Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Гистохимический Окрашивание

42.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 мая 2014 г.

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Состав клеточной стенки растений варьируется в зависимости от типа ткани и может включать лигнин, целлюлозу, гемицеллюлозу и пектин. Для визуализации различий на уровне типа клеток были разработаны различные методы окрашивания. Эта статья представляет собой компиляцию широко используемых методов окрашивания клеточной стенки.

Аннотация

Arabidopsis thaliana - это модельный организм, обычно используемый для понимания и манипулирования различными клеточными процессами в растениях, и он широко используется в изучении формирования вторичной клеточной стенки. Вторичное отложение клеточной стенки происходит после того, как первичная клеточная стенка заложена, и этот процесс осуществляется исключительно специализированными клетками, такими как клетки, образующие сосуды и волокна. Большинство вторичных клеточных стенок состоят из целлюлозы (40–50%), гемицеллюлозы (25–30%) и лигнина (20–30%). Было выделено несколько мутаций, влияющих на биосинтез вторичной клеточной стенки, и соответствующие мутанты могут проявлять или не проявлять очевидные изменения биохимического состава или визуальные фенотипы, поскольку эти мутации могут быть замаскированы компенсаторными реакциями. Процедуры окрашивания исторически использовались для выявления различий по клеточному признаку. Эти методы являются исключительно визуальными средствами анализа; Тем не менее, их роль в быстром и критическом анализе имеет большое значение. Конголезский красный и калькофторовый белый — это красители, используемые для обнаружения полисахаридов, в то время как Mäule и флороглюцинол обычно используются для определения различий в лигнине, а толуидиновый синий O используется для дифференциального окрашивания полисахаридов и лигнина. Кажущиеся простыми техники сечения, окрашивания и визуализации могут стать проблемой для новичков. Начиная с подготовки образцов с использованием модели A. thaliana, в этом исследовании подробно описываются протоколы различных методологий окрашивания, которые могут быть легко реализованы для наблюдения за организацией клеток и тканей во вторичных клеточных стенках растений.

Введение

Стена растительная клетка имеет множество информации в ее различных компонентов: лигнин, целлюлоза, гемицеллюлозы (ксилан, glucuronoxylan, ксилоглюкан, арабиноксилан, смешанная связь глюкан, или Glucomannan) и пектин. Гистологические методы обеспечивают важные визуальные подсказки в изучении различий внутри вторичных клеточных стенок в организационных и клеточном уровнях. Различные гистологические методы были разработаны и могут быть найдены в литературе, но эти методы могут быть сложным и трудоемким для начинающих, потому что очень подробные протоколы с простыми визуальными инструкциями редко, если когда-либо доступны. Целью данного исследования является предоставление рекомендациям по ее гистологических методов окрашивания для получения высококачественных изображений.

Секционирование шток ткани является первым шагом в визуализации клеточных стенок и клеточных форм. Хотя ручной огранки разделы недороги и займет меньше времени, чтобы подготовиться, использование Vibratome предлагает согласованность идает высокое качество изображения. Использование Vibratome позволяет производить лучшее качество данных путем генерации даже участки с той же толщины, что позволяет получать резкие снимки и значительно снижает риск получения неточных различия между образцами, которые будут просто вызванных плохой подготовки образца. Использование смолы исправить свежие образцы может быть проблемой для начинающих и до сих пор может занять много времени даже для специалистов, когда анализ нужно сделать быстро. Кроме того, становится невозможным измерить любой биологической активностью с образцом, когда он был встроен в смоле. Один простой метод, который использует агарозы и самодельный пресс-формы является полезным для встраивания стволовых ткани, а также может быть использован в других приложениях, требующих рассечение мягких тканей. По сравнению с вложением образцов в смоле, этот метод имеет то преимущество, что в ткани живых и снижения образец манипуляции. Секционирование ткани через Vibratome очень аккуратный и не генерирует однороднаяOUS разделы, которые, в зависимости от цели исследования, то можно использовать с несколькими различными методами окрашивания.

