Тонкослойная Хроматографическое (ТСХ) Разделение и Биоанализы растительных экстрактов для идентификации антимикробные соединения

Краткое содержание

Описаны методы тонкослойной хроматографии (ТСХ) разделения растительных экстрактов и контактной bioautography выявления антибактериальных метаболитов. Методы применяются к скрининга клевера лугового фенольных соединений, ингибирующих гипер аммиака бактерии-продуцента (ВЦВ) родные к бычьей рубце.

Аннотация

Общий экран для растений антимикробных соединений состоит из разделения растительных экстрактов на бумаге или тонкослойной хроматографии (ПК или ТСХ), подвергая хроматограммы в микробных суспензий (например, грибы или бактерии в бульон или агар), позволяя время для микробов расти в влажной среде, и визуализации зон, не микробного роста. Эффективность этого метода скрининга, известный как bioautography, зависит как от качества хроматографическим разделением и на тщательные с микробными условиях культивирования. Эта статья описывает стандартные протоколы для ТСХ и контактной bioautography с новым приложением для аминокислотных брожения бактерий. Экстракт отделяют на гибких (алюминий спинкой) кремнезема ТСХ пластин, и полосы визуализируются под ультрафиолетовым (УФ) света. Зоны вырезать и инкубировали лицевой стороной вниз на агаре инокулировали с тест-микроорганизма. Тормозные полосы визуализировали окрашиванием агара пластиныс с тетразолий красный. Метод применяется к разделению красного клевера (клевер луговой резюме. Kenland) фенольных соединений и их скрининга на активность в отношении Clostridium sticklandii, гипер аммиака производящих бактерии (ВЦВ), что является родным для крупного рогатого скота рубце. ТСХ методы применимы ко многим типам растительных экстрактов и других видов бактерий (аэробных или анаэробных), а также грибов, могут быть использованы в качестве тестовых организмов, если условия культивирования модифицированы, чтобы соответствовать требованиям роста видов.

Введение

Анализа на антимикробных соединений в растениях требует разделения компонентов растительного экстракта, подвергая тест-микроорганизма в тех компонентов, и определения, является ли рост микроорганизма в ингибируется любого из соединений. Разделение с помощью бумажной или тонкослойной хроматографии (ПК или ТСХ) удобны тем, что многие соединения могут быть разделены на плоской поверхности. Разделение основано на полярности, при этом некоторые соединения связывания крепко адсорбента (целлюлозы в случае ПК, а также ряд адсорбентов в случае ТСХ) и миграции меньше, чем другие ^1. Рисунок 1 дает пример взаимного расположения полярные и неполярные фенольные соединения после разделения на диоксид кремния ТСХ пластины.

Рисунок 1. Диаграмма, иллюстрирующая распределение соединений различной полярности после разделения на силикагеле, тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины. Фенольные соединения из красного клевера (Trifolium луговой L.) используются в качестве примера. Полярные соединения, такие как clovamide, имеют сильное сродство к полярным адсорбентом, как диоксид кремния и остаются вблизи начала координат (OR), а менее пол рные соединени, такие как три изофлавонов вблизи фронта растворителя (SF), раздел более легко в растворителях (которые являются менее полярным, чем кремнезема, если вода, кислоты, основания или не включены) и мигрировать дальше вверх пластины.

После отделения экстракта на ТСХ пластине, тестовые микроорганизмы могут подвергаться воздействию всех соединений на пластине, тем самым ускоряя идентификацию активных компонентов экстракта ^2. Если грибковая или бактериальная культура подвергается хроматограмме, микробный рост будет происходить везде, кроме над районами с роста-ингибиторау соединения. Зон ингибирования могут быть визуализированы при наблюдении контраст между мицелия и областей роста свободной если грибы были применены ^три или распылением с соединениями, которые меняют цвет, когда уменьшается или гидролизованный живыми клетками, ^4. Хотя использование бумажных или тонкослойных хроматограмм для антимикробных анализов был впервые применен к антибиотикам ⁵ и фунгицидов ^3,6, растительные экстракты в настоящее время часто скрининг на антимикробных соединений с этим методом, часто упоминается как bioautography. Протоколы, описанные здесь, относятся к bioautography тонкослойных хроматограмм. ТСХ широко используется, потому что это относительно быстрый и могут быть выполнены на различных адсорбентов (например, кремнезема, крахмал, оксид алюминия), а также обеспечивает хорошую разрешение и чувствительность ^1.

Растительные экстракты могут быть подготовлены для ТСХ во многих отношениях. Общие методы включают извлекающий растительный материал в алкohol-водные смеси, такие как 80%-ного этанола ^7,8, возможно, с добавлением кислоты или основания ^9. После экстракции в таких растворителей, содержащих воду и, возможно, кислой или основной, экстракты должны быть сконцентрированы, так что они могут быть применены к пластинах ТСХ в минимальном объеме. Концентрация алкоголя водных экстрактов может быть достигнуто путем разделения с несмешивающихся с водой органических растворителей ⁸ или смесью этих растворителей, таких как этилацетат-этиловый эфир (1:1, об / об) ^10,11. Различные метаболиты растений экстрагировали в различных органических растворителей, в зависимости от их полярности. Чтобы гарантировать, что растительные органические кислоты или основания извлекаются в органических растворителях на этой стадии, рН экстракта водно-спиртовой может быть повышена или понижена с водорастворимой кислоты или основания для преобразования диссоциированных аналитов в их недиссоциированных форм, которые затем растворимый в нейтральных органических растворителях ^9. Органическую фазу может быть адресvaporated при пониженном давлении или в атмосфере азота и доводили до требуемого объема для ТСХ. РН экстракта вряд ли будет смертельным для биопроб микроорганизмов за счет разбиения аналитов в нейтральных растворителей, небольшой конечного объема, и испарения экстракта на ТСХ пластине перед разделением.

Оба грибки и бактерии используют в качестве тестовых микроорганизмов в bioautography растительных экстрактов ^2. Споры некоторых грибов, таких как Cladosporium cucumerinum, прорастают на пластинах ТСХ (кроме областей с ингибирующих соединений) если распыляют на пластинах в питательном растворе и инкубировали во влажной среде в течение нескольких дней ^3. Темная мицелий С. cucumerinum на noninhibitory зон обеспечивает резкий контраст зон, свободных от роста мицелия. Хотя бактерии были применены к тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластин таким же образом, ^4,12, бактерии также выливают на ТСХповерхности пластины в агар перекрывает ^13,14. Дрожжи, таких как Candida Albicans, может быть применен в чашках с накладками, а ^14. Кроме того, ТСХ пластины могут быть размещены лицевой стороной вниз на агаре инокулировали с бактерий или дрожжей ^{10,15 8,} способом, известным как контактное bioautography ^2.

Мы опишем метод для контактной bioautography для выявления противомикробных фенольных соединений из красного клевера (клевер луговой CV. Kenland). Тест микроорганизм Clostridium sticklandii, рубца гипер аммиака бактерия-продуцент (ВЦВ) и обязать анаэробные. Хотя разделение используемые не решают все компоненты экстракта, они облегчают идентификацию зон антимикробной активности, таким образом, сужение круга возможных противомикробным соединений. Протокол использует стандартные процедуры для ТСХ ^1. Протокол также описывает некоторые из методов, необходимых для культивирования обяворота анаэробы для такого анализа, использование контактной bioautography ¹⁵ и способу визуализации с тетразолиевого соли, которая окрашивает живые клетки ^2,4.

Протокол

1. Получение экстракта растений

1. См. Каган и Flythe ¹⁰ для извлечения фенольных соединений из клевер луговой сорта. Kenland.
2. Чтобы извлечь другие соединения в других растениях, проверьте фитохимическое анализа литературы для растений или метаболитов конкретных методов извлечения (многие из них, описанный), или искать протоколов, таких как те, из Khurram др.. ^7,8, которое изолирует много соединений с широким диапазон полярности.

2. Подготовка тонкослойной Плиты

1. Чистые ТСХ путем разработки в одном или нескольких полярных нейтральных растворителей, в целях продвижения адсорбированных загрязнений из зоны развития.
   1. В вытяжном шкафу, подготовить достаточно очистки растворителем (например, 15-100 мл смеси этилацетат-метанол 2:1, об / об), чтобы покрыть дно камеры развивающихся ТСХ, а также нижний край на ТСХ пластине, когда множество внутри камеры.
   2. Используйте Commerбенно доступны стекло ТСХ разработке камеры (различные имеющиеся размеры, с крышками) или фольги, покрытой Pyrex стаканы или банки для консервирования.
   3. Используйте ножницы, чтобы вырезать алюминия или пластика спинкой (гибкий) силикагельных пластинах, которые бывают различных размеров (20 см х 20 см и меньше), чтобы соответствовать доступной развивающихся камеру. (Внимание: кремнезем может вызвать повреждение легких при вдыхании Работа в вытяжной шкаф, и обрабатывать ТСХ-пластин в перчатках, чтобы избежать попадания масла кожи на кремнезема..)
   4. Вставьте пластины в камеру, с вершинами, прислонившись стенок камеры. Пластины не должны касаться друг друга. Накройте камеру и пусть растворитель двигаться вверх пластину под действием капиллярных сил.
   5. Когда растворитель достиг вершины пластин, снять тарелки из камеры и организовать в положении стоя внутри вытяжного шкафа до растворитель не испарится.
   6. Проверьте, если примеси мигрировали в верхней части ТСХ-планшета, глядя на желтой полосой под видимымсвет, или флуоресцентный группа под ультрафиолетовой (УФ) (см. "примесей фронт» или если в рисунке 2B). Если большинство пластины все еще имеет желтоватый оттенок, повторите процесс очистки.
   7. После удаления ТСХ-пластин из камеры, отказаться от растворителя. Разрешить остаточный растворитель испаряется полностью, прежде чем использовать камеру для протокола 2.
   8. Для удаления остаточной влаги, что может повлиять на миграцию соединений на силикагеле ^16, проп пластины в вертикальном положении в сушильном шкафу при 100 ° С (10-15 мин в течение 20 см х 20 см пластины, а 5 мин в течение 7 см х 10 см пластины ).
   9. Если 100 ° С сушильный шкаф не доступен, тепловые пластины для более длительного периода времени при более низких температурах (например, 40 мин при 60 ° С).
   10. После того, как пластины сухой, пусть остыть до комнатной температуры перед загрузкой.

3. Подготовка Разработка палаты для Extract разъединении

Используйте ножницы, чтобы вырезать кусочек фильтровальной бумаги немного ниже высоты камеры и около половины в камере периметр в ширину. Эта статья действует как фитиль, чтобы привлечь растворитель вверх стенкой камеры и насыщают камеру с паров растворителей, тем самым улучшая воспроизводимость разделения ^1.

В вытяжном шкафу, смешать растворители (этилацетат-метанол 4:1, объем / объем, в данном исследовании). Налейте смесь растворителей в камеру и крышка. Подождите, пока вся фитиль не мокрая с растворителем, указывая насыщение камеры, поставить тарелки в камеру.

4. Загрузка и развитие ТСХ

1. Слегка отметить происхождение с карандашом. Если пластина адсорбент ТСХ мягкий и легко повредить, сделать отметки на краях. Соединения должна быть выше поверхности проявляющего растворителя, когда пластины, вставленной в камеру ТСХ.
2. Растворить экстракты в достаточно органическом растворителе (в данном случае, метанол), чтобы иметь концентрированного раствора вместо мутныйподвеска.
3. Образцы нагрузки и стандарты как узких полос с микролитра шприца или капиллярных микропипеток, оставляя 1 см границу по бокам пластины. Разрешить полосы высохнуть (разжигание тарелку или загрузкой в ​​вытяжной шкаф помогает).
4. Если большая концентрация образца необходима на тарелке "репорт" по загрузки образцов снова на высушенных полос.
5. С щипцов или щипцов, установить пластину (ы) внутри насыщенного ТСХ камеры. Пластины не должны касаться фитиль, поскольку это может обеспечить растворитель к пластинам в точках контакта, тем самым изменяя путь соединения миграции. Крышка отсека и пусть пластины развиваться.

5. Подготовка пластин для биопроб

1. Удалить пластину (ы) из ТСХ до переднего растворитель достигает верхней плите, и отметить высоту фронта растворителя с карандашом. Пусть пластины сухой в вытяжной шкаф.
   1. Разработка оставшиеся ТСХ-пластин в той же TLC камеры, которая GEnerally использовать в течение всего дня, если закрыты. Переделка смеси растворителей для ТСХ камеры, если количество растворителя в камере особенно уменьшается.
2. После пластины сухие, визуализировать полосы при видимом или УФ-излучения, и разграничить полосы с карандашом. Просмотра камера с портативным УФ-лампы удобно, особенно если лампа может обнаружить соединения как на длине волны 254 нм (коротковолновое УФ) и 365 нм (длинноволновое УФ).
   Примечание: На данный момент или после следующего шага, пластины могут быть завернуты в полиэтиленовую пленку, накрывают пленкой и хранить при температуре -20 ° С. Максимальное время хранения зависит от соединения стабильности. Потому что кремнезем не является нейтральной, некоторые соединения могут ухудшить то время как на пластину ТСХ.
3. Сфотографируйте или фильеры.
   1. Используйте систему гель фотодокументация если оснащен подвесным УФ и / или видимого света доступен.
   2. Если не коммерческая система фотодокументация не доступен, фотография пластины внутри коробки выстроились с темной бумаге или ткани, шй набор камеру на штатив и портативный ультрафиолетовый свет зажат в кольцо стоять ^17. При фотографировании пластины, которые не имеют флуоресцентного индикатора, использовать синий светофильтр на объектив камеры, чтобы улучшить внешний вид полосы ^17.
4. Для помощи в характеризующая полосы, рассчитать коэффициент удержания (R _F) значения путем измерения расстояния, пройденные соединения и фронта растворителя, и деления бывший на последней (рис. 2А).

6. Бактериальный Культура и анализа

1. Подготовка и привить СМИ в анаэробных условиях. Культура используется в данном случае было Clostridium sticklandii штамм SR, который был получен из коллекции культур Джеймс Б. Рассел, Корнельского университета, Итака, штат Нью-Йорк.
   1. Смотреть Flythe и Каган ¹³ и список материалов для описания ВЦВ СМИ.
2. Расти культуру к экспоненциальному или стационарной фазы. Используйте стерильную анаэробного techniquэс при работе с анаэробных микроорганизмов.
3. Инокулировать культуру (1% об / об) в расплавленный агар После того как температура агара (0,75% вес / объем) снизилась до менее чем 60 ° С. Осторожно перемешать и немедленно привести в анаэробной камере (95% CO ₂ -5% Н ₂ атмосфера для ВЦВ СМИ) налить.
4. Налейте в 15 мм х 100 мм пластиковые чашки Петри, и позволяют затвердеть.
5. С ножницами, вырезать пластинки ТСХ на зоны, содержащие группу (ы) интерес. Положите полосы лицом вниз на чашках с агаром, маркировка полосы на пластины поддержке отслеживать исходной ориентации на ТСХ пластине. Lay неиспользуемый ТСХ полосу на чашке с агаром в качестве контроля.
6. Выдержите агаром, агар стороной вниз, в анаэробной камере (24 часа в сутки, 39 ° C).

7. Визуализация биоанализу чашках с агаром

1. С пинцетом удалите полосы от чашки с агаром, пока они находятся в анаэробной камере.
2. Добавить 1% (вес / объем) TEtrazolium красный, получены в воде, по каплям на поверхность чашек с агаром. Разрешить цвет разработать по крайней мере 20 минут, или пока управление пластина не получается полностью красный, прежде чем снимать с анаэробной камере. В анаэробных бактерий начнет терять жизнеспособность сразу после снятия с анаэробной камере, но цвет стабилен в течение более чем 24 часов.
3. Сфотографируйте под видимого света.

Результаты

Представительства кремнезема TLC разделения красного клевера (клевер луговой резюме. Kenland) экстракты, содержащие фенольные соединения, показаны на рисунке 2. Разделение красного клевера экстракта в смеси этилацетат-гексан (9:1, об / об), более 8,5 см, в результате пять групп, одна полностью решены от начала координат (рис. 2а). Тем не менее, 2В показывает, что примерно в два раза много групп были выявлены, когда другой образец экстракта красного клевера (из ...

Обсуждение

Этот протокол описывает простой способ разделения выписку на подмножества соединений и анализируя эти подмножества контактным bioautography. Метод очень похож на одного используемой Chomnawang др.. ¹⁵ для выявления метаболитов растений ингибирующих чтобы гонореей бактерий. Тип bioautography, используемого для экрана для антимикробных соединений растений зависит от многих факторов, в том числе тест-микроорганизма, лабораторной установки и предпочтений лица (лиц), осуществляющего биопробы. Связаться bi...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пластины Silica F254 TLC, алюминиевая подложка, толщина 0,2 мм, 20 см x 20 см	EMD Chemicals	5554/7	Эти пластины покрыты диоксидом кремния, который содержит индикатор, флуоресцентный при длине волны 254 нм. Соединения, поглощающие на этой длине волны, кажутся темными на флуоресцентном зеленом фоне. Альтернативные источники включают Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Могут потребоваться адсорбенты, отличные от диоксида кремния. Пластины с пластиковой подложкой могут подойти, в зависимости от используемых растворителей.
Острые, сверхпрочные ножницы	любая компания по поставке шитья	аналогичная Fiskars 175800-1002	Для раскроя пластин TLC. Также можно использовать резак для бумаги с острым лезвием. Не вдыхайте кварцевую пыль.
Сушильный шкаф на 100 градусов; C (механическая конвекция)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Чикаго, Иллинойс (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Хиллсборо, Орегон (www.cascadetek.com)
TLC chamber	Kimble Chase	416180-0000	Альтернативные источники:  Олдрич. Мензурки Pyrex или банки для консервации можно использовать для небольших тарелок (т.е. 5 см х 10 см).  Накройте алюминиевой фольгой (крышки банок могут содержать материал, извлекаемый парами растворителя).
50 & микро; l Шприц с плоским наконечником иглы	Hamilton	80965	Для загрузки стандартных объемов или проб более 5-10 л. Альтернативные источники равноценны.
Микропипетки	Drummond	2-000-001	Для загрузки небольших количеств эталонов или образцов. Альтернативные источники:  VWR.  Кроме того, пастеровские пипетки можно растягивать до более тонкого диаметра с помощью бутановой горелки.
Фильтровальная бумага (#1 сорт)	Ватман	1001 917	Служит камерным фитилем. Другие сорта фильтровальной бумаги ОК. Этот размер может быть обрезан для камер, вмещающих пластины размером 20 см x 20 см.
Щипцы для стакана	Fisher Scientific	15-186	Для установки тарелок в большую камеру TLC и из нее. Альтернативные источники: VWR
Щипцы с плоскими краями	Fisher Scientific	10-275	Для установки пластин в малую камеру и из нее. Альтернативные источники: VWR
Маленькая портативная УФ-лампа с лампами мощностью 4 Вт или 6 Вт для коротковолнового и длинноволнового УФ-освещения (254 и 365 нм соответственно)	Ультрафиолетовые продукты	95-0271-01	Альтернативные источники: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Смотровой шкаф для использования с ручной УФ-лампой	Ультрафиолетовые продукты	Chromato-Vue C-10E	УФ-активные полосы легче обводить, если здесь можно установить пластины. Альтернативные источники: Spectronics Corporation.
Система фотодокументирования с накладной УФ-лампой и видимой лампой	Kodak	Gel Logic 200	Альтернативные источники: ультрафиолетовые продукты (www.uvp.com).  Смотрите протокол для домашней альтернативы.
Анаэробная камера, тип A, виниловая камера		7150000	Эта камера подходит для анаэробных бактерий, таких как Clostridium sticklandii, как описано.   Тем не менее, условия роста должны быть адаптированы к организму, используемому в анализе. Шкаф биобезопасности и другие меры предосторожности должны быть приняты в случае использования патогенных организмов. Альтернативные источники: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, другие
Тетразолий красный	Sigma-Aldrich	T8877	Альтернативные источники: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ингредиенты для сред ВЦВ
Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Для этого и для всех других реагентов в этой таблице альтернативные источники эквивалентны.
Рибофлавин	Сигма-Олдрич	R4500
Тиамин HCl	Сигма-Олдрич	T3902
Никотинамид	Сигма-Олдрич	N3376
Кальций D-пантотенат	Сигма-Олдрич	C8731
Липоевая кислота	Сигма-Олдрич	Т5625
-аминобензойная кислота	Сигма-Олдрич	A9878
Фолиевая кислота	Сигма-Олдрич	F8798
Биотин	Сигма-Олдрич	B4639
Кобаламин	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Пиридоксин	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Сульфат железа · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Сульфат цинка · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Хлорид марганца · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Борная кислота	Sigma-Aldrich	B6768
Хлорид кобальта · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Хлорид меди · 2H2O	Sigma-Aldrich
Никелевый хлорид &миддот; 6H<суб>2О	Сигма-Олдрич	203866
Молибдат натрия &миддот; 2H<суб>2О	Сигма-Олдрич	331058
Триптиказе (Панкреатический расщеп казеина)	Thermo Fisher	B11921
Фосфат калия одноосновной безводный Thermo	Fisher	P284
Карбонат натрия · H2O	Thermo Fisher	S636
Агар	Thermo Fisher	50841063
Сульфат магния · 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Кальция хлорид · 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Cysteine HCl	Thermo Fisher	19464780
калий фосфат двухосновной безводный	Thermo Fisher	P290
Хлорид натрия	Thermo Fisher	BP358