Методическая статья

Модифицированный метод для гетеротопической Mouse сердца Transplantion

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51423

⸱

23 июня 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Collaborative Transplant Laboratory, University of Sydney

В этой статье

Краткое содержание

Продемонстрирована методика микрохирургической процедуры гетеротопической трансплантации сердца у мышей, включая упрощенные методы забора донора и анастомоза сосуда-реципиента.

Аннотация

Мыши часто используются в качестве пересадки сердца доноров и реципиентов в исследованиях по пересадке иммунологии в связи с широким диапазоном трансгенных мышей и реагентов доступных. Трудность представляет из-за небольшого размера животного и на значительные технические вызовы микрохирургии, участвующих в трансплантации сердца. В частности, высокий уровень технического сбоя в ранние сроки после трансплантации может быть результатом смерти получателя и послеоперационных осложнений, таких как паралич задних конечностей или не-бьющегося сердца. Здесь полный техника для сердца трансплантации гетеротопическая мыши демонстрируется участием уборки сердце доноров и ее последующей имплантации в мышь-реципиента. Донорское сердце собирают сразу же после на месте перфузии с холодной гепаринизированным физиологическим раствором и перерезки восходящей аорты и легочной артерии. Операция получатель включает получение брюшной аорты и нижней полой вены (НПВ), а затемконца в сторону анастомоза донора аорты с аорты реципиента с помощью одного хода 10-0 microsuture и аналогичный анастомоза в легочной артерии донора с реципиентом IVC. После операции животных вводили 0,6 мл физиологического раствора подкожно и оставляли для восстановления на 37 ° C грелку. Результаты 227 мыши пересадок сердца суммируются с вероятностью успеха в 48 часов в 86,8%. Из 13,2% отказов в течение 48 часов, 5 (2,2%) испытали паралич задних конечностей, 10 (4,4%) имели не-бьющееся сердце из-за привить ишемического повреждения и / или тромбоза, а 15 (6,6%) умерли в течение 48 часов .

Введение

Животные модели трансплантации органов может дать ценную информацию для улучшения лечения клинических пациентов после трансплантации. Мышиные модели особенно полезны для изучения иммунной механизм отторжения трансплантата орган или принятии в связи с широким диапазоном генетически модифицированных мышей и реагентов, специфичных для мышей, которые не доступны для других животных моделях 1-3. Проблема с мышиных моделях трансплантации является небольшой размер доноров и реципиентов, которая требует значительных технических навыков для достижения удовлетворительных результатов.

Методика была впервые описана для гетеротопической трансплантации сердца у крыс 4, который впоследствии был адаптированных для сердца трансплантации мыши на Корри и др. 5. Эта техника связана с подготовкой проекта получателя до операции донора и не перфузии донорского сердца, оба из которых, вероятно, компромисс выживание пересаженного сердца или тполучатель он. Процедура была широко используются в качестве первоначально описано изучить механизмы отторжения трансплантата и толерантности 6-8. Другие приспособились оригинальный крысы процедуру по пересадке сердца в Оно и Линдси для пересадки сердца у мышей 9,10. Совсем недавно, методика была опубликована для трансплантации сердца мыши, что преодолел некоторые из проблем, связанных с методом Корри и др. 11. Протокол, описанный здесь включает в себя наши модификации, основанные на методе Mottram и др. 12, которые включают: перфузии на месте с холодной гепаринизированной физиологического раствора сразу же после торакотомии и выполнения операции доноров до операции получателя, чтобы минимизировать время работы получателя. Кроме того, мы используем небольшие атравматичные зажимы сосудов вместо 6-0 шелковые галстуки. Хотя зажимы судов имеют тот недостаток, принимая больше места они легче контролировать, чем связей, которые не должны быть слишком туго или свободнои менее проста удалить, чем зажимов. Наша методика использует один ходовой шва для анастомоза сосудов, хотя в начальной ступени обучения альтернативы можно использовать пребывание швов на проксимальной и дистальной углах, чтобы обеспечить равномерность швов и, таким образом проходимость анастомоза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

До начала экспериментов, получить одобрение Комитета по этике по уходу за животными соответствующего учреждения на планируемый экспериментов. Поддерживать мышей в соответствии с требованиями вашей организации. Следующий протокол был одобрен Сиднейского университета и Королевского больница Принца Альфреда комитетов.

Перед началом операции, все инструменты должны быть тщательно вымыть и стерилизовать путем замачивания в 80%-ном этаноле. Некоторые учебные заведения предусматривают автоклавирование однако это может привести к повреждению мелких микрохирургических инструментов в долгосрочной перспективе. Где можно использовать стерильные одноразовые оборудование.

