Методическая статья

Производство концентрированных, на основе липидов Oxygen микропузырька эмульсий с высокой скоростью сдвига гомогенизации и последовательной концентрации

DOI:

10.3791/51467

⸱

26 мая 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем методы изготовления больших объемов на основе липидов кислорода микропузырьков (Loms), предназначенных для внутривенного введения кислорода с помощью гомогенизации с высокой степенью сдвига и серийный концентрацию.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Газонаполненные микропузырьки были разработаны в качестве ультразвукового контраста и агентов доставки лекарств. Микропузырьки можно получить путем обработки поверхностно-активных веществ с помощью обработки ультразвуком, механическое перемешивание микрожидкостных устройств, или гомогенизации. В последнее время на основе липидов кислорода микропузырьков (Loms) были разработаны, чтобы доставить кислород внутривенно во время скорой медицинской помощи, обращая угрожающие жизни гипоксемии, и предотвращения последующего повреждения органов, остановка сердца и смерть. Мы представляем методы расширения масштабов до производства высоко кислородом микропузырьков с помощью обратной связью гомогенизатора высокого сдвига. Этот процесс может производить 2 л концентрированного модулей LOM (90% по объему) в течение 90 мин. Полученные пузырьки имеют средний диаметр ~ 2 мкм и реологического профиля в соответствии с что крови при разведении до 60% по объему. Эта техника производит Loms в высоком качестве и с высокой чистотой кислорода, предполагая, что этот метод может быть полезен для трансляционных исследовательских лабораторий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микропузырьки, состоящие из белка, полимера и липидных оболочек были разработаны в качестве векторов для доставки лекарств, генной терапии и ультразвуковых контрастных средств 1-5. Поскольку эти терапевтические применения требуют внутрисосудистого микропузырьков настойчивость, такие микропузырьки обычно заполнены инертными, высокой молекулярной массой газов, таких как перфторуглеродов 6, которые имеют низкую растворимость в крови и стабилизации пузырьков 3,4.

В последнее время на основе липидов кислорода микропузырьков (Loms) были разработаны для доставки терапевтических доз кислорода, которые могут сохранить органов-мишеней доставку кислорода и предотвращения нестабильность гемодинамики в периоды обструкции дыхательных путей или гипоксемии 7. Эмульсии, предназначенные для внутривенного введения газа требуют различных конструктивных особенностей, чем те, которые используются для ультразвуковых контрастных агентов или целевой доставки лекарств. Во-первых, потому что тело потребляет большие объемы газообразного кислорода (~ 200 мл / мин), Loms должно быть произведено ивводили в больших масштабах. Это требует, чтобы производственный процесс быть эффективным. Во-вторых, производственный процесс должен быть замкнутым контуром для того, чтобы избежать загрязнения азота через воздействии модулей LOM (которая должна быть заполнена с 100% кислорода) в окружающий воздух. В-третьих, потому что цель модулей LOM является внутривенное подачи газа, газ доля модулей LOM должен быть максимальным, признавая ограничения, налагаемые эмульсии вязкости 7. Наконец, как и в любом внутривенных инъекций, точный контроль над распределением частиц по размерам имеет важное значение для предотвращения микрососудистых обструкции 8.

Есть несколько установленные методы для производства микропузырьков. Обработка ультразвуком высокой интенсивности использует, низкочастотный ультразвук применяется к поверхности раздела воздух-жидкость эмульсии, которая включает поверхностно-активное вещество, такое как амфипатического фосфолипида в присутствии газа свободного пространства для производства микропузырьков 7,9. Этот процесс является управляемым путем изменения ультрачастота звука, мощность и длительность импульса, и в результате распределения по размерам может быть адаптировано для получения микропузырьков определенного распределения по размерам, хотя ультразвуком редко используется в производстве клинически используемых микропузырьков. Объединение является интенсивным механическое перемешивание поверхностно-активного вещества и газа в замкнутой системе, что также трудно расширить для размещения больших объемов 2. Капелька основе микрофлюидики позволяет точно контролировать распределение по размерам микропузырьков 10-13. Хотя традиционно трудно расширить, многоканальный, высокоскоростные микрофлюидики были описаны, которые увеличивают микропузырьков эффективности производства 13. Микропузырьки изготовлены с использованием любого из этих методов может потребовать пост-производство процессы сокращения размера, такие как центробежной фракционирования 14,15 и микропузырьков флотации 16,17.

Другой метод создан для изготовления высокостабильных микропузырьков является сдвиг homogenizAtion 6, что может привести к стабилизирующим гексагональной фосфолипидов рисунка на микропузырьков поверхности 18. Основываясь на этой концепции, мы описываем включение гомогенизатор в линии с высокой скоростью сдвига для создания самосборки Loms 19. В этом процессе, гомогенизатор утилизирует быстро вращающихся лопастей в непосредственной близости от двойных тонких экранов сетки emulsor, создавая высокую механическую и Гидравлические ножницы для создания микропузырьков. Серийный концентрация липидной эмульсии с помощью этой системы дает более концентрированный газообразной фракции, который может быть еще больше сконцентрированы центрифугированием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Настройки системы

Система состоит из холдинга и сосредоточиться бак (НСТ), снабженными одноступенчатой ​​смеситель, гомогенизатор высокого сдвига в линии, роликовым насосом для перемещения жидкости между НСТ и гомогенизатор и теплообменником (рис. 1).

