flaviviridae. Современное лечение не полностью эффективными и вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Там нет ВГС вакцина. Таким образом, по-прежнему требуются усилия для разработки вакцины и лучшую терапию. Система HCV культуры клеток имеет решающее значение для изучения различных стадий роста ВГС в том числе вирусного входа, репликации генома, упаковки и выхода. В текущей процедуры, представленной мы использовали дикого типа intragenotype 2а химерный вирус, FNX-HCV, и рекомбинантный вирус FNX-Rluc, несущий ген-репортер люциферазы Renilla изучать репликацию вируса. Клеточной линии гепатомы человека (Хух-7 на основе) был использован для трансфекции в пробирке транскрипции ВГС геномных РНК. Бесклеточные супернатанты культуры, белковые лизаты и тг о РНК собирали в разное время указывает после трансфекции для оценки роста HCV. HCV геном состояние репликации оценивали путем количественного RT-PCR и визуализации на присутствие вируса гепатита двухцепочечной РНК. Экспрессии белка ВГС была проверена Вестерн-блот и иммунофлюоресценции анализов с помощью антител, специфичных для HCV NS3 и NS5A белков. РНК ВГС трансфицированные клетки выпущенные инфекционных частиц в культуральном супернатанте и титра вируса была измерена. Люциферазы анализы были использованы для оценки уровня репликации и инфекционность репортера ВГС. В заключение приведем различные вирусологических анализов для характеристики различных этапов цикла репликации ВГС.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С (HCV) вызывает цирроз печени и рак печени. Это влияет 170 миллионов человек во всем мире с 350 000 человек умирают ежегодно 1-3. ВГС является положительным нить РНК вируса с размером генома 9,6 кб. Геном HCV переводится как единое полипротеина ~ 3000 аминокислотных остатков, который протеолитически расщеплен на различных клеточных и вирусных протеаз в 10 полипептидов. ВГС является вирус прототип в род Hepacivirus и принадлежит к семейству Flaviviridae 4. Под воздействием, ВГС устанавливает хронической инфекции в 80% лиц. Инфекция в основном бессимптомно и своевременная диагностика может позволить терапевтического вмешательства, чтобы предотвратить ухудшение печени. Современное лечение не является оптимальным и ни одна вакцина не доступна 5,6.

Этиология гепатита С был впервые описан в 1989 7. Изучение репликацию ВГС важно для гепатита С вакцины и научных исследований лечения, но это былодолго сдерживается отсутствием эффективной вирусной системе культуры. Молекулярный клон ВГС было показано, что инфекционное у шимпанзе на внутрипеченочного прививки 8. Впоследствии ВГС суб-геномные репликоны были описаны, что позволило вскрыть вирусную сцену геном репликации в системе культуры клеток 9,10. Обнаружение генотип 2а ВГС изолировать JFH-1 (японский Молниеносный гепатит-1), способны инфицировать культуры клеток открывает новые возможности для исследования репликации ВГС 11-13. Штамм Генотип 2а JFH-1 на основе меж-и внутри-генотипических химерные вирусы и генотип 1 HCV инфекционные системы культуры, основанной также доступны 14-18.

Мы успешно использовали JFH-1 напряжение и ВГС intragenotype 2а химерный вирус для получения высокого разрешения функциональной профилирования карту белковых доменов и цис-действующих РНК элементов 19,20. В соответствии с этим здесь мы опишем эффективную систему культуры, используемую обычно, что позволяетизучения различных этапов цикла репликации ВГС и хост-возбудителя взаимодействия. Мы представляем вирусологических анализов для оценки вирусной репликации генома и De Novo инфекционность intragenotype 2а ВГС и Renilla люциферазы журналистом ВГС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая схема протокола показан на рисунке 1.

1. Клетки

  1. Подготовить всю питательной среды, которая содержит 10-15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ заменимые аминокислоты, 10 мМ Hepes, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицином (100 мг / мл) и 2 мМ L-глутамина.
  2. Поддерживать Хух-7.5.1 ячеек 13 в полной среды роста, содержащих вышеуказанные добавки для анализа в пробирке гепатита С вирусной цикла репликации.
  3. Культура вирусных штаммов в Хух-7.5.1 клеток с заданным дополненной питательной среды при 37 ° С с 5% CO 2.

