Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной

Summary

Стабильный изотоп маркировка пептидов восстановительным Диметилирование (Реди маркировки) является быстрым, недорогим стратегия для точных масс-спектрометрии на основе количественных протеомики. Здесь мы показываем, надежный метод для подготовки и анализа белковых смесей, используя подход Реди, который может быть применен к почти любого типа образца.

Abstract

Стабильный изотоп маркировка пептидов путем восстановительного Диметилирование (Реди маркировки) является методом для точного количественного различия экспрессии белка между образцами с использованием масс-спектрометрии. Реди маркировка выполняется с помощью либо обычный (свет) или дейтерированных (тяжелые) формы формальдегида и натрия цианоборогидрида добавить две метильные группы к каждому свободного амина. Здесь мы показываем, надежный протокол для Реди маркировки и количественного сравнения сложных белковых смесей. Образцы белка для сравнения перевариваются в пептиды, маркированные нести легком и тяжелом теги метил, смешиваются и совместно анализировали LC-MS/MS. Относительные распространенности белка количественно путем сравнения ион хроматограмме пиков тяжелых и легких меченых вариантов составного пептида, извлеченной из полного MS спектров. Описанный здесь метод включает пробоподготовки обращенно-фазовой экстракции твердой фазы, в колонку Реди маркировки пептидов, пептидов фракционирование по щелочного рН оборотовersed-фаза (BPRP) хроматографии и StageTip очистка пептида. Мы обсуждаем преимущества и ограничения Реди маркировки в отношении других методов стабильных изотопов регистрации. Мы подчеркиваем новых приложений с использованием Реди маркировке быстрой, недорогой и точный метод для сравнения белковых распространенность в почти любого типа образца.

Introduction

Измерение различия концентрации многих белков между сложных образцов является главной задачей, в протеомики. Все чаще это делается путем маркировки белков в каждом образце с разными тегами изотопных, сочетая образцы, и с помощью масс-спектрометрии для количественного различия концентрации. Существует несколько способов для стабильного изотопного мечения белков и пептидов. ¹⁵ N маркировка ¹ и ² SILAC ввести изотопные метки метаболически в естественных условиях, в то время как ICAT ^3, iTRAQ ^4, и снижение Диметилирование ⁵ добавить стабильных изотопов метки после экстракции белка и пищеварения. С....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан ^12.

1. Белок Изоляция

Подготовка 1 мг клеточного белка путем лизиса клеток, предпочтительно с помощью физических методов, таких как французский пресс, кромочная биения, или ультразвуком. Избегать лизоцима-опосредованного лизиса клеток, потому что фермент будет смешивать измерения масс-спектрометрии.

2. TCA Осадки белков

Добавить 1 объем трихлоруксусной кислоты (ТСА) в 4-х томах белка и охладить на льду в течение 10 мин с осаждением белков. Центрифуга при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить суперна....

Results

Мы оценили точность, точность и воспроизводимость Реди маркировки с помощью Saccharomyces CEREVISIAE и Clostridium phytofermentans Клеточные лизаты. Мы сначала количественно Реди эффективность маркировки смеси С. phytofermentans белковых лизатов из целлюлозы (тяжелый помечены, H) и глюкозы (светло этикетки, L) культуры. Когда фильтровали с 1%-пептида ложных обнаружения, этот образец содержал 11194 уникальных последовательностей пептида с 98%-ной эффективности Реди маркировки. Нефракционированн.......

Discussion

Несколько точек сделать стабильным изотопом маркировки пептидов с использованием привлекательным методом для количественных протеомики восстановительное Диметилирование (Реди маркировки): недорогие реагенты маркировки (реагенты стоить менее $ 1 на образец), высокая скорость реакции (~ 10 мин), отсутствие побочных продуктов, высокие воспроизводимость (рис. 3, 4), стабильные продукты реакции, способность использовать любой протеазы и высокой эффективностью ионизации меченых пептидов. Химический маркировки.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трихлоруксусная кислота	Sigma-Aldrich	T9159	преципитация белка
Ацетон	Sigma-Aldrich	650501	осаждение белка
додецилсульфат натрия	Sigma-Aldrich	71736	денатурирует, снижает содержание белка
гидроксид натрия	Sigma-Aldrich	S8045	денатурирует, снижает содержание белка
DL-дитиотреитол	Sigma-Aldrich	43816	денатурировать, уменьшать, алкилатный белок
Ингибитор протеазы Полный мини коктейль	Roche	4693124001	денатурировать, уменьшать белок
Иодоацетамид	Sigma-Aldrich	I6125	алкилатный белок
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	ресуспенд, экстракт, метка белка
Хлорид кальция	Sigma-Aldrich	C5670	ресуспендировать белок
Лизилэндопротеаза	Wako Chemicals	129-02541	переваривание белка
Секвенирование класса трипсин	Promega	V5111	переваривание белка
Уксусная кислота	Sigma-Aldrich	320099	переваривание белка
Трифторуксусная кислота	Sigma-Aldrich	299537	Реверсивно-фазовая пептидная экстракция
tC18 Sep-Pak C18 картриджи	Waters	WAT054960	Реверсивно-фазовая пептидная экстракция
Экстракционный коллектор	Воды	WAT200609	Обратная фазовая пептидная экстракция
Ацетонитрил	Sigma-Aldrich	14261	различный
формальдегид	Sigma-Aldrich	252549	" светлый» пептидное мечение
цианоборогидрид	Sigma-Aldrich	71435	" светлый» пептидная маркировка
Дейтерированный формальдегид	Sigma-Aldrich	492620	" тяжелый» пептидное мечение
цианобородеторидом натрия	изотопы CDN	D-1797	" тяжелый» пептидное мечение
MES	Sigma-Aldrich	M3671	пептидное мечение
C18-ВЭЖХ колонка (4,6 x 250 мм, 5 &; m размер частиц)	Agilent	770450-902	основная pH-обратимо-фазовая хроматография
Муравьиная кислота	Sigma-Aldrich	399388	различные
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	Советы по этапам
Метанол	Sigma-Aldrich	494437	STAGE советы