1. Обезболивание

  1. Обезболить мышь изофлураном в герметичном контейнере затем поместить его на спине на операционном борту, быстро подключения обезболивающий носовой обтекатель. Достаточность Тест анестезии, зажимая заднюю ногу, чтобы обеспечить нет рефлекс.
  2. Бритье кожи с хирургическим скальпелем истерилизовать с помощью 80% этанола. Кроме того, 2% раствор хлоргексидина в 70% изопропилового спирта может быть использован для стерилизации кожи. Во время вводного наркоза изофлюран концентрация составляет 3%, но уменьшить это до 1-1,5% на техническое обслуживание. Внести незначительные коррективы в этой концентрации поддерживать регулярные дыхание и сердечный ритм. Поддерживать температуру животного на грелку.

2. Эксплуатация Донор

  1. Сделать торакотомии подвергать сердца и сосудов путем разрезания грудной клетки через обеих сторон грудной клетки грудной от края до подмышечной впадины с последующим поперечным разрезом на уровне мечевидного отростка с образованием стенки клапан груди. Поднимите этот лоскут до около голову и прикрепите его к операционной борту. Оторвите перикарда подвергать сердце и сосуды.
  2. Поднимите нижнюю полую вену пинцетом в одной руке и с другой Inject 1 мл холодной гепаринизированная солевой проксимального к сердцу через IVC, затем положить зажим небольшой артерии на ВАХ для профилактикит поток перфузии раствора обратно через игольное отверстие.
  3. Использование марлю и ватным тампоном, убрать сердце вниз, чтобы разоблачить восходящей аорты и легочной артерии. Передайте одно лезвие из пары microscissors через канал (поперечная пазухи) задней к расслоению аорты и легочной артерии и сократить аорту и легочную артерию вместе насколько дистально, насколько это возможно, чтобы обеспечить достаточную длину для анастомоза.
  4. Галстук и разделить IVC, прямо верхней полой вены (ВПВ), слева SVC и легочные вены с помощью 6-0 шелковой нити. Свяжите IVC и правую SVC отдельно затем поместить в одном потоке кзади от сердца, чтобы окружить левую SVC вместе с легочных вен и связать его. Урожай сердце от донорской путем разрезания сосудов дистальнее связей, а затем сохранить его в холодном стерильном физиологическом растворе при 4 ° С до трансплантации. Это приводит к смерти донора путем обескровливания.

3. Получатель Операция

  1. Обезболитьполучатель, как указано выше (раздел 1). Тщательно брить живот, чтобы избежать раздражения, а затем сделать лапаротомии путем срединный разрез от лобка к мечевидного отростка и убрать с помощью скрепки наклонился, чтобы сформировать преднатяжителями. Оберните кишечника в теплой стерильного физиологического раствора пропитанной марли и убрать в верхнем правом углу живота.
  2. Чтобы разоблачить инфра-почечные аорты и IVC, освободить комплекте сегменты аорты и нижней полой вены с левой почечной артерии и вены до подвздошной бифуркации путем деления их от поясничных сосудов с помощью прижигания устройства. Следите за тем, прижигание является при правильной температуре и использовать в течение достаточного времени, чтобы разделить и запечатать концы сосудов.
  3. Применить небольшие атравматичные зажимы сосудов к аорте и сегментов IVC дистально и проксимально. Сделайте надрез в передней стенке аорты, сначала проколов отверстие с 30 G иглы; затем вырезать надрез вертикально microscissors в соответствии с размером донорской аорты. Промойте аорты просвет с гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить блOOD сгустки.
  4. Доведите донорского сердца к месту получателя, покрытой марлей, смоченной в холодной солевой раствор и поместить его с правой стороны живота. Убедитесь, что донор аорта расположена рядом с разреза на аорте получателя и донорского легочной артерии, расположенной рядом с получателя IVC.
  5. не анастомозируют с конца в сторону донора аорты к аорте получателя требует запуска 10-0 нейлоновые швы, начиная от проксимального углу и наложения швов вдоль левой стороны сначала до достижения дистального угол, на какой стадии животное поворачивается на 180 °. Осторожно переместить донорского сердца в левой части брюшной полости, чтобы обнажить правую сторону аорты и продолжают наложения швов через правую сторону стенки аорты от дистального конца до проксимального конца. Перед закрытием аортального анастомоза, мягко очистить полость с гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить сгусток и воздуха.
  6. Анастомозирует донорской легочной артерии (ПА) из конца в сторону с получателем IVC. Сделайте надрез верски с microscissors в передней стенке нижней полой вены на узле в соответствии с анастомоза артерии. Анастомозировать донора Па до получателя IVC с проточной 10-0 нейлоновые швы, начиная с дистального конца левой стенке внутри просвета полой вены. После достижения проксимальный конец, по-прежнему швов вдоль передней правой боковой стенки до дистального конца для завершения анастомоза. Перед закрытием анастомоза, мягко очистить полость для удаления сгустков и воздух.
  7. Перед выпуском зажимы сосуда, место куски Gelfoam вокруг анастомоза сайтов и нежный давление ватным аппликатором, пока гемостаз не будет достигнута. В момент реваскуляризации, выпуск дистальный зажим сначала, а затем проксимального зажима.
  8. После реваскуляризации, нанесите теплый солевой раствор при температуре 37 ° С до трансплантата внешне, чтобы помочь ее восстановлению. Трансплантат обычно начинается немедленно фибрилляции и возвращается спонтанно синусового ритма в течение нескольких минут. Введите 0,6 мл теплойсолевой подкожно для поддержания гидратации получателя. Введите бупренорфин подкожно для обезболивания до завершения операции
  9. Закройте брюшную рану с одним 5-0 рассасывающиеся проточной шва для обоих слоев. Начните, заполнив внутренний слой и продолжать идти по коже.