2. Вирус и Плазмидные Конструкции

  1. Генерирование комплементарную ДНК (кДНК) форму РНК ВГС и клонировать его в плазмидный вектор для простоты генетических манипуляций. Примечание: Открытие японского Молниеносный гепатит 1, JFH-1 (генотип 2а ВГС), изолят имеет решающее значение для исследований ВГС ив основном используется для изучения 11-13 репликации ВГС цикла. Inter-и intragenotypic химерные вирусы на основе JFH-1 ВГС, как правило, используется в исследованиях 14-18. Строительство синтетический intragenotype 2а химерный вирус, FNX-ВГС, и monocistronic химерных репортера штамма был описан ранее 19 и строительные детали выходят за рамки этого протокола.
  2. Используйте вирус intragenotype 2а pFNX-HCV как он содержит 5'NTR, структурные регионы и Р7, и часть неструктурных регионах NS2 (нуклеотиды с 1 по 2878) из родительского штамма J6CF (NCBI присоединение нет. AF177036), а а также не-структурных компонентов JFH-1 вирусного штамма (NCBI вступления нет. AB047639). Примечание: FNX-ВГС было синтезировано на основе последовательности Jc1 intragenotype 2а химерных ВГС сообщалось ранее 15.
  3. Генерирование monocistronic химерного вируса репортер конструкцию, то pFNX-Rluc, на основе штамма pFNX-HCV (выше на стадии 2.2), вставив Rген люциферазы enilla между 5 'NTR и основной гена (между нт 388 и 389). Затем подключите ген люциферазы и основные ген этой конструкции с использованием ног и рта вирусной болезни 2А (F2A) пептидной последовательности, которая будет работать в качестве сигнала расщепления.
  4. Инженер по РНК-полимераза-нуль (Pol-) вирусную конструкцию, используя либо pFNX-HCV или pFNX-Rluc вирусный фон. Замените полимеразы NS5B каталитические остатки, ДДГ (AA 2759-2761; NT 8615-8623), любого из этих вирусных магистралей с остатками AAG аминокислот.

3. In Vitro РНК HCV Транскрипция

  1. Используйте intragenotype 2а химерный вирус FNX-HCV и FNX-HCV Pol ноль (Pol-) HCV для оценки вирусной репликации (рис. 2а).
  2. Линеаризуем вирусных плазмид с XbaI рестриктазы, затем обрабатывают маш нуклеазы генерировать тупые концы. Очищают переваренных плазмид путем анионообменной хроматографии. Проверьте целостность ое линеаризованной плазмиды ДНК, подвергая электрофорезу в агарозном геле (фиг. 2b).
  3. Расшифруйте линеаризованные вирусных плазмид с помощью Т7-РНК-полимеразы.
  4. Очищают вновь синтезированный ДНКазы обработанных РНК с использованием набора для очистки РНК.
  5. Убедитесь, производство РНК с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 2С).
  6. Количественная РНК спектрофотометрически.
  7. Храните сгенерированный РНК в -80 ° С в течение 10 мкг рабочих аликвоты. Примечание: Чтобы свести к минимуму изменение качества РНК внутри каждого эксперимента путем расшифровки все РНК для каждого образца вирусной и контроля одновременно.

4. РНК HCV Трансфекцию и сбора проб

  1. Урожай Хух-7.5.1 клетки, используя трипсин.
  2. Для полоскания клеток, центрифуги и ресуспендируйте подвеску дважды холодным низкой сыворотки СМИ. Ресуспендируют клеток в условиях низкой сыворотки среде при 1 × 10 7 клеток на мл.
  3. Смешайте в общей сложности 10 & #956; г транскрибируется вирусной РНК с 400 мкл ресуспендировали клеток (4 х 10 6 клеток) в 0,4-см кювету для электропорации. Трансфекции клеток с помощью электропорации в 270 V, 100 Ω и 950 мкФ.
  4. Ресуспендируют электропорации клетки в 10 мл полной среды рост с 15% FBS. Примечание: Увеличение живучесть электропорации клеток видно, когда Ха-7.5.1 клетки культивировали в 15% сыворотки плода коровы.
  5. Пластина клеток в обоих Т-25 колб (~ 1.2 х 10 6 клеток на колбу) и 48-луночных планшетах (1 х 10 4 клеток на лунку) для каждого из следующих временных точках: 4, 48 и 96 часов.
  6. Замените носитель на 4-8 ч после трансфекции свежего дополнена питательной среды с добавлением 10% FBS, чтобы удалить остатки мертвых клеток из культивированных колб и пластин.
  7. Урожай супернатантах клеточных культур в 48, 96 временных точках ч и удаление клеточного дебриса от собранных образцов центрифугированием клеток в 1500 оборотах в минуту в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. Храните супернатантами бесклеточных при -80 º C. Лизиса клеток для анализа белка и РНК с помощью Вестерн-блоттинга и обратной транскрипции-Количественную ПЦР в указанные моменты времени.

