Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51433

⸱

12 мая 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiological Genomics, Institute of Physiology, Ludwig Maximilians University Munich, 2Tumor Biology Lab, Neurosurgical Clinic, Ludwig-Maximilians University Munich, 3Institut für Biochemie, Emil-Fischer-Zentrum, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 4Institute of Physiological Chemistry and Focus Program Translational Neuroscience, Johannes Gutenberg University Mainz

В этой статье

Краткое содержание

Ориентация мозга резидентом клетки для прямого Lineage-перепрограммирования открывает новые перспективы для ремонта мозга. Здесь мы опишем протокол о том, как подготовить культур, обогащенных для мозга резидентом перицитами от взрослого головного мозга человека и преобразовать их в индуцированные нейронов ретровируса-опосредованной экспрессии факторов транскрипции Sox2 и Ascl1.

Аннотация

Прямая линия-перепрограммирование не-нервных клеток в индуцированные нейронов (INS) может дать ответ на молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенез и включить новые стратегии для моделирования в пробирке или ремонта больной мозг. Определение мозга-нерезидентные нейронные типы клеток, поддающиеся прямого преобразования в INS может позволить для запуска такой подход на месте, то есть в течение поврежденной ткани головного мозга. Здесь мы опишем протокол, разработанный в попытке идентификации клеток, полученных из взрослого человеческого мозга, что выполнить это помещение. Этот протокол включает в себя: (1) культивирование клеток человека из коры головного мозга, полученных из взрослых биопсии головного мозга человека; (2) расширение в пробирке (приблизительно требуя 2-4 недели) и характеристика культуры по иммуноцитохимии и проточной цитометрии; (3) обогащение с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) с использованием анти-PDGF рецептор-β и анти-CD146 антитела;(4) ретровирус-опосредованного трансдукции с нейрогенной факторов транскрипции Sox2 и ascl1; (5) и, наконец, характеристика полученных перицитами полученных индуцированных нейронов (PdiNs) по иммуноцитохимии (14 дней до 8 недель после ретровирусную трансдукции). На данном этапе, модули могут быть проверены их электрических свойств по записи патч-зажим. Этот протокол обеспечивает высокую воспроизводимость порядок в пробирке клонов преобразования мозга резидентом перицитами на функциональные человека INS.

Введение

В отличие от перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые в свою очередь, наделенных множеством дифференциальным потенциалом, прямой перепрограммирование стремится к прямой конвертации одного конкретного типа клеток в другой. В отношении их применения в контексте моделирования болезней и потенциальных клеточной терапии, оба подхода перепрограммирования имеют свои преимущества и недостатки. Перепрограммирование в ИПСК (I) обеспечивает практически бесконечный источник клеток; (II) позволяет генной инженерии; (III) наделяет почти неограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, основные недостатки ИПСК влекут за собой риск туморогенность из недифференцированных клеток (образование тератомы в естественных условиях) и необходимости экс естественных условиях выращивания и последующей трансплантации, если эти клетки будут использоваться для клеточной терапии. С другой стороны, линия прямой-перепрограммирование ограничена нижней выход целевого клетокчто коррелирует непосредственно с количеством целевых клеток исходной популяции, но обладает тем преимуществом, что Lineage-перепрограммировать клетки-видимому, не обладают не онкогенного риска после трансплантации 1,2; Кроме того, прямое перепрограммирование даже может быть достигнуто на месте, то есть внутри органа, где эти клетки потребовалось бы, таким образом избегая необходимости трансплантации.

Имея это в виду, наша лаборатория проводит возможность клон-перепрограммирования мозга резидентом клеток в INS в качестве нового подхода к основе клеток терапии нейродегенеративных заболеваний. Мозг-резидентом клетки, которые потенциально могут быть рассмотрены как клеточных мишеней для Lineage-перепрограммирования включают различные типы макроглии (астроциты, NG2 клеток и олигодендроцитов), микроглии и микрососудов связанных клеток (эндотелиальных клеток и перицитов). Мы всесторонне изучают в пробирке перепрограммирования потенциал астроглии головного кортекс раннего послеродового мышей 3-5. В поисках же подходящих источников клеток для прямого Lineage-перепрограммирования во взрослом мозге человека, мы столкнулись с клеточной популяции, которые могут быть успешно перепрограммировать в входы и выставочных признаков перицитами. Здесь мы описываем протокол, как собрать эти клетки от взрослых биопсии головного мозга человека, расширить и обогатить эти клетки в пробирке, и, наконец, успешно перепрограммировать значительную часть этих расширенных в пробирке клеток (в диапазоне 25-30%) в дюймов Перепрограммирование может быть достигнуто путем одновременного опосредованного ретровирусом совместной экспрессии двух факторов транскрипции, Sox2 и ascl1. Эти PdiNs были найдены приобрести способность повторяющиеся потенциала действия стрельбы и служить синаптические цели для других нейронов с указанием их способность интеграции в нейронных сетях. Наш протокол обеспечивает простой процедуры для изоляции и рода превращения взрослых перицитами мозга человека в INS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Изоляция и культивирование мозг взрослого человека клеток