Простейшие методы для наглядного лигнин и другие ароматические соединения используют ультрафиолетовое (УФ) света. Возбуждение молекул ароматических основе УФ-светом старая техника, но он по-прежнему один из самых быстрых подходов для визуализации лигнина. Тем не менее, УФ визуализация на самом деле не является идеальным для обнаружения лигнина, потому что ультрафиолетовый свет будет возбуждать другие ароматические. Лигнин состоит в основном из трех блоков, в monolignols (hydroxycinnamyl спирты: кониферилового спирта, синапилового спирта и п-каумарильного спирт) 1-3. Флороглюцин пятно может дать ключ к степени cinnamaldehydes присутствующих в древесине, клетчатки, и трахеи тканей 4. Флороглюцин является хорошим показателем общих cinnamaldehydes и может различать cinnamaldehydes и других ароматических соединений. Мономеры синапилового спиртов могут быть обнаруженыи дифференцированы с помощью Мол пятна. Толуидин синий вывода полихроматичным краситель и, следовательно, имеет возможность окрасить различные элементы клеточной стенки в разные цвета 5,6. Основное применение толуидиновым синим O является выявление пектин и лигнин 5,6. Преимущество использования толуидиновым синим O является то, что многие элементы клеточной стенки могут быть визуализированы в одну стадию. Оба Calcofluor белый и конго красный легко работать, и может быть использован для визуализации целлюлозу. Calcofluor белые пятна целлюлозы, мозолистый, и другие не замещенных или слабо замещенных β-глюкан 6-9, в то время как конго красный пятна непосредственно к β-(1 → 4)-глюканы и особенно с целлюлозой 10,11. Целью данного исследования является предоставление простым рекомендациям для использования вышеупомянутых методов окрашивания для получения высококачественных изображений с А. THALIANA стеблей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Стволовые вложение

  1. Сделать 7%-ный раствор агарозы в воде (7 г электрофорез класса агарозы в 100 мл дистиллированной воды). Растворить агарозы в автоклаве в течение 20 мин или по микроволновой печи в течение 20 мин при низкой интенсивности (например, 10% интенсивности 1250 Вт СВЧ).
  2. Подготовить домашнее формы для встраивания стебли с использованием пластиковых флаконов.
    1. Использование лезвие, отрезать коническую нижнюю часть 2 мл завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных (часть А). Иглой шприца, проколоть отверстие в крышке трубки немного больший, чем диаметр штока для встраивания. Затем вырезать 0,5 см от дна 0,6 мл микроцентрифужных трубки (Часть B).
    2. Добавить отсечения 0,5 см часть 0.6 мл микроцентрифужных трубки в нарезанные 2 мл трубки микроцентрифужных. Уплотнение две части, используя парафильмом (рис. 1). ПРИМЕЧАНИЕ: В нижней части трубки разрезают, чтобы облегчить удаление встроенного образца после агарозном укрепил. Тон отверстие в крышке поможет в проведении стебель устойчивый когда шток вкладывается в агарозы. Пресс-форма будет служить для хранения агарозы и удерживайте Стебель прямой, когда вложение. Парафильмом проведет две части, А и В, пока агарозном не установлен и шток вкладывается.
    3. Использование лезвие, вырезать секцию штока из области интересов, (например середине первого ствола междоузлия). ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, стебель следует обрезать перед вложением чтобы избежать разрушения обезвоживанием. Кроме того, стержень может быть временно сохранены в пластину, содержащую увлажненную фильтровальную бумагу с водой. Эта пластина не могут быть размещены на льду до момента быть встроен чтобы предотвратить обезвоживание и тканей деформации. Хранение шток на срок более 30 минут без высокой влажности может привести стебель высохнуть.
  3. Расплава агарозы в микроволновой печи при низкой интенсивности. ВНИМАНИЕ: флакон, содержащий агарозы может быть горячей. Используйте рукавицей, чтобы забрать бутылку. Пусть расплавленную агарозу SТ и при комнатной температуре (от 20 ° С до 25 ° С), пока не остынет примерно до 50 ° С.
  4. Медленно пипетки 5 мл агарозы в предварительно сделанного пластиковые формы, чтобы заполнить пузырек. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, нет пузырьков воздуха в формы. Пузырьки воздуха вызовет пробелы в агарозном формы и не будет полностью покрывать образец стебель, который в конечном итоге приведет к неравномерному резки образца разделах.
    1. Пусть агарозы остыть в течение 30 до 60 сек, чтобы стать полутвердые. Проверьте с небольшим зубочисткой, убедившись, что он может проникать и встать, но не плавать, в агарозы. ПРИМЕЧАНИЕ: Если шток находится когда агарозы по-прежнему жарко это повредит образец в Сморщенность стебель, разрушая морфологии клеток.
    2. Установите шток в этом агарозном заполненные флаконе. Убедитесь, что шток остается прямой. Поместите перфорированную крышку таким образом, что наконечник штока проходит по колпачка. Не поверните винт-на колпачок. Иногда более чем одного ствола (одного вида) может быть embedded в одном флаконе; но в данном конкретном случае, не используйте крышку. ПРИМЕЧАНИЕ: Если винт-колпачок включен, стебель получите витая.
  5. Оставьте флакон при комнатной температуре или при 4 ° С в течение 10-30 мин, пока она не затвердеет.
  6. Извлеките форму, осторожно переместив его из трубки. Откройте парафильмом. Нажмите на нижнюю часть части B пресс-формы с большим пальцем осторожно, чтобы освободить затвердевшей агарозы из части А на предметное стекло микроскопа.
  7. Разрежьте агарозном встроенный шток на три примерно равные кусочки 1,2 см в длину. Вырежьте часть стебля, которая не была в агарозы и выбросьте его.
    1. Храните эти кусочки агарозы с встраиваемое стебли в герметичных 2 мл микроцентрифужных пробирок в темный ящик при 4 ° С до готовности к разделу. Кроме того, хранить пробирки при 4 ° С в течение не более одной недели. ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение возможно, но экспериментатор должен быть в курсе, что встроенный стебли все еще живы и, в зависимости от эксперимента, Артефакты могут потенциально быть введены.

2. Стволовые секционирования

  1. ВНИМАНИЕ: Внимательно прочтите инструкцию Vibratome и следуйте всем инструкциям по безопасности.
  2. Убедитесь, что образец диск чистый и абсолютно сухой (без любой твердый или жидкий). Очистите образца диск с бритвенным лезвием, чтобы удалить остатки клея из предыдущих экспериментов и промывают водой. Затем высушите бумажным полотенцем. ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет гарантировать, что клей хорошо работает, и связывается с геле образца. Если этот шаг не сделано должным образом, не исключено, что образец не может присоединиться к диску и позже вызывать образец упасть диск во секционирования.
    1. Используйте мягкую бумагу салфетки для удаления влаги из агарозного блока, содержащего образцы.
    2. Поместите небольшую каплю клея ткани на образец диска. Подряд из клея, чтобы покрыть площадь в середине пластинки с помощью иглы клея бутылки. Быстро местоагароза блок так, что образцы либо перпендикулярно или параллельно с пластиной для поперечных или продольных сечений, соответственно. Разрешить клей для фиксации образца к образцу диска при комнатной температуре или при 4 ° С в течение 10-30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Это время чувствительных шаг.
  3. Закрепите образца диск в месте на подносе буфера или корыто. Блок / с из агарозы с секциях должно быть параллельно с лезвием бритвы. Заполнить буфер лоток с дистиллированной водой при комнатной температуре, пока образцы не полностью погружен в воду.
  4. Вырежьте лезвие пополам и затем обрезать концы с крепкими ножницами так, чтобы лезвие остается совершенно плоская. Прикрепите одну половину предварительно выполн емого надреза лезвием бритвы на держатель ножа.
    1. Установите угол на держателе ножа до 84 °, скорость до 0,90 мм / с (положение 8 на Vibratome) и частотой до 50 Гц (положение 5 на Vibratome). Cut секции толщиной 100 мкм. Используйте режим непрерывной. НЕТTE: Эта толщина была выбрана, чтобы обеспечить, что ткань может выдерживать различные процедуры кислот и оснований, используемых в некоторых протоколов окрашивания. Установите окно для секционирования и позволяют 15-20 мин на непрерывном режиме для Vibratome к разделу агарозы блока примерно 1,2 см.
  5. Соберите разделы, используя одноразовые пластиковые пипетки во время секционирования в буферной лотка. Альтернативно, участки могут быть переданы из буфера лотка в стеклянном стакане и затем к четкому чашку Петри. Трансфер несколько разделов с 2,0 мл микропробирок. Примечание: Образцы собраны из чашку Петри, потому что это легче увидеть разделы о чистом фоне, и, так как буфер лоток может быть нацелены на ближайшие образца.
  6. Секции могут быть сохранены в 50 мл пробирку или собирается и хранится в 1,5 до 2 мл микроцентрифужных пробирках при температуре 4 ° С в течение от 30 до 60 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение разделы на более длительный срок может привести к ухудшению качества изображения.

3. Микроскоп и Настройка камеры для работы с изображениями

  1. Отрегулируйте освещение Келера на микроскопом. Выберите цель. Сосредоточьтесь на образце в первую очередь. Принесите интенсивность света до половины или ниже. Закройте полевую диафрагму (FD) и диафрагму (AP) или довести его до минимально возможного обстановке на этой конкретной цели.
    1. Чем выше увеличение, тем больше будет кольцо. С помощью ручки фокусировки конденсатора сосредоточиться на местах диафрагмы так резко, как это возможно.
    2. Медленно довести образ полевых радужной оболочки (с шестигранной форме небольшой кольцевых) к центру с помощью конденсатора центрирующие ручки (штифтообразных винта, окружающий конденсатор). Медленно увеличивайте диафрагма (FD), такие, что полевые ирис достигает края. Остановить повышение ФО сразу после поле ирис прошло края.
    3. Медленно увеличивайте диафрагму (AP), чтобы настроить контрастность. Отрегулируйте интенсивность света по мере необходимости. ПРИМЕЧАНИЕ: Келер освещенности должна быть скорректирована для каждого оЕЛЬ, каждый экспериментальный день. Обратите внимание на цифры, полученные после корректировки в течение дня. Эти цифры будут использоваться повторно каждый раз, когда цели включении туда и обратно за этот день.
  2. Отрегулируйте диафрагму, интенсивности, времени экспозиции, усиления и фильтров, как описано в таблице 1. Эта информация должна использоваться только в качестве ориентира.
  3. Используйте цифровую камеру высокого разрешения с большим форматом интерлайн CCD чип, без механического затвора, чтобы захватить флуоресцентные изображения; и с высоким разрешением, высокоскоростная камера для ярко-полевых изображений.
  4. Процесс слайды, используя стандартное программное обеспечение. Загрузите программное обеспечение. Нажмите "приобрести" и "Настройки камеры / доска", затем выберите камеру для использования. Нажмите "OK". Затем нажмите кнопку "Получить", а затем "вкладке Цвет." Под "вкладке Цвет" выберите "метод Байера" "Средняя четырех." Добавить предложенный усиления (красный, зеленый, синий) сюдам Таблица 1. Выберите вкладку "Установить сохранить" и нажмите на каталог, в котором изображения будут храниться. Установить "Выдержка" от предложений в таблице 1. Установить "Биннинг" на "1" и "Живая биннинга" на "1". Фокус на интересующей области, а затем нажмите "Сохранить в прямом эфире".
  5. Выходные изображения на ПО камеры в формате "TIF". Анализ изображений для гистохимии из типов клеток. Используйте стандартный компьютер программное обеспечение для использования в нижнем течении презентации и публикации.

4. Ультрафиолетовое и светлого поля изображений

  1. С помощью 1 мл пипетки с разрезом кончика пипетки так, что секции могут быть пипеткой легко. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа. Покройте участки с покровным. Соблюдайте разделы под УФ-светом или светлого поля освещения.

5. Флороглюцин-HCl (Визнер) Окрашивание 12

  1. Растворите 0,3 г флороглюцин в 10 мл абсолютного этанола подготовить 3%-ный раствор флороглюцин. Смешайте одну объем концентрированной соляной кислоты (37 N) до двух объемов 3% флороглюцин в этаноле; это решение флороглюцин-HCl (Ph-HCl) или Wiesner пятно. Примечание: Это решение должно быть сделано свежий в день окрашивания и не могут быть сохранены, так как решение будет деградировать с течением времени и окрашивание станет неэффективным. ВНИМАНИЕ: HCl оказывает сильное коррозионное воздействие, поэтому будьте очень осторожны при обращении с пятно Ph-HCl.
  2. Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл раствора Ph-HCl в пробирку, содержащую секции и крышка его немедленно, поскольку HCl в пятне Ph-HCl оказывает сильное коррозионное воздействие. Аккуратно переместите трубку заверить, что все разделы окрашиваются. Альтернативой этому шагу должен держать трубки колпачок открытым, так что решение Ph-HCl можно пипеткой вверх и вниз, предпочтительно, не нарушая секTIONS. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в кончика пипетки, так как это может привести к повреждению этих разделов.
    1. С помощью 1 мл пипетки с разрезом кончика пипетки таким образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа. Покройте участки с покровным. Соблюдайте разделы под светлого поля освещения. ПРИМЕЧАНИЕ: Решение Ph-HCl высыхает через 5-10 мин, в результате чего ухудшение образцов. Таким образом, изображения должен быть завершен в течение этого периода времени.

6. Maule Окрашивание 13,14

  1. Растворить 0,2 г перманганата калия в 40 мл дистиллированной воды с получением 0,5%-ный раствор перманганата калия. Хранить в темной бутылке при комнатной температуре в течение максимум 7 дней.
    1. Приготовьте 3,7%-ный раствор HCl добавлением 1 мл концентрированной соляной кислоты (37 N) до 9 мл дистиллированной воды (1:10). Подготовьте свежий 3,7% раствор HCl надень эксперимента. Убедитесь, что исходный раствор 37 N HCl используется не слишком стар. Концентрированный раствор гидроксида аммония (14,8 M) следует хранить при 4 ° С для предотвращения молярность насыщенного раствора из уменьшается.
  2. Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 0,5% раствора перманганата калия в пробирку, содержащую секции.
    1. Внесите 0,5% раствор перманганата калия вверх и вниз мягко, предпочтительно, не нарушая разделы. Инкубировать в течение 2 мин и повторить пипетки. Пусть микроцентрифужных трубки стоят, пока все секции не успокоиться. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как разделы могут быть повреждены. Это может быть трудно понять, разделы стволовые как решение темно, так что держите трубку с секциях по пробирок и дать им возможность поселиться в течение 2 мин.
    2. Использование 1 мл пипетки, вытянуть 700 мкл 0,5% раствора перманганата калия.Добавить 700 мкл дистиллированной водой до промыть раствором перманганата калия. Повторите 3-4x или пока раствор вода не остается ясным.
    3. Откажитесь от воды. Быстро добавить 1 мл 3%-ной HCl, пока темно-коричневый цвет не выходит из секциях. Это может произойти в течение 3-5 мин, или может потребоваться 2 промыли 5 мин каждый. Пипетки из все 3%-ного раствора HCl и сразу перейти к следующему шагу.
    4. Добавить 1 мл концентрированного раствора гидроксида аммония. С помощью 1 мл пипетки с разрезом наконечника таким образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа. Покройте участки с покровным. Соблюдайте разделы под светлого поля освещения. ВНИМАНИЕ: Поскольку гидроксид аммония чрезвычайно коррозионные, он требует дополнительную заботу и внимание, чтобы не вызывать коррозию на столик микроскопа или объектива. ПРИМЕЧАНИЕ: Пары гидроксид аммония может туман покровное, что делает его трудно наблюдать образец. Поэтому будьте очень осторожны, прежде чем добавлять покровное. Решение высыхает через 5-10 мин, так что изображения должен быть завершен в течение этого периода времени.

7. Окрашиванием Конго красным 11,15

  1. Растворить 0,5 г конго красный в 100 мл дистиллированной водой до 0,5% конго красный раствор.
  2. Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 0,5% конго красный раствор в трубу. Аккуратно пипетки 0,5% Конго красного раствора вверх и вниз, не нарушая разделы. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как это может повредить разделы.
    1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин и повторить пипетки. Последующие с другой 3 мин инкубации при комнатной температуре.
    2. Используйте 1 мл пипетки, чтобы вытянуть 700 мкл 0,5% конго красного раствора. Добавить 700 мкл дистиллированной воды промыть Конго красный раствор. Повторяйте мыть 3-4x до промывочного раствораЯсно.
    3. С помощью 1 мл пипетки с разрезом наконечника таким образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа, и покроют их покровное. Соблюдайте образцы на предметное стекло при возбуждении синего света с помощью фильтра с полосовой 560/40. ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните разделы в воде долгое время до микроскопического анализа, так как вода будет размывать конго красным в 10-30 мин.

8. Calcofluor Белый Окрашивание 9

  1. Растворить 0,02 г флуоресцентного отбеливателя 28 (Calcofluor белого M2R) в 10 мл дистиллированной воды для получения 0,2% маточного раствора. 0,2% раствор можно хранить в течение шести месяцев в темной бутылке при 4 ° С. Подготовить рабочий раствор 0,02% путем разбавления 0,2% исходный раствор 10x дистиллированной водой.
  2. Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить к трубе 1 мл 0,02% calcofluor белый решение. Аккуратно пипетки белый решение 0,02% Calcofluor вверх и вниз. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как это может повредить разделы.
    1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин и повторить пипетки. Инкубировать в разделе течение еще 3 мин при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешить секции оседать на дне пробирки, чтобы сделать его проще пипетки из раствора, не повреждая разделы.
    2. Используйте 1 мл пипетки, чтобы вытянуть 700 мкл 0,02% Calcofluor белого раствора и добавить 700 мкл дистиллированной воды; подождите 5 мин промыть белую решение Calcofluor. Повторите промыть 3-4x. Используйте 1 мл пипетки с разрезом пипетки в таких, как образом, что секции могут быть пипеткой из легко, без повреждений.
    3. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа, и покроют их покровным. Соблюдайте разделы под ультрафиолетовым светом.

9. Толуидин Bluе О Окрашивание 16,17

  1. Растворите 0,02 г толуидинового синий O в 100 мл дистиллированной воды, чтобы подготовить 0.02% раствора. Примечание: толуидин раствор синий O могут быть сохранены в течение двух недель в темном флаконе при комнатной температуре.
  2. Трансфер разделы стволовые к 2,0 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 0,02% толуидиновым синим O раствора к трубе. Аккуратно пипетки 0,02% толуидинового решение синий O вверх и вниз. Затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и повторить пипетирования один раз. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не пипетки разделы в пипетки как это может повредить разделы. Пусть микроцентрифужных трубки стоять на месте, пока разделы не успокоиться. Это может быть трудно понять, как решение темно, так держать трубку, содержащий разделы, посвященные пробирок и дать им возможность поселиться в течение 2 мин при комнатной температуре.
    1. Используйте 1 мл пипетки, чтобы вытянуть 700 мкл 0,02% толуидиновым решения синий вывода. Добавить 700 мкл дистиллированной водой до промыть толуидинового синий O зольution. Повторите 3-4x или пока промывочного раствора не понятно. С помощью 1 мл пипетки с разрезом кончика пипетки таким образом, что секции могут быть легко пипеткой из не повреждая их.
    2. Аккуратно пипетки разделы в наконечник и на предметное стекло микроскопа, и покроют их покровным. Соблюдайте разделы под светлого поля освещения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стволовые вложения и секционирования:
Использование самодельных пластиковых форм для встраивания стебли в 7% агарозном оказалось быстро и легко (рис. 1). Эти две части (А и В; рис. 1) из встроенной системы флакона сделать его простым, чтобы легко освободить шток, встроенный в агарозы как агарозы не прилипает к флакона частей, которые являются инертными, поддерживать чистоту. Ампулы могут быть использованы несколько раз в течение многих лет. Удобство хранения встроенного стебель т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Разделы стволовые А. THALIANA широко используются для изучения организации клеток на вторичном клеточной стенки и качественно изучить различия между дикого типа и трансгенных растений. Обычно используемые методы секционирования образцы являются прямыми рука резки; или когда образцы встроены в агарозном или фиксатора, секционирования может быть сделано с Vibratome или микротоме. В отличие от ручной резки, последние два позволяют уменьшить риск получения неточных различий между образцами, которые были бы просто, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет никаких финансовых противоречий.

Благодарности

Мы благодарны Сабин Рассела за помощью редактирования. Эта работа была частью DOE Совместной BioEnergy института (http://www.jbei.org) при поддержке Департамента энергетики США, Управление по науке, Управления биологических и экологических исследований, с помощью контракта DE-AC02-05CH11231 между Лоуренса Беркли Национальная лаборатория и Министерство энергетики США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозаEMDMERC2125Номер CAS: 9012-36-6
ФлороглуцинолSigma P 35021,3,5-тригидроксибензол [Номер CAS: 108-73-6]
Соляная кислотаEMDHX0603-75Номер CAS: 7647-01-0
Гидроксид аммонияEMDAX1303-6Номер CAS: 1336-21-6
Тулидин синий OSigmaT3260Хлорид блютена, хлорид толония [номер CAS 92-31-9] 
МарганцовкаSigma223468номер CAS 7722-64-7 
Этанол 190 proofKOPTECV1401CAS Номер: 64-17-5
Congo RedSigma C6277Динатрий 3,3'-[[1,1'-бифенил]-4,4'-диилбис(азо)]бис(4-аминонафталин 1-сульфонат) [номер CAS 573-58-0]
Флуоресцентный отбеливатель 28/ Калькофтор белый красительSigmaF3543 4,4'-бис[[4-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-6-анилино-1,3,5-триазин-2-ил]амино]стильбен-2,2'-дисульфоновая кислота [номер CAS 4404-43-7] 
ВибратомLeica LeicaВибрационное лезвие микротом VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Безопасная бритва компанииАртикул # 60-0139-0000 Двухлезвийное лезвие из нержавеющей стали (Personna Super)
Микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой (2 мл)VWR16466-044
(0,6 мл)Axygen ScientificMCT-060-C
MittBel-Art380000000SCIENCEWARE  Горячая защита для рук Рукавица
Тканевый клейTed Pella Inc10033Хранить в 4 ° С или 20 градусов; C для хранения 3 месяца и более
Микроволновая печьPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Мгновенный клей для салфеток 
Фотоаппарат с ПЗС-чипом без механического затвора HamamatsuC4742-95
Высокоскоростная цветная камера     Программное обеспечение для камеры QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
   Молекулярные приборыMetaMorph версия 7.7.0.0
Imagining anaylsis Adobe Чехлы Photoshop CS4
Micro Cover, квадратные, No 1VWR48366-06722 x 22 мм (7/8 x 7/8 ")-Чехлы устойчивы к коррозии и равномерно толстые и плоские. Толщина No 1 составляет от 0,13 до 0,17 мм.
Матовые микрослайды, 1 ммVWR48312-00375 x 25 мм - 1 мм
Парапленка MУпаковка AlcanBRNDPM998
TX2 Фильтркуб Leica11513851/11513885Фильтр используется для анализа красного цвета Конго с полосой пропускания 560/40.
Микроцентрифужные пробирки

Ссылки

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MALS
Гистохимический Окрашивание
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.