5. Обратной транскрипцией количественной ПЦР (RT-КПЦР) для оценки генома ВГС копий

  1. Выполните двухэтапный RT-КПЦР для определения ВГС геномной количество РНК копирования.
  2. Обратный транскрибиров 1 мкг общей клеточной РНК с помощью обратной транскриптазы и грунтовки, специфический для HCV смысловой цепи, который связывается с 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') или грунтовки, специфического для гена уборка peptidylprolyl изомераза G (PPIG R : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Также обратного транскрибировать FNX-РНК ВГС (сгенерированный на шаге 3) известных копий генома (10 1 до 10 9 стандарт), используя чувство ВГС нити грунтовку.
  3. Провести КПЦР с помощью 50 нг полученного транскрибируется кДНК с использованием специфических праймеров HCV (RT JFHQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') и ДНК-связывающий зеленую краску, содержащую КПЦР супер микс. Выполните КПЦР для домашнего хозяйства гена PPIG а (праймеры PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Примечание: Для расчета точной уровень внутриклеточного РНК ВГС через образцов, использовать ген клеточного Уборка номеров, PPIG , уровень экспрессии (Ct цикл) для нормализации. Используйте числа копий FNX-генома ВГС в качестве стандарта для определения количества копий.
  4. Используйте следующие условия при работе КПЦР для определения РНК ВГС число копий: 95 ° C в течение 15 сек и 60   º C в течение 30 сек (40 циклов) с использованием реального времени система PCR.
  5. См. фиг.3А и 3В для результатов репликации генома.

6. Вестерн блот анализ для выявления вируса гепатита Экспрессия белка (рис. 3C)

  1. Используйте клеточных лизатов фром вирусной РНК трансфицировали в 96 часов после трансфекции для белка вестерн-блоттинга.
  2. Решить клеточного лизата с помощью SDS-PAGE и трансфер в поливинилидендифторидную (ПВДФ) мембраны.
  3. Блок мембрану с использованием блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренное молоко, 0,2% Tween 20 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).
  4. Выдержите мембрану с первичной мышиных моноклональных антител NS3 (1 в 1000 разбавления) и бета-актина (1 в 5000 разведение).
  5. Добавить антимышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1 в 5000 разбавление) и обнаружить по хемилюминесценции.

7. Иммунофлуоресцентной (IFA)

  1. Закрепить HCV-инфицированных и трансфицированные клетки с использованием метанола в течение 30 мин при -20 ° С для иммунофлуоресцентного анализа.
  2. Вымойте клетки с PBS три раза и блок с IFA блокирующем буфере.
  3. Используйте кроличьи поликлональные антитела к NS5A прежде всего антител (любезно предоставлены доктором Дасгупта, UCLA) или моноклональные антитела мыши DSRАнтитело J2 NA в разведении 1:200 (1 мкг / мл) и инкубировали в течение 5 ч в течение ночи при 4 ° С.
  4. Промывают клетки с PBS три раза после первичного антитела.
  5. Добавить козьего анти-кроличьего IgG-488 поликлональное антитело или вторичное козла против мышиного IgG-594 поликлональных вторичного антитела при разведении 1:1000 (1 мкг / мл) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Вымойте клеток с PBS три раза и пятно ядер с использованием Hoechst краситель и вид при помощи флуоресцентного микроскопа (рис. 3D).

8. Измерение Вирус Титр

  1. Пластинчатые наивные Ха-7.5.1 клетки приблизительно в 3 х 10 3 клеток / лунку с использованием 96-луночного планшета. На следующий день, выполнять 10-кратные серийные разведения бесклеточной супернатанта культуры собирают из РНК ВГС трансфецировали клеток с использованием средств массовой информации роста и привить в трех экземплярах на Ха-7.5.1 клеток.
  2. Исправить клеток при 72 ч после инфекции с использованием метанола (в течение 30 мин при -20 ° С) и immunostain для ВГС NS5A белка, как указано в разделе 7.
  3. Используйте наибольшее разведение рассчитывать на положительный очагов NS5A и рассчитать среднее количество формирующего устройства фокусировки (ФФУ) на миллилитр. См. рисунок 4 для титра ВГС.