Опыты с человеческую ткань должна быть выполнена в соответствии со всеми соответствующими правительственными и институциональных правил, касающихся использования человеческого материала для исследовательских целей. Настоящий протокол был разработан в соответствии с одобрения этического комитета медицинского факультета Людвига-Максимилиана Мюнхен и письменного информированного согласия от всех пациентов.

Этот протокол подготовки культур взрослого головного мозга человека была создана с использованием образца пациентов обоих полов, страдающих от височной эпилепсии лепестка или других глубинных нетравматических, доброкачественных поражений. Ткань получена из хирургической комнате, состоящей исключительно канал доступа к поражению мозга и, следовательно, считается здоровым. Возрастной диапазон пациентов составлял 19-70 лет.

  1. Подготовка среды для выращивания, добавив тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки(FCS) в DMEM с высоким содержанием глюкозы глютамаксом, чтобы получить конечную концентрацию 20% FCS. Добавить 5 мл пенициллина / стрептомицина в общей сложности 500 мл среды роста. Выполните это и все последующие шаги, требующие стерильных условий культивирования в соответствующем ламинаре.
  2. Хранить взрослого человека биопсию мозга, полученного из хирургической комнате в Хэнкса сбалансированном солевом растворе с CaCl 2 и MgCl 2 (HBSS) среде, включающей HEPES (10 мМ конечная концентрация) на льду до обработки. Начните обработку как можно скорее.
  3. Для начала диссоциации на отдельные клетки, передавать ткани в 65 мм чашку Петри и пропустить через мясорубку на мелкие кусочки с помощью двух стерильные скальпели одноразовые. Для ферментативного расщепления использовать 3-6 мл TrypLE в 15 мл коническую пробирку и инкубируют в течение 15-30 мин при 37 ° С на водяной бане.
  4. Добавить 1 объем нагретого ростовой среде для облегчения диссоциации и осторожно растирают раствор, содержащий кусочки ткани вверх и вниз сначала с помощью5 мл одноразовые пипетки, а затем не используя стекло пипетки Пастера до гомогенизации клеточной суспензии. Как правило, некоторые части остаточной ткани, в основном состоящие из белого вещества, останется в суспензии.
  5. Спин вниз на 157 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в соответствующем количестве ростовой среде (10 мл на одно без покрытия T75 колбу культуры). Используйте одну T75 культуры колбу для биопсии 5-10 мм в диаметре в размере и экстраполировать это в случае больших образцов.
  6. Поместите клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2 и 5% O 2.
  7. Заменить половина среды каждые 3-4 дня, пока клетки не достигли слияния. Это обычно занимает до двух недель (именуемые проход 0 [P0]).