  1. Наведите стерилизованный, широким горлышком 4 L сбора стеклянный сосуд, снабженный 2 базовых портов и 3 боковых портов под единой смеситель стадии. Опустите головку миксера до устья сосуда и обеспечить газонепроницаемую установку с помощью резиновых уплотнений или ленту (в целях предотвращения окружающий воздух от загрязняющих головной пространство).
  2. Установите один из базовых портов (рис. 1, порт # 1) HCT стерильной 3/8 "(ID) прозрачной трубки, около 10" длиной, оснащен 3-ходовой кран на конце для сбора концентрированной эмульсии .
  3. Установите вторую базовую порт (рис. 1, порт # 2) стерильной 3/8 "(ID) трубы, approximatelу 36 "в длину. Поток этот трубопровод через роликовый насос. Установите входное отверстие высокой гомогенизатор сдвига с тройником в том числе двумя портами и подключить следующим образом: соединить трубы из порта № 2, через роликового насоса и подключить к бортовой порт тройника. Подключите другой порт для кислородного баллона с использованием газообразного кислорода расходомер с низким уровнем потока.
  4. Подключение выпускное отверстие гомогенизаторе высокого сдвига к впускному отверстию теплообменником на линии, поддерживаемой при 4 ° С. Подключение выходное отверстие теплообменника с обратным портом HCT (рис. 1, порт # 3), создание системы с замкнутым контуром.
  5. Присоединить кислородный резервуар (через расходомер) в HCT (рис. 1, порт # 4). Прикрепите газовый состав монитор, который открыт в атмосферу к началу порту НСТ (рис. 1, порт № 5).
  6. Если бесплодие желательно, стерилизовать стеклянные и металлические компоненты перед каждым использованием в автоклаве. Стерилизовать компоненты труб и пластиковой сотрудничестваnnectors по окиси этилена перед каждым использованием. Это особенно важно, если продукт должен быть проверен в естественных условиях.

2. LOM Производство

  1. Поместите 20 г GMP 1,2-дистеароил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC) и 10 г холестерина в базе HCT. Добавить 1 л Plasma-Lyte А к HCT и ручной перемешивают в течение 1 мин, объединяя столько, сколько возможно липидов в водной фазе.
  2. Опустить Смеситель стадии в водную фазу, гарантируя, что весь смеситель головка покрыта водной фазе. Убедитесь, что в верхней части HCT является газонепроницаемой (см. шаг 1.1 выше), и, что не существует никаких открытых боковых портов. Включите источник газа, прикрепленной к порту # 4 и подождите, пока кислород доля НСТ свободном пространстве не достигнет> 95%. В 10 л / мин (ЛПМ), это должно занять ~ 10 мин.
  3. Использование одного смесителя этап, смешать эмульсию предшественника в течение 5 мин при 5000 оборотах в минуту. Полученную смесь следует Бледно-белый и не содержат никаких видимых ЛИПИг сгустки. После смешивания, неиспользованный липидов воды смесь можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 30 дней до одного человека.
  4. Премьер вся система замкнутого контура с эмульсией предшественника поворотом на роликового насоса на 1,3 LPM. После того как система грунтуется, держать насос на 1,3 LPM.
  5. Чтобы начать производство из модулей LOM, включите гомогенизатор высокого сдвига в линию к 7500 оборотов в минуту. Сразу же после этого превратить в потоке кислорода к входной части гомогенизатора при 0,5 LPM. Держите один этап смеситель (в НСТ) на при 3500 оборотах в минуту. Loms формируются на стыке рабочих лопаток и экранах emulsor внутри гомогенизатора в линию (рис. 2). В течение нескольких минут, жидкость должна стать заметно более вязкой. Более строгий подход для определения вязкости как функции времени, что может быть сделано путем удаления аликвоты через порт 1 в процессе изготовления и анализа с помощью вискозиметра.
    Примечание: Если видимые пузырьки воздуха присутствуют в трубке, выходящего из смесителя, кислородтечь в гомогенизатор на линии слишком высока. Titrate потока газа до жидкость не является непрозрачным и не содержит никаких видимых пузырьков газа.
  6. Запуск системы в течение 15 мин, а затем выключите высокую гомогенизатора сдвига и входное отверстие кислорода к нему. Продолжить запустить один смеситель этап в НСТ, пока эмульсия не удаляется; Это уменьшает разделение фаз и сохраняет относительно однородный продукт в HCT.
    Примечание: Объем газонаполненном эмульсии следует увеличить примерно в 2 3 раза в течение последовательного этапа концентрации. Если это не так, убедитесь, что кислород течет в высоких гомогенизатор сдвига и что концентрации липидов в эмульсии предшественника являются правильными. Эффективность производства уменьшается по мере концентрации липидов уменьшается.

3. Сбор, Концентрация, оценка, и Хранение модулей LOM

  1. Прикрепите стерильной, изменение 140 мл Luer-Lock шприц к запорным краном, прикрепленной к базовой порту # 1 на емкость. Составьте 100 мл жидкости. Плотно закрывают шприц и повторять, пока вся жидкость не была удалена.
    1. Изменить шприцы путем вывода 100 мл воздуха в шприц и затем распиловки излишки поршень шприца и материал выше отметки 140 мл. Заполните и пустые шприцы с помощью зубчатых щипцов составить поршень. Эта модификация позволяет легче