9. Renilla Люциферазную Репортер Анализ на вирусный геном репликации и инфекционности

  1. Для оценки вирусной репликации генома, пластина РНК ВГС-электропорации Хух-7.5.1 клетки в трех экземплярах в 48-луночных планшетах (1 х 10 4 клеток / лунку).
  2. Лизиса клеток с 75 мкл лизирующего буфера пассивной на 6 часов, 48 часов и 96 часов после трансфекции.
  3. Rock тарелки мягко в течение 15 мин при комнатной температуре и хранить при температуре -80 ° С.
  4. Для измерения ферментативной активности люциферазы Renilla, оттаивать лизата белка и активности люциферазы Renilla реагенты до комнатной температуры.
  5. Добавить 20 мкл лизата белка на лунку в 96-сва л белого свечения пластины и поместите пластину в люминометре.
  6. Внесите 100 мкл Renilla люциферазы реагента (целентеразин субстрат + буфер) на лунку и после 2 сек предварительно прочитать задержкой; интегрировать испускаемого света в течение 10 сек.
  7. Рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение для каждого образца из люциферазных значений биологических трижды и подвергнуть данные в статистическом анализе (рис. 5).
  8. Для оценки инфективности, инокуляции 500 мкл бесклеточной надосадочной жидкости, полученной из РНК ВГС-трансфицированных клеток для указанных временных точках (48 ч и 96 ч) в трех экземплярах на наивных Ха-7.5.1 клеток в 48-луночных планшетах.
  9. Заменить вирусного посевного материала с 500 мкл свежей среды на лунку после 6 ч после инфекции.
  10. Lyse клетки через 48 часов после заражения и в зависимости от Renilla люциферазы, как описано в шагах 8,2 до 8,7 (рис. 5).
Заголовка "> 10. Статистический анализ

  1. Столбики ошибок в графах указывают на стандартные отклонения (SD). Значения P рассчитывались по непарным т теста.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита С является РНК-содержащий вирус. Таким образом, для генетической манипуляции цели HCV геномной кДНК была клонирована в плазмидный вектор бактериальной. Т7 РНК-полимераза последовательность промотора была введена непосредственно перед 5'-конце генома ВГС. Общая схема анализа HCV процесса представлена ​​на рисунке 1. Для генерации HCV геномной РНК с точным 3 'конце, геном ВГС содержащей плазмиды разрезают Xba I рестриктазы и сгенерированный одноцепочечной свес был притупляю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта иллюстрация описывает способ анализа цикл репликации вируса гепатита С. ВГС является человеческий патоген, и предписанная протокол биобезопасности должны быть строго соблюдены. Инфекционные системы HCV клеток культуры были описаны ранее 11-13,16,17. Есть несколько важных моментов мы внедряем, когда после иллюстрированный протокол. Во-первых, это имеет большое значение, чтобы иметь хорошее качество неповрежденной полной длины вирусной геномной РНК для последующих исследований. Входной плазмида, несущая вир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим F. Chisari за предоставление клеточной линии Huh-7.5.1. Мы хотели бы поблагодарить Жюстин Хо за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана премией Медицинского центра Седарс-Синай за институциональные программные исследования и Национальным центром развития трансляционных наук, грантом UL1TR000124 V.A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дульбекко s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Заменимая аминокислотаFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Восстановленная сывороточная среда, без фенола RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1Научно-исследовательский институтКлеточная линия была любезно предоставлена доктором Фрэнсисом Чизари доктору Арумугасвами в рамках выполненного MTA между Научно-исследовательским институтом Скриппса и Медицинским центром Седарс-Синай
Плазмиды (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc и pFNX-Rluc Pol null) Седарс-СинайПлазмиды ВГС были синтезированы доктором Арумугасвами с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов.
XbaIНовая Англия Биолабс Инк.R0145S
Нуклеаза бобов мунгНовая Англия Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Система для производства РНК в больших масштабахPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Электропорация кювета (4 мм)BioexpressE-5010-4
Генный генератор Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
мышиное моноклональное антитело к дцРНК J2 Английский & ООО «Научный консалтинг»
Козий антикролиачий IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Козий антикролиацкий IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF мембранный пакетBio-Rad162-0263
Блокатор блоттинга Обезжиренное сухое молокоBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Антитело NS3 к вирусу гепатита С [8 G-2]Abcamab65407
Антитело к вирусу гепатита С NS3 [H23]Abcamab13830
Козий антимышиный IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) Джексон Иммуноисследовательские лаборатории Инк.115-035-003
Амершам ECL Prime Western Блоттинг Детектирующие реагенты GE Здравоохранение Медико-биологические наукиRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 система для ПЦР в реальном времениLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase Assay System kitPromegaE2810
РНКаза ДНКазаPromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (Люминометр)Компания Promega
Скриппса Медицинский центр 10010200

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Huh 7

Похожие статьи