В Расширение 2. Пробирке и характеристика мозг взрослого человека клеток

  1. В расширении пробирке:
    1. Аспирируйте культуральную среду и промывают фосфатно-солевом буфере (PBS), выдерживали при комнатной тemperature, перед добавлением 3 мл TrypLE.
    2. Инкубируют при 37 ° С в течение 5-10 мин, пока большинство клеток не отсоединена. Слегка постучите колбы для облегчения снятия клеток; Следующий добавлением 3 объемов ростовой среды, передача клеток в 15 мл коническую пробирку и спин вниз в 157 х г в течение 5 мин и ресуспендирования клеток в соответствующем количестве ростовой среды.
    3. Прохождение клетки в соотношении 1:3 для оптимального выхода в новые T75 клеточных культур колбах.
      Примечание: Мы никогда пассировать эти клетки пока P5 без каких-либо признаков снижения эффективности перепрограммирования. В то время как при Р0 культура содержит значительную долю эндотелиальных клеток (по оценке выражения CD34), на последующих проходах их число становится незначительным.
  2. Характеристика взрослых культур мозга человека:
    1. Иммуноцитохимия:
      1. Для характеризации клеток, семян ~ 60000 клеток на поли-D-лизина покрытием стеклянной крышкой скользит в 500 мкл свежей Mediu ростм тканевой культуры в 24-луночных планшетах и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 и 5% O 2.
      2. Для иммуноцитохимического анализа культивированных человеческих клеток мозга удалить среды и промыть 3 раза с 1 мл PBS.
      3. Исправить клеток путем добавления 500 мкл 4% параформальдегида в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре.
      4. Передача стекло крышка скользит в соответствующей увлажненной камере окрашивания и блок с 80 мкл PBS, содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре.
      5. Добавить первичных антител разбавленные в том же растворе (на коэффициенты разбавления см. таблицу конкретных реагентов и оборудования) и инкубируют в течение ночи при 4 ° С или 1 ч при комнатной температуре.
        Примечание: Значительная но разной фракции клеток на этом этапе культивирования являются иммунореактивны для тромбоцитарных β рецептора фактора роста (PDGFRβ), кластер дифференциации 146 (CD146), NG2 хондроитин сульфат Proteoгликана, и гладкой актина мышцы (SMA), то есть маркеры, характерные для микрососудов связанных перицитами. Лишь меньшинство (<1%) выражают астроглиальных маркеры глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и S100β. Кроме того, на этой стадии культура должна быть лишена любых клеток, экспрессирующих нейронов маркер βIII-тубулина. Использование нескольких комбинаций первичных антител для совместного маркировки различных маркеров. Дальнейшее подтверждение экспрессии глиальных, нейронных, эндотелиальных и перицитов маркеров может быть получена путем обратной транскрипции и количественного реального времени полимеразной цепной реакции (не описанной в данном протоколе).
      6. После инкубации с первичными антителами мыть три раза 1 мл PBS и добавить соответствующие вторичные антитела (в соответствующих разведений) к окрашивающим раствором и инкубировать 1 час при комнатной температуре в темноте. Промыть клетки 3x с PBS. Если необходимо, перед установкой включают окрашивание DAPI с в течение 5 мин при комнатнойтемпература.
      7. Используйте antifading монтажную среду и анализировать покровные стекла с использованием эпифлюорисцентной микроскопа или конфокальной микроскопии.
    2. Проточной цитометрии:
      1. Для анализа поверхности маркера экспрессии с помощью проточной цитометрии, роста клеток до слияния в непокрытой T25 или T75 клеточных культур колбах.
      2. Отделить клетки с помощью TrypLE, как описано выше, и ресуспендируют в окрашивающего раствора, состоящего из PBS + 0,5% БСА. За реакцией окрашивания, ресуспендируйте 100,000-200,000 клеток в 100 мкл красящим раствором. Подготовка одиночные реакции окрашивания на антитела, используемые (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, соответствующие антитела контрольного изотипа).
      3. Добавить флуорохромом-конъюгированного антитела к каждому раствору окрашивания (для разведения см. таблицу конкретных реагентов и оборудования) непосредственно в суспензии клеток и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин в темноте.
      4. Промыть клетки три раза 500 мкл PBS и спин вниз между каждойстиральная шаг в 157 мкг в течение 5 мин.
      5. Ресуспендируют осадок клеток в 0,5-1 мл раствора окрашивания и передачи клеток через клеточный фильтр (70 мкм) в FACS труб. Защитите образца от воздействия света.
      6. Образцы Vortex до размещения их в приборе FACS.
      7. Для анализа живых клеток и исключить мусора и клеточных агрегатов, ворота для FSC-A и SSC-A. Сотовые Duplets специально закрытый путем FSC-А и FSC-W. Чтобы определить правильные условия литниковые для маркеров клеточной поверхности, установленных ворота с контролем антител изотипу конъюгированного с соответствующей флуорохромом. Тогда определить долю клеток антиген-антитело.

3. Обогащение перицитов клеток, полученных с помощью флуоресцентной Активированный сортировки клеток

  1. Очищают перицитов клеточной популяции (ресуспендировали в ростовой среде) до трансдукции через СУИМ сортировки с использованием сопла 70 мкм. Используйте CD34-APC в сочетании с CD140b-PE и CD146-FITC, чтобы выбрать для перицитами. Сортировать по CD34-негативных, CD140b-и CD146-позитивных клеток.
  2. Сбор отсортированных клеток в среде для роста и пластины на поли-D-лизина, покрытые защитным стеклом скользит в 24-луночных культуральных планшетах и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 и 5% O 2.
  3. 48 ч после сортировки заменить среды свежей средой роста и выполнять трансдукции, как описано в Протоколе 4.

4. Ретровирусные трансдукция перицитов клеток, полученных и Перепрограммирование в индуцированные нейронов

Примечание: Обратитесь к местным требованиям биобезопасности при обращении с ретровирусные частицы. В Германии использование ретровирусов, используемых здесь требуют уровень биобезопасности 2. Для производства ретровирусных частиц относятся к протоколу 6. Для ретровирусных конструкций, используемых для перепрограммирования, обратитесь к Karow и соавт. (2012). Ретровирусы были pseudotyped с VSV-G (везикулярного стоматита вирус-гликобелок) 5. Для производства см. Гаврилеску др. 6.

  1. 24 ч до ретровирусный трансдукции семенных ~ 60000 клеток на поли-D-лизина, покрытые защитным стеклом скользит в 500 мкл свежей среды для роста в 24-луночных культуральных пластинах ткани и инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 и 5% O 2 .
  2. На следующий день, замените питательную среду с 500 мкл свежей, предварительно нагретой среде роста и добавить 1 мкл соответствующих сосредоточенных надосадочную жидкость, содержащую ретровирусных частиц (pCAG-IRES-DsRed для контроля, особенно во время установления протокол в лаборатории), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
  3. Через день, удалить среды в том числе вирусных частиц из клеток и добавляют 1 мл свежих, предварительно нагретой B27-дифференциации среды, состоящий из 49 мл DMEM высоким содержанием глюкозы с Glutamax и 1 мл B27 сыворотки добавки. Поддерживать клетки в культуре при 37 ° С в 5% СО 2 и 5% O 2 в течение 4-8 недель без изменения среды, как повторяющиеся изменения средних стать вредными, как INS созреть.

