Простой протокол для определения нейтрального содержания жиров водорослевых клеток, используя процедуру Нил красные пятна описывается. Это экономия времени техника предлагает альтернативу традиционным гравиметрических основе липидов протоколов количественного. Она была разработана для конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Простой и быстрый протокол для измерения нейтральных липидов в клетках водорослей с помощью флуоресцентной
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Водоросли считаются превосходными кандидатами для возобновляемых источников топлива из-за их природных возможностей хранения липидов. Прочная мониторинг водорослей процессов брожения и скрининга новых богатых нефтью штаммов требуется быстрый и надежный протокол для определения внутриклеточного содержания липидов. Существующие методы полагаться в значительной степени от гравиметрических методов определения содержания масла, методы, разработанные десятилетий назад, что занимает много времени и требует больших объемов образцов. В данной работе, Нил красный, флуоресцентный краситель, который был использован для идентификации присутствия липидов органов в многочисленных видов организмов, включена в простой, быстрой и надежной протокола для измерения нейтрального содержания жиров Auxenochlorella protothecoides, зеленый водоросли. Метод использует этанол, относительно мягкий растворитель, чтобы проницаемыми клеточную мембрану перед окрашиванием и 96 также микро-пластина для увеличения потенциала образца в процессе измерений интенсивности флуоресценции. Это был дизайнред с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических. Ранее высушенные образцы или живые образцы из растущей культуры могут быть использованы в анализе.
Введение
Благодаря своей способности хранить липидов тела при определенных условиях стресса, водоросли получили большое внимание в последние годы в качестве потенциального источника возобновляемой топливной 1,2. Нейтральные липиды могут составлять более 60% от сухого веса клеток при соответствующих условиях роста 3. Тем не менее, промышленность не есть простой, чистый, быстрый и надежный стандартный протокол для количественного содержания жиров водорослевых клеток для того, чтобы должным образом контролировать работу Биопроцесс, анализа культур, и на экране, новых штаммов.
Гравиметрический метод Блай-Дайер разработан около 50....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение сухой биомассы водорослей для использования в качестве стандартов для флуоресценции чтений
- Удаление объем пробы из растущей культуры водорослей, который будет обеспечивать, по меньшей мере 200 мг сухой биомассы, 400-600 мг является предпочтительным.
- Центрифуга образца при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х г. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с равным объемом фосфатного буфера, сформулированной в то же, что и рН питательной среды.
- Повторите шаг 1.2 для в общей сложности 3 стадий промывки.
- Повторное приостановить осадок в деионизированной воды и трансфер в предварительно взвешенную весят б....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представительства клетки водорослей окрашенные Нил Красного красителя изображены на рисунке 1. Части А и В из рис. 1 отображения изображений А. protothecoides выросли в избытке азота, что приводит к очень низким накоплением внутриклеточного окисления липидов. В части С и D, образцов А. protothecoides выращенные под ограничения азота показаны. При освещении передачи, липидные тела клетки могут быть визу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Водоросли, используемый в стандартной кривой должен быть того же вида культивируют в тех же экспериментальных условиях, как и измеряется. Существенные изменения в составе средств массовой информации, техники выращивания, и протокола окрашивания может повлиять на интенсивность чтения флуоресценции. Экстракции гексаном (описано в разделах 1 и 2) был использован для определения нейтрального содержания липидов образцов, используемых в стандартной кривой. Для точного измерения интенсивности флуоресценции, все образцы должны .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить естественных и технических наук исследовательский совет Канады за предоставление финансовой поддержки для этого проекта.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сухая масса | |||
| 25 мл одноразовые пипетки | Fisher | 13-676-10K | |
| Лампочка для пипеток | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 мл Пробирки для центрифуги Nalgene Teflon | Fisher | 05-562-16A | Тефлон необходим для гексана |
| Весить посуду (полипропилен) | Fisher | 2-202B | |
| микроцентрифуга 1,5 мл пробирки | Fisher | 05-408-129 | |
| Центрифуга | Sorvall | RC6plus | |
| Сушильная печь (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Пробирки для хранения | Fisher | 0337-4 | |
| Настольная микроцентрифуга (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Гравиметрическое количественное определение | |||
| Фарфоровая ступка (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Фарфоровый пестик (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 мл Центрифужные трубки (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Можно также использовать стеклянные трубки |
| Стеклянные пипетки | Пастера Fisher | 13-678-20C | |
| Алюминиевые весы | Fisher | 08-732-101 | |
| Гексаны | Fisher | H292-4 | |
| Флуориметрическое количественное определение содержания | |||
| Флуоресцентный многолуночный планшетный ридер | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Флуоресцентный ридер программное обеспечение | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 луночный планшет с круглым дном | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Этанол (марка спиртового реагента) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Визуализация Флуоресцентные клетки | |||
| Leica DMRXA2 (или аналог) микроскоп Leica DMRXA2 | |||
| Предметные стекла для микроскопа | Fisher | 12-550-15 | |
| Защитные стекла для микроскопа | Fisher | 12-541B | |
| Камера | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging программное обеспечение | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
Ссылки
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