4. Восстановление и трансплантата Мониторинг

  1. Введите ампициллин для профилактики инфекции и поместите получателя на грелку при 37 ° С для восстановления. Большинство животных быстро восстановиться и, как правило, пить и часто едят в пределах 3 часов. Если мышь показывает признаки бедствия, внимательно изучать, чтобы определить причину. Если нет очевидной причины, лечения с бупренорфина и внимательно следить. Проконсультируйтесь с ветеринаром, если симптомы тяжелые или сохраняются более 8 часов и рассмотреть эвтаназию. Если необходимо, укажите продолжая 12 почасовые инъекции бупренорфина до исчезновения симптомов. Если мышь показывает признаки бедствия после 8 часов, дать Продолжая 12почасовые инъекции бупренорфина, пока они не решить. Обратитесь к ветеринару, если симптомы не проходят в течение более чем 48 часов и усыпить, если это необходимо.
  2. Монитор трансплантата сердцебиение прямым пальпации живота и записывать на прочность ударом как + + + + для здорового трансплантата к + для слабой доли в связи с передовой отторжения и - как не избиение из-за полного отказа от трансплантата. Монитор мышей ежедневно в течение первых 10 дней, затем 3 раза в неделю в течение всего срока эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После начального периода обучения, были проанализированы 227 случаев мыши гетеротопической трансплантации сердца в нашей группе. Шанс успеха в первые 24 часа было 90,3% и на 48 часов это было 86,8%. Из 30 (13,2%) отказов в течение 48 часов, 5 (2,2%) испытали паралич задних конечностей и должен был быть умерщвлены, 10 (4,4%) имели не-бьющееся сердце из-за травмы трансплантат ишемии и / или тромбоза, а 15 (6,6%) умерли в течение 48 часов. Некоторые экспериментальные привитые остатки показаны в таблице 1 с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Трансплантация сердца мышь является сложной микрохирургической метод, который требует значительного хирургического умение мастера. Наиболее сложным аспектом является малый диаметр сосудов. Кроме того, необходимо, чтобы ограничить время работы получателя и кровотечение. Техника для сердца трансплантации мыши была впервые описана Корри и соавт. в 1973 году и впоследствии Mottram др. 12. Наши модификации включают следующие моменты. Во-первых, непосредственное перфузии донорского сердца с холодн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным научно-исследовательским советом здравоохранения и медицинской (NHMRC) Австралии Project Grant 1029205, по Microsearch Фонда Австралии, и по медицинским исследованиям Фонда Myee Кодрингтон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Операционный микроскоп Leica, Хеербругг, ШвейцарияM651 Анестетик с10-25-кратным увеличением
 Vet Quip Pty Ltd, Сидней, АвстралияVett3Способен доставлять смесь изофлурана и кислорода в воздух 
Операционная доска Поставщик хозяйственного магазина или офисаПлотная пробка или синтетика способная принимать штифты
Гепаринизированный физиологический раствор (5 Ед/мл, 4 град; C)Pfizer, СШАFW25В шприце 1 мл с иглой 23 г на льду
Нормальный физиологический раствор (37° C)AstraZeneca Pty Ltd, Австралия4538В шприце 1 мл с иглой 23 G на теплой прокладке
Шовные материалы 10-нейлон, 5-0 VicrylEthicon, Inc. NJ, США2870G/J421H
бупренорфин (0,05 мг/кг в 0,1 мл физиологического раствора)Reckitt Benckiser, Сидней, АвстралияВ шприце 1 мл с иглой 23 G на льду
Ампциллин (5 мг/кг в 0,1 мл физиологического раствора)Осина, Сидней, АвстралияВ шприце 1 мл с иглой 23 г на льду
Gel FoamPharmacia & Upjohn Co. США801289304Нарезать на мелкие кусочки
Высокотемпературное устройство для прижиганияMedtronic, США8444000
Грелка/Right TempKent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790
Инструменты для микрохирургии: Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,   
МикроиглодержателиШанхай, КитайWT2020
Микроножницы        "                  "WT1020
Микрощипцы (прямой наконечник)        "                  "WA3010
Микрощипцы (изогнутый наконечник)        "                  "WA3020
Зажимы для микромоскитов (1 пара)        "                  "W40350
Микрососуды атравматические (1 пара)        "                  "W40130/W40150

Ссылки

  1. Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
  2. Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
  3. Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
  4. Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
  5. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
  6. Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
  7. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
  8. Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
  9. Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
  10. Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
  11. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic Heart Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. , (2007).
  12. Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи