Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51404

⸱

29 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum of the University of Basel, 2Proteomics Core Facility, Biozentrum of the University of Basel

В этой статье

Краткое содержание

Вездесущий второй мессенджер c-di-GMP контролирует рост и поведение многих бактерий. Мы разработали новую технологию на основе масс-спектрометрии Capture Compound для биохимической идентификации и характеристики связывающих белков c-di-GMP практически у любых видов бактерий.

Аннотация

Значительный прогресс был достигнут в течение последнего десятилетия к идентификации и характеризации ферментов, участвующих в синтезе (diguanylate циклаз) и деградации (фосфодиэстеразы) второго посланника C-ди-GMP. В отличие от этого, имеется мало информации о молекулярных механизмах и клеточных компонентов, через которые эта сигнализация молекула регулирует широкий спектр клеточных процессов. Большинство известных эффекторных белков относятся к семейству PILZ или выродились diguanylate циклаз или фосфодиэстеразы, которые дали на катализа и приняли эффекторной функции. Таким образом, чтобы лучше определить сотовую сеть с-ди-GMP в широком диапазоне бактерий экспериментальные методы, необходимые для идентификации и проверки новых эффекторы, для которых надежность в предсказания силиконового из строя.

Недавно мы разработали новый Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS) на основе технологии как мощный инструмент длябиохимически выявить и охарактеризовать C-ди-GMP связывающих белков. Этот метод был ранее сообщалось, применимы к широкому кругу организмов 1. Здесь мы дадим подробное описание протокола, который мы используем, чтобы исследовать такие компоненты сигнализации. В качестве примера, мы используем синегнойная палочка, патогенных микроорганизмов, в которых с-ди-GMP играет важную роль в вирулентности и биопленки контроля. CCMS определены 74% (38/51) из известных или прогнозируемых компонентов сети C-ди-GMP. Это исследование объясняет процедуру СКК в деталях, и устанавливает его в качестве мощного и универсального инструмента для выявления новых компонентов, участвующих в передаче сигналов малой молекулы.

Введение

C-ди-GMP является ключевым вторичным мессенджером, которая используется большинством бактерий, чтобы управлять различными аспектами их рост и поведение. Например, C-ди-GMP регулирует прогрессию клеточного цикла, подвижность и экспрессию экзополисахаридов и поверхностных адгезинов 2-4. На основе координации этих процессов с ди-GMP способствует формированию биопленки, процесс, который связан с хроническими инфекциями диапазоне патогенных бактерий 5. C-ди-GMP является синтезированным с помощью ферментов, называемых diguanylate циклаз (РСК), которые укрывают каталитический домен GGDEF 4. Некоторые РСК обладают ингибирующим сайт, который вниз регулирует циклазным деятельность на C-ди-GMP обязательными. Деградация с-ди-GMP катализируется двумя различными классами фосфодиэстеразы (PDE), несущих либо каталитического EAL или HD-мошенник домен 6,7.

Большинство из известных эффекторных белков, которые непосредственно связывают с-ди-GMP принадлежат к одной из всего лишь трех классов белков: каталитическиесоюзник неактивные GGDEF или EAL домены и PILZ доменов, небольшие молекулярные переключатели, которые подвергаются конформационные изменения при связывании с-ди-GMP 8. РСК, уравнений в частных производных и PILZ белки хорошо охарактеризованы, и их доменов может быть предсказана в кремнии сравнительно безопасно. Особый интерес в настоящее время сосредоточена на выявлении новых классов C-ди-GMP эффекторов. Некоторые эффекторы C-ди-GMP с различными связывающими мотивами были описаны недавно такие как CRP / ФНР семейства белков Bcam1349 в Burkholderia cenocepacia или регулятор транскрипции FleQ в P. палочки 9,10. Кроме того, C-ди-GMP конкретных riboswitches недавно были определены и показаны для контроля экспрессии генов в C-ди-ГМФ-зависимой манере 11. C-ди-GMP связывающие мотивы различных эффекторов только плохо сохраняется решений биоинформатики предсказания таких белков сложно. Чтобы решить эту проблему, мы разработали биохимический метод, основанный на использовании с-ди-GMP SPEспецифичны Захват соединения в сочетании с масс-спектрометрии 1,12,13.

