Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной

Измерение различия концентрации многих белков между сложных образцов является главной задачей, в протеомики. Все чаще это делается путем маркировки белков в каждом образце с разными тегами изотопных, сочетая образцы, и с помощью масс-спектрометрии для количественного различия концентрации. Существует несколько способов для стабильного изотопного мечения белков и пептидов. ¹⁵ N маркировка ¹ и ² SILAC ввести изотопные метки метаболически в естественных условиях, в то время как ICAT ^3, iTRAQ ^4, и снижение Диметилирование ⁵ добавить стабильных изотопов метки после экстракции белка и пищеварения. Среди этих методов, восстановительное Диметилирование (Реди маркировка) набирает популярность как недорогой, воспроизводимый метод для количественного различия концентрации белка в почти любого типа образца.

Реди маркировки включает взаимодействие пептидов с формальдегидом с образованием основани Шиффа, которое затем восстанавливаютцианоборогидрид. Эта реакция dimethylates свободные аминогруппы на N-концах и лизин боковых цепей и monomethylates N-концевых пролинов. Протокол, описанный здесь метилирует пептиды в образце 1 с «легкой» этикетки с использованием реагентов с атомами водорода в их естественной распределения изотопного и образца 2 с «тяжелой» этикетки с использованием дейтерированных формальдегид и цианоборгидрид (рис. 1). Каждый диметилированный аминогруппу на пептида, приводит к разнице масс 6,0377 Da между легкой и тяжелой формы, который используется, чтобы различать между двумя формами с помощью масс-спектрометра. В частности, относительное содержание пептида количественно как отношение MS1, выделенных областей ионных хроматограмм (MS1 отношение площади пика) легкой и тяжелой версии для каждой пары пептид ионов. Относительное содержание белка определяется как отношение средней MS1 площади пика среди всех пептидов в белке. В этом докладе мы описываем надежную протокол для проведенияING Реди маркировки эксперименты по LC-MS/MS что включает в себя пептид твердофазного добычу обращенной фазой, на-колонке Реди маркировку, пептидный фракционирования по щелочного рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии и очистка пептидных смесей с помощью StageTips (рис. 2) . Мы обсудим возможности и ограничения использования Реди маркировку для количественных протеомики.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан ^12.

1. Белок Изоляция

Подготовка 1 мг клеточного белка путем лизиса клеток, предпочтительно с помощью физических методов, таких как французский пресс, кромочная биения, или ультразвуком. Избегать лизоцима-опосредованного лизиса клеток, потому что фермент будет смешивать измерения масс-спектрометрии.

2. TCA Осадки белков

Добавить 1 объем трихлоруксусной кислоты (ТСА) в 4-х томах белка и охладить на льду в течение 10 мин с осаждением белков. Центрифуга при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденного льдом ацетона и центрифуге при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и инвертировать трубку на скамейке, чтобы высушить осадок в течение 15 мин. Белковые магазин гранулы при температуре -80 ° С.

3. Денатурации белков и уменьшить дисульфидных связей

Реприостанавливать белки до ~ 2 мг / мл в 500 мкл буфера денатурации и сокращению (либо 4 М мочевины или 3% SDS в 50 мМ HEPES рН 8,5, 5 мМ DTT). По желанию, включают ингибитор протеазы в буфере. Инкубируют протеины течение 30 мин при 56 ° С, а затем 10 мин при комнатной температуре.

4. Aklylate свободные сульфгидрильные группы необратимо сорвать образование дисульфидной связи

Подготовьте свежий 0,3 M иодацетамидом в воде. ВНИМАНИЕ! Йодацетамид высоко токсичен. Добавить 25 мкл 0,3 М иодацетамида (15 мм конечная концентрация) в 500 мкл белка и инкубировать в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Гасят добавлением иодацетамида 10 мкл 300 мМ ДТТ (5 мМ DTT конечная концентрация). Храните алкилированные белки при -80 ° С

5. Белок Пищеварение

TCA осадок белки (как описано в шаге 2) и ресуспендируют в 1 мл 50 мМ HEPES (рН 8,2), 1 М мочевины. Подготовка исходного раствора лизил endoproteinASE (Lys-C) в воде при концентрации 2 мкг / мкл и добавить 5 мкл к раствору белка. Выдержите смесь в течение 16 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что конечная концентрация Lys-C 10 нг / мкл, а соотношение белок-к-LysC (вес / вес) 1/50 до 1/200. Ресуспендируют 20 мкг трипсина секвенирования класса в 40 мкл 50 мМ уксусной кислоты, добавляют 5 мкл (10 мкг трипсина) с Lys-C дайджеста, и инкубируют в течение 6 часов при 37 ° С. Используйте ту же концентрацию протеазы и протеазы-на-белка отношения для Lys-C, который используется для трипсина.

6. Обращенно-фазовая Пептид Добыча

1. Подкисляют пептиды добавлением трифторуксусной кислоты (ТФУ) до конечной концентрации 0,5% (рН ≈ 2). Прикрепление колонки С18 в экстракционную коллектора. Используйте максимально возможную скорость потока для всех шагов, кроме погрузки и элюирования пептидов.
2. Влажный колонка с 6 мл ацетонитрила (ACN). Промыть колонку с 6 мл 80% ACN, 0,1% трифторуксусной кислоты, затем уравновешивают 6 мл 0,1% TFA. Не допускайтеколонка всухую между шагами.
3. Стоп давление вакуума и загрузить 500 мкг пептидов на колонку при скорости потока приблизительно 1 мл / мин. После того, как пептиды, связанный с колонки, перезагрузка вакууме и промывают 6 мл 0,1% TFA, а затем 3 мл буфера лимонной кислоты (0,09 М лимонной кислоты, 0,23 М Na ₂ HPO _4, рН 5,5).
   Примечание: Более высокие количества пептидов могут быть помечены но колонка C18 связывающей способности должно быть по крайней мере в два раза выше, чем количество пептида, чтобы избежать потери образца.

7. На-колонке Пептид маркировки восстановительным Диметилирование (Реди Маркировка)

Выполните этот шаг под химической капотом, как цианистый водород выделяется в низкой концентрации в процессе маркировки.

1. Подготовка 12 мл «легких» и «тяжелых» Реди буферов метилировать пептид свободные амины. Свет буфер Реди состоит из 0,8% формальдегида и 0,12 М натрийцианборгидрида балансовой атомов водорода в гоОДП природные распределения изотопные в буфер лимонной кислоты. Тяжелая буфер Реди состоит из 0,8% дейтерированном формальдегида и 0,12 М дейтерированном цианоборгидрида натрия в буфере лимонной кислоты.
2. Столбец, содержащий пептиды Выдержите, добавив 10 мл либо легкие или тяжелые буферных Реди в пептидных содержащих колонны на скорости потока 1 мл / мин и повторить, чтобы обеспечить полное маркировку. Wash колонка 6 мл 0,1% TFA, а затем 1 мл 0,5% уксусной кислоты.
3. Стоп вакуум и элюируют сначала меченых пептидов с 1 мл 40% ACN, 0,5% уксусной кислоты, затем 1 мл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты при скорости потока приблизительно 0,5 мл / мин. При желании, измерения эффективности маркировки отдельных образцов методом масс-спектрометрии перед смешиванием тяжелые и легкие образцы (см. "Представитель результаты"). Смешайте 1:01 тяжелые и легкие меченных проб пептидные быть количественно с помощью масс-спектрометрии.

8. Отдельный смеси пептидов по Базовая рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии </ Р>

Основные рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии для разделения смеси пептидов на несколько фракций, которые независимо проанализированных LC-MS/MS увеличить охват протеома.

1. Фракционирования смеси пептидов на колонке C18-ВЭЖХ с применением градиента возрастающей концентрации ACN в 10 мМ бикарбоната аммони (рН 8). Начнем с 5% (объем / объем) ACN в течение 5 мин, увеличится до 35% ACN в 60 мин, а затем до 90% ACN в течение 1 мин. Сохранить 90% ACN в течение 4 мин до снижения ACN до 5%, чтобы повторно уравновесить колонку в течение 9 мин. Сбор фракций 96 равным объемом в 96-луночный планшет (A1, чтобы H12). Монитор фракционирование с помощью УФ-детектора при 220 нм в то время как пептиды элюируя из колонки (10-70 мин для условий, описанных здесь).
2. Объедините фракции из колодцев A1, C1, E1, и G1 (фракция А1), из лунки B1, D1, F1, и H1 (фракция B1), из скважин А2, С2, E2 и G2 (фракция А2) и, соответственно, для Остальные фракции. Снимите solvenт с использованием вакуумной центрифуге. Ресуспендируют пептиды из фракций A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, В8, A9, B10, A11, B12 и в 130 мкл 1 М urea/0.5% TFA и очищают с помощью StageTips, как описано в шаге 9. Магазин фракции В1, А2, В3, A4, B5, A6, В7, А8, В9, А10, В11 и А12 при -20 ° С.

9. Purify Пептиды по остановиться и пойти Добыча (StageTips)

Подготовка С18-StageTip ⁷ Микроколонки по упаковке 200 советов мкл пипетки с двух С18 дисков с внутренним диаметром (ID) 1,07 мм. Положите Stage Советы в пробирки Эппендорф. Использование микроцентрифуге мыть советы с 130 мкл метанола, затем 130 мкл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты. Равновесие StageTips с 130 мкл 0,1% TFA. Передача пептидную смесь до StageTips и промывают 130 мкл 0,1% TFA, а затем 40 мкл 0,1% TFA, а затем 40 мкл 0,5% уксусной кислоты. Элюции пептиды сначала с 20 мкл 40% ACN, 0,5% уксусной кислоты, затем 20 мкл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты. Комбинат элюатый сухой вакуумной фильтрацией.

10. Микрокапиллярной ЖХ-МС/МС

1. Растворить пептиды в 1-5 мкл 5%-ной муравьиной кислоты, 5% ACN в концентрации приблизительно 1 мкг / мкл. Разрешать ~ 1 мкг пептидов на 100 мкм × 20 см C18-обращенно-фазовой колонки ВЭЖХ с градиентом 6-22% ACN в 0,125% муравьиной кислоты, применяемые в течение 75 или 100 мин при скорости потока ~ 300 Нл / мин.
2. Определить пептиды с помощью LTQ Orbitrap Velos ¹² или аналогичный жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии платформу с масс-спектрометр обеспечить высокое разрешение и высокую точность массовое. Используйте масс-спектрометра в режиме данных зависит от с полным МС сканирования (разрешение 60000) приобретенной в анализаторе Orbitrap. Создать линейного захвата ионов MS / MS спектры для 20 наиболее распространенных ионов, обнаруженных в полном спектре MS. Установите автоматическую регулировку усиления (АРУ) Цели 1 х 10 ⁶ для полного МС и 2000 для MS / MS. Установить максимальное время накопления ионов до 1000 мсдля РС и 150 мсек для MS / MS. Исключить фрагментированные ионы пептид прекурсоров из дальнейшего отбора от MS / MS для 20-60 сек.

11. MS / MS сбора данных

Идентификации пептидов путем сравнения MS / MS спектры RAW файлов в теоретической базы данных с помощью алгоритма, такого как SEQUEST ⁸ с использованием этих параметров (табл. 1).

Таблица 1. Пептид базы данных по Параметры поиска.

1. Фильтровать пептиды до 1% ложных открытий с таким методом, в качестве целевого-приманка ⁹ стратегии, используя базу данных открытых рамок считывания в фактических и обратной ориентации.

12. Пептид Количественное

Рассчитать области тяжелой и легкой пар MS1 извлечены ионные хроматограммы (пиков MS1) и сигнальный пептид-шум (S / N) отношения ^10. Включите пептидные пар только тогда, когда их средняя сигнал-НойСоотношение себе выше пяти. Количественная относительное обилие пептида в двух образцах, как отношение MS1 пиков тяжелых и легких версий одного и того же пептида (MS1 соотношении площадь пика). Рассчитать относительные белка распространенность в виде среднего коэффициента MS1 площади пика для всех пептидов в белке.

Мы оценили точность, точность и воспроизводимость Реди маркировки с помощью Saccharomyces CEREVISIAE и Clostridium phytofermentans Клеточные лизаты. Мы сначала количественно Реди эффективность маркировки смеси С. phytofermentans белковых лизатов из целлюлозы (тяжелый помечены, H) и глюкозы (светло этикетки, L) культуры. Когда фильтровали с 1%-пептида ложных обнаружения, этот образец содержал 11194 уникальных последовательностей пептида с 98%-ной эффективности Реди маркировки. Нефракционированный С. CEREVISIAE белок Лизат же помечены ч или л реагентов, смешивают в различных соотношениях, и проанализированы. Различия экспрессии белка (войти 2 (медиана пиков MS1)) воспроизводимо отражают соотношения, при котором H и L образцы смешивали в широком диапазоне отношения смеси (рис. 3). В частности, складной изменение на 99% белков были измерены как меньше, чем 1,6 раза за 1:01 смешанных образцов. Вв 1:10 и 10:01 образцы, 99% белков в 3,8 раза ожидаемого коэффициента, показывающий увеличение стандартного отклонения на большем расстоянии от смеси 1:1. Когда Реди маркировка была применена к Clostridium phytofermentans протеома, мы количественно более 2000 белков с 94% белков, измеренных в пределах 2-кратных уровней для повторных культур, растущих на глюкозы (рис. 4А). Белок раз изменения для дублирующих пар культур (глюкоза против целлюлозы) также высокую корреляцию (R 2 = 0,82), (рис. 4, б). С. сравнения CEREVISIAE (рис. 3) из одного культуры и таким образом показать техническую воспроизводимость основе Реди количественных протеомики. С. phytofermentans измерения (рис. 4А, Б) сравнить повторить культур поэтому различия экспрессии представляют как погрешность измерений и биологическую различия между культурами. Вместе, эти экспериментыMENTS поддерживает, что Реди протеомика является точным и воспроизводимым методом для количественного различия экспрессии белка между сложных образцов.

Рисунок 1. Восстановительное Диметилирование пептидов с использованием тяжелых и легких реагенты dimethylate свободные амины. То же пептид помечены тяжелых по сравнению с легкими реагентов имеет 6,0377 Da массовое смещение за свободного амина. Пептид показано здесь обозначен как на N-конце и на боковой цепи лизина. Адаптировано из ведения 11 изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Обзор протокола для количественных протеомики путем восстановительного Диметилирование. Красные цифры выше стрелками соответствуют шагам, описанным в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Оценка Реди маркировки с использованием Saccharomyces CEREVISIAE Клеточные лизаты. Образцы из одной культуры метили либо тяжелых (Н) и светом (L) реагентов, смешанные в различных соотношениях (1H: 10L, 1Н: 5L, 1Н: 2L, 1Н: 1L, 2Н: 1L, 5H: 1L, и 10H: 1L), и белковые различия между Н и L образцов количественно в виде отношений журнал 2 Средний MS1 площади пика (войти 2 соотношение H / L). R значение 2 линейного линии тренда через всех данныхточки был 0,96 (черная линия); корреляция Пирсона 0,98. Границы доверия (красные линии) показывают абсолютную перпендикулярно расстояние от линии тренда, в рамках которой 95% точек данных были найдены для каждого образца. Адаптировано из ссылке 12 изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Количественная оценка Реди-меченых Clostridium phytofermentans белки из культур, растущих из различных источников углерода. А) выражение белка в глюкозы культуры по отношению к культуре репликат глюкозы, гемицеллюлозы культуры, и культуры целлюлозы. Фракция белков, экспрессируемых в двукратно уровнях: глюкозо-глюкозы (94%), глюкозо-гемицеллюлоза (80%), а glucosэлектронной целлюлоза (49%). B) Сложить изменения в экспрессии белка для глюкозы по сравнению с культурами целлюлозы имеют высокую корреляцию (R 2 = 0,82) одинаковых пар культур. Изображения взято из ведения 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.