5. Характеристика индуцированной нейронов по иммуноцитохимии

  1. Для определения клеточного идентичность трансдуцированных клеток, в частности, чтобы продемонстрировать приобретение фенотипа нейронов, выполнять иммуноцитохимии против антигенов нейронов, таких как BIII-тубулина, МАР2 и NeuN (на антитела и их соответствующих разведений, см. таблицу конкретных реагентов и оборудование; такую ​​же процедуру, как указано в 2.2.1).
  2. Для улучшения созревание PdiNs, со-культуры этих клеток нейронов, полученных из E14 мыши коры головного мозга. С этой целью, рассекают кору головного мозга и отделить ткань механически с камином-полированного стекла пипетки Пастера. Добавить 10,000-50,000 мышиных нейронов в культурах перицитами клеток, полученных 2-3 недель после трансдукции Sox2 и ascl1-кодирования реtroviruses и продолжают культивирование. Трансдуцированных клеток можно отличить от мышиных нейронов их репортер (GFP) и DsRed экспрессии, либо живой эпифлуоресцентной или после иммуноцитохимии для GFP и DsRed.
  3. Для оценки формирование синапсов на PdiNs по мышиных нейронов, выполните иммуноцитохимии против везикулярного рецепторов нейромедиаторов, таких как везикулярного глутаматного транспортера 1 (vGluT1).
  4. Зонд трансдуцированных клеток для их электрических свойств (т.е. способности генерировать потенциалы действия) и установления функциональных синапсов по патч-зажим электрофизиологии. Подробную информацию о процедуре см. Генрих соавт. (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первым результатом этого протокола после успешного создания культуры от образце человеческой взрослого коры головного мозга состоит в идентификации клеточного состава культуре. Иммуноцитохимия для специфических белков типа клеток показывает значительную степень гетерогенности между культурами, полученных из образца разных пациентов (фиг. 1а). Как количественно с помощью проточной цитометрии всегда существует значительная часть клеток, которые экспрессируют PDGFRβ (в среднем ~ 75%, от 30 до до 99%); друг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол описывает расширение в пробирке и обогащение перицитами клеток, полученных следующий изоляции от взрослого головного мозга человека и последующее преобразование в INS по ретровируса-опосредованной экспрессии нейрогенной транскрипционных факторов Sox2 и Ascl1. Такой протокол обеспечивает экспериментальную в пробирке системы для изучения Lineage-преобразование мозга резидентом клеток в нейроны и потенциально также глии, с целью в виду, чтобы в конечном итоге перевести эту прямой подход...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны доктору Магдалена Гетц для ее ввода в процессе разработки этого протокола. Мы благодарим доктора Marius Wernig (Стэнфордский университет) за щедрое предоставляя нам последовательности Sox2 кодирования. Мы также очень благодарны доктору Александра Lepier для производства вируса. Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) и BMBF (01GN1009A) до BB, и Баварским государственным министерством наук, исследований и искусства в МК и BBCs получил финансирование от двухнационального SYSTHER- INREMOS Виртуальный институт (немецкий и словенский Федеральные министерства образования и научных исследований) и DFG (SFB 824).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
anti-CD140b-PEBD Biosciences558821использовать 1:100
anti-CD146-FITCAbD SerotecMCA2141FTиспользовать 1:100
anti-CD13-FITCAbD SerotecMVA1270A488Tиспользовать 1:100
anti-CD34-APCBD Biosciences560940использовать 1:100
anti-PDGFRβCell Signaling3169Sиспользование 1:200
анти-CD146AbcamAb75769использование 1:400
анти-NG2MilliporeAB5320использование 1:400
анти-SMASigma-AldrichA2547использование 1:400
анти-&бета; III-тубулинSigma-AldrichT8660использовать 1:400
анти-MAP2Sigma-AldrichM4403использовать 1:200
анти-GFAPSigma-AldrichG3893использовать 1:600
анти-GFPAves LabsGFP 10-20использовать 1:1,000
анти-RFPChromotek5F8использовать 1:500
анти-S100&бета;Sigma-AldrichS2532использовать 1:300
анти-NeuNMilliporeMAB377использовать 1:200
анти-ГАМКSigma-AldrichA2052использовать 1:500
анти-кальретининMilliporeAB5054использовать 1:500
анти-vGluT1SYnaptic SYstems135511использовать 1:1,000
Rat IgG1 контроль изотипа FITCAbD Serotec11-4301-81использование 1:100
Контроль изотипа IgG1 крысы PEAbD Serotec12-4301-81использование 1:100
Контроль изотипа IgG1 крысы APCAbD Serotec17-4301-81использование 1:100
TrypLEInvitrogen12605-010
DMEM, высокий уровень глюкозы, GlutaMAXInvitrogen61965
B27 бессывороточная добавкаInvitrogen
сыворотке крови плода теленкаИнвитроген10106-169проводят тепловую инактивацию путем инкубации при 56°С; C в течение 30 мин
Пенициллин-стрептомицинInvitrogen15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Invitrogen24020-091
PBS Дульбекко без CaCl2 и MgCl2 (D-PBS, 1x)Invitrogen14190
HEPESSigma-AldrichH3375
Poly-D-лизин гидробромид (PDL)Sigma-AldrichP0899
PFA (параформальдегид)Sigma-AldrichP1648
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA9418
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-фенилиндол) дилактатSigma-Aldrich042M4005
Aqua-Poly/ MountPolysciences18606-20
Трубы полипропиленовые круглодонные BD Biosciences352063
Полистирольные трубки с круглым дном и крышкой из фильтра-фильтра BD Biosciences352235
24-луночные планшетыOrange Scientific5530305
75 см<суп>2 колбы для культурGreiner Bio-One658175
25 см<суп>2 колбы для культурGreiner Bio-One690175
одноразовые пипетки 10 млSarstedt86.1254.001
Стеклопастер пипетки (150 мм)FisherbrandFB50251
Стеклянные покровные стекла диаметром 12 ммMenzelCB00120RA1
Хирургические одноразовые скальпели Б. Браун5518083
Чашки для культивирования тканей Greiner Bio-One633180
Конические пробирки 15 млBD Biosciences352095
Ламинарный проточный колпак
Центрифуга и поворотный ротор с адаптерами для пробирок 15 мл и 50 млHettich Lab Technology1406
Проточная цитометрия клеточный сортировщик: FACSAria l с программным обеспечением FACSDiva BD Biosciences
Инкубатор гумифицированных клеточных культурEppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 ° C
FACSжидкость с низкой оболочкой BD Biosciences342003
Эпифлуоресцентный микроскоп BX61Olympus
Конфокальный микроскоп LSM710Zeiss
17504044

Ссылки

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PDGFRCD146
Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.