Мы недавно инженерии роман трехвалентного C-ди-GMP Захват соединения (CDG-CC, рисунок 1) 1. Это химическое леса состоит из: 1) часть молекулы C-ди-GMP, используемого в качестве приманки, чтобы захватить с-ди-GMP-связывающие белки, 2) УФ-фотоактивируемый реактивная группа используется для сшивки CDG-CC до границ белков и 3) биотин, чтобы изолировать захваченные белки с использованием покрытых стрептавидином магнитные гранулы. CDG-CC может быть использован непосредственно, а в частности, захват с-ди-эффекторы GMP из сложной смеси макромолекул, как клеточных лизатов. Захват соединения на основе и химические подходы, основанные протеомики, ранее уже сообщалось, применима к широкому кругу организмов, например, Caulobacter crescentus, Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium и П. палочки 1,14.

В этой методологической работе,мы предоставляем глубокое описание процедуры CCMS с использованием экстрактов P. палочки в качестве примера. Это исследование устанавливает СКК как мощный и универсальный инструмент для биохимически определить новые компоненты, участвующие в передаче сигналов малой молекулы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Lysate Подготовка

  1. Растут Р. палочка клеток в LB к желаемой ОД.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для руководства: используйте ≈ 100 мл Культура / образец для фазовых культур стационарных и ≈ 500 мл КУЛЬТУРА / образец для логарифмической фазе культур (OD 600 нм = 0,5).
  2. Гранул путем центрифугирования в течение 20 мин при 5000 х г.
  3. Ресуспендируйте 0,5-1 г гранул в 1 мл буфера для лизиса (6,7 мМ MES, 6,7 мМ Hepes, 200 мМ NaCl, 6,7 мМ Каца, ДДТ 1 мМ, рН 7,5) и добавить ингибитор протеазы (полный мини, ЭДТА-бесплатно), а также как DNAseI.
  4. Лизировать клетки по 3 проходов через французский ячейки давления, в 20000 фунтов на квадратный дюйм (список материалов).
  5. Ультра-центрифуги Клеточный лизат при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
  6. Сохранить супернатант (перейдите к шагу 2).
  7. Вымойте гранул с 1 мл 1x буфера для лизиса с помощью пипетки вверх и вниз.
  8. Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
  9. Вспышка замораживания осадка вжидкий азот и хранить при температуре -20 ° С до использования для захвата мембранных белков (см шаг 3).

2. Удаление свободного С-ди-GMP и другими нуклеотидами (растворимой фракции только)

  1. Вымойте колонку PD10 обессоливания (см список материалов) с 10 мл холодного буфера для лизиса.
  2. Налейте супернатант (≈ 1 мл) на PD10, чтобы удалить нуклеотидов.
  3. Элюируют 4 мл холодного буфера для лизиса (500 мкл) шагов.
  4. Выберите наиболее концентрированном фракций, как определено Бредфорда, и объединить их.

3. Пелле Ресуспендирование и Солюбилизация (мембранной фракции только)

  1. Ресуспендируют осадок в 500 до 1000 мкл буфера захвата 1x (без моющего средства) (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: гранулы трудно ресуспендирования. Рекомендуется первого пипетки вверх и вниз с помощью пипетки грубо ресуспендируют осадок, затем использовать шприц 27 G хорошо гомогенизации раствора.
  2. Добавить 1% (вес / объем) н-додецил-β-D-maltopyranoside (DDM).
  3. Инкубируйте при 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч (или O / N) на вращающемся колесе.
  4. Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
  5. Урожай супернатант.

Измерение концентрации 4. Белок

  1. Измерение концентрации белка Бредфорда (по BCA анализом для мембранной фракции).
  2. Набор общую концентрацию белка 10 мг / мл.

5. Захват

  1. Смешайте 300 мкг белка с 1 мМ ВВП, GTP, АТР, СТР, и 20 мкл буфера захвата 5x (100 мМ HEPES, 250 мМ ц, 50 мМ MgAc, 5% глицерина, рН 7,5) (таблица 1). Отрегулируйте объем реакционной 100 мкл Н 2 О.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем включает объем CDG-CC и С-ди-GMP в случае управления конкуренции (см шаг 5,3 и таблицу 2).
    Примечание: Все эксперименты проводились в 200 и# 181; л 12-труб ПЦР полосы (Thermo Scientific).
    ПРИМЕЧАНИЕ: для мембранной фракции, убедитесь, чтобы всегда держать концентрацию DDM выше критической концентрации мицеллообразования (0,01% вес / объем), пока на стадии белок солюбилизации в 8 М мочевины (этап 7.1).
  2. Инкубируйте при 4 ° С в течение 30 мин на вращающемся колесе.
  3. Добавить 10 мкм CDG-CC (конечная концентрация).
    ПРИМЕЧАНИЕ: включают в себя управление без CDG-CC (называемый также "контроль бортом"), и дополненных 1 мМ с-ди-GMP ("управления соревнованиями") (см 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация CDG-CC может быть в диапазоне от 1 до 10 мкм.
  4. Инкубируйте при 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч (O / N для мембранной фракции) на вращающемся колесе, в темноте.
  5. После короткого спина, сшивки путем активации реактивной фрагменту CDG-CC с УФ-светом в течение 4 мин, с использованием CaproBox (см Перечень компонентов, λ = 310 нм, освещенность ≥10 мВт / см², расстояние от источника = 2 см), ПРИМЕЧАНИЕ: снимите крышку полос до сшивания.
  6. Добавить 25 мкл 5х буфера для стирки (5 М NaCl, 250 мМ Трис, рН 7,5) и 50 мкл и ресуспендировали стрептавидином магнитные гранулы, осторожно гомогенизируют.
  7. Инкубируйте при 4 ° С в течение 1 часа на вращающемся колесе.

6. Стиральные шаги

Примечание: (Магнит: см список материалов). Начните с захвата магнитных шариков в крышке полосы ПЦР, с магнитом. Затем заменить прокладку ПЦР на новую, содержащую следующую промывочного раствора. Удалить магнит и ресуспендируйте бусы, и инкубировать 2 мин. Спин вниз и заменить крышку свежим крышкой.

  1. Стиральные стадии (растворимая фракция только)
    1. Вымойте 6 раз в 200 мкл 1x промывочного буфера.
    2. Вымойте раз в 200 мкл для ВЭЖХ H 2 O.
    3. Промыть 6 раз в 200 мкл 80% ацетонитрила.
    4. Вымойте 2 раза в 200 мкл для ВЭЖХ H 2 O.
  2. Стиральные стадии (Membraпе доля только)
    1. Вымойте 5 раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,1% ДДС.
    2. Вымойте 2 раза в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,05% ДДС.
    3. Вымойте раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,025% ДДС.
    4. Вымойте раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,0125% ДДС.
    5. Промыть 3 раза в 200 мкл 100 мМ ABC (бикарбонат аммония, NH 4 CO 3) + 2 М мочевину.

7. М. Подготовка образцов

  1. Ресуспендируют бусины (прямо в крышке) в 20 мкл 100 мМ ABC (100 мм ABC + 8 М мочевину для мембранной фракции) и передать в 1,5 мл пробирки.
  2. Только мембранной фракции: инкубировать при 60 ° С в течение 5 мин, встряхивании при 500 оборотах в минуту.
  3. Добавить 0,5 мкл 200 мМ TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфина) и инкубируют при 60 ° С в течение 1 часа, встряхивая при 500 оборотах в минуту. Охладить до 25 ° С.
  4. Добавить 0,5 мкл свежеприготовленного 400 мМ иодацетамида и инкубировать при 25 ° С в течение 30 мин, встряхиваят 500 оборотов в минуту и ​​в темноте.
  5. Добавить 0,5 мкл 0,5 М N-ацетил-цистеин и инкубировать при 25 ° С в течение 10 мин, встряхивании при 500 оборотах в минуту.
  6. Только мембранной фракции: добавить 1 мкл Lys-C и инкубируют при 37 ° C, O / N.
  7. Добавить 2 мкг трипсина и инкубируют O / N при 37 ° С, встряхивая при 500 оборотах в минуту (обертки в парафильмом, чтобы предотвратить высыхание).
    Примечание: образцы можно хранить при -20 ° С на этой стадии.
    Только мембранную фракцию: ПРИМЕЧАНИЕ добавить 100 мМ ABC регулировать концентрацию мочевины <2 м перед добавлением трипсина.
  8. Кратко спином вниз трубы и собирать шарики с магнитом.
  9. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл (Повторите этот шаг, если шарики остаются).
  10. Добавить 5 мкл 5% TFA (трифторуксусной кислоты) + 1 мкл 2 М HCl (15 мкл 5% TFA + 5 мкл 2 М HCl для мембранной фракции).
  11. Состояние C18 MicroSpin колонки (гнездо Group, MA, USA) с 150 мкл ацетонитрила (спиновые 20 сек при 2400 оборотах в минуту).
  12. Оборlibrate столбцы C18 2 раза 150 мкл 0,1% TFA (спина 20 сек, 2400 оборотов в минуту).
  13. Загрузите образец и спин 2 мин, 2000 оборотов в минуту.
  14. Обновить проточного на колонку и повторите шаг спиннинг (2 мин, 2000 оборотов в минуту).
  15. Промыть 3 раза с 150 мкл 0,1% TFA, 5% ацетонитрила (20 сек, 2400 оборотов в минуту).
  16. Возьмем в новую пробирку и элюируют дважды 150 мкл 0,1% TFA, 50% ацетонитрила (2 мин, 2000 оборотов в минуту).
  17. Высушите пептиды в скорости-VAC.
  18. Ресуспендируют в 40 мкл 98% H 2 O, 2% ацетонитрил, 0,15% муравьиной кислоты.
  19. Ультразвук 20 сек (импульсный цикл 0,5, амплитуда 100%, см список материалов) и спином вниз 5 сек, 12 000 оборотов в минуту (настольный центрифуги). Vortex 10 сек, и спин вниз 5 сек, 12 000 оборотов в минуту. Трансфер в ВЭЖХ флакон для анализа LC-MS / MS.
  20. Замораживание при -20 ° С.
    Примечание: образцы можно хранить при -20 ° С на этой стадии.

8. ЖХ-МС / МС анализ

  1. Запуск нано-LC (нано-LC системы) equippред с колонки ВЭЖХ с обращенной фазой (75 мкм х 37 см), заполненную смолой С18 (Magic С18 AQ 3 мкм) с использованием линейного градиента от 95% растворителя А (0,15% муравьиной кислоты, 2% -ным ацетонитрилом) и 5% растворителя В ( 98% ацетонитрил, 0,15% муравьиной кислоты) до 35% растворителя В течение 60 мин при скорости потока 0,2 мкл / мин.
  2. Анализ пептидов с помощью ЖХ-МС / МС (двойное нажатие LTQ-Orbitrap Velos масс-спектрометр, подключенный к источнику ионов электрораспылением).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Режим сбора данных была настроена на получение одного высокого разрешения MS сканирования в FT части масс-спектрометра с разрешением 60000 FWHM последующим MS / MS сканирования в линейном ионной ловушки из 20 наиболее интенсивных ионов. Для повышения эффективности попыток MS / MS, взимается государственная скрининг модус был включен, чтобы исключить отменяется и вместо отдельно взимает ионы. Сговор индуцированной диссоциации срабатывает, когда предшественник превысил 100 ионов на счету. Продолжительность динамического исключения был установлен на 30 сек. Время накопления ионов была установлена ​​на 300 мс (МС) и 50мсек (МС / МС).

9. Поиск в базе данных

  1. Скачать P. палочки NCBI-базы данных через домашнюю страницу NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
  2. Преобразование MS сырой спектры в талисман общих файлов (MGF), используя инструмент преобразования MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
  3. Искать в этом MGF файл, используя талисман версии 2.3 против P. палочки NCBI-база данных, содержащая в прямом и обратном-приманки записи белка.
  4. Выполните в силикомарганца трипсина пищеварения после лизина и аргинина (если не сопровождается пролина) Мириться два пропущенных расколы в полной мере триптических пептидов.
  5. Установите параметры поиска по базе данных, чтобы окисленных метионины (15,99491 DA) как переменную изменениями и carboxyamidomethylation (57,021464 Да) остатков цистеина как фиксированная модификации. Для MASCOT поиск насчисле сканирование с высоким разрешением, положить массу терпимости предшественника 15 страниц в минуту и ​​установите массовой терпимости фрагмент 0,6 Da. Наконец, установите белок FDR до 1%.
  6. Импорт талисман поиски P. палочки CCMS опыты в строительные леса (Proteomesoftware, версия 3), установите параметры для получения белка FDR близко к 1%, и извлечь полной спектральной пунктам.
  7. По мнению представителя Результаты представлены в этой статье, мы использовали в паре Испытание Т сравнить эксперимент с контролем конкуренции и рассматривается только хиты со значением р ниже 0,1 и спектральной отношение счета над 2 (опыт спектральные отсчеты / управления соревнованиями спектральных на счету).
  8. Данные могут быть экспортированы в любой редактор электронных таблиц для дальнейшего анализа.

10. Этикетка без Количественное

  1. Импорт необработанных файлов в Progenesis LC-MS программного обеспечения (Нелинейная динамика, версия 4.0).
  2. Выполните выравнивание LC-MS и функцию обнаружения по умолчанию в АдминNGS.
  3. Экспорт данных в формате MGF от Progenesis LC-MS.
  4. Поиск спектров MS / MS, используя талисман против NCBI P. база данных палочка, содержащий вперед и назад, приманки записи белка.
  5. Импорт результатов поиска по базе данных в Progenesis ЖХ-МС и карта пептидов идентификации с особенностями MS1.
  6. Для оценки данных (расчета уровней значимости, складные изменения коэффициентов) был использован сценарий ProteinSQAnalysis из SafeQuant (порог: значение Q ниже 0,1, спектральный коэффициент счетчика выше 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для идентификации новых C-ди-GMP эффекторов П. палочки мы систематически используется СКК для анализа растворимых и мембранных фракциях P. палочки штамма PAO1 из лог-фазе культуры (OD 600 = 0,5). Здесь мы подвести итоги и обсудить репрезентативные результаты этого рыбалку. Были использованы четыре независимых биологические реплики. Для каждого эксперимента были использованы два различных концентраций CDG-CC (5 мкм и 10 мкм). Исследовать на специфичность, эксперименты проводились в присутстви...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Особое внимание должно быть принято на несколько шагов протокола. Концентрацию белка является критическим параметром при концентрации 10 мг / мл быть трудно достичь, когда клетки выращивают в определенных условиях роста (например биопленки или небольшие колонии вариантов). Таким образом, осадок ресуспендирования должны быть выполнены в небольшом объеме буфера для лизиса. Концентрации белка может быть уменьшена до 8 мг / мл. По сравнению с методом, опубликованном Nesper и др. 1, мы добавили р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Альберто Рейндерса за его работу по оптимизации условий CCMS для P. aeruginosa. Мы также благодарим Пабло Манфреди за аннотацию белков P. aeruginosa. Эта работа была поддержана грантом Швейцарского национального научного фонда (SNF) Sinergia CRSII3_127433.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 В)УФ-лампы, соединенные с охлаждающим 96-пластинчатым охлаждающим блоком, для фотоактивации
caproMagcaprotec bioanalyticsвходят в стартовый комплект CCMSДля удобной работы с магнитными частицами без пипетирования
c-di-GMP caproKitcaprotec bioanalyticsпо запросуНабор содержит компаунд c-di-GMP-capture, c-di-GMP (для контроля соревнований), магнитные шарики со стрептавидиновым покрытием, буфер захвата и промывочный буфер
Одноразовые обессоливающие колонки PD-10GE Healthcare17-0851-01 
12-трубочные ПЦР-стрипыThermo ScientificAB-1114
UIS250v сопроводительный аппарат с VialTweeterHielscher ультразвуковойтехнологией UIS250v и VialTweeter
Миниатюрная французская ячейка давленияThermo Electron CorporationFA-003

Ссылки

  1. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  2. Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
  3. Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
  4. Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
  5. Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  6. Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
  7. Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
  8. Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
  9. Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
  10. Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
  11. Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
  12. Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
  13. Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
  14. Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
  15. Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
  16. Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
  17. Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
  18. Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
  19. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  20. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
  21. DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).
  22. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
  23. Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
  24. Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

c di GMPPseudomonas aeruginosaFrench PressPD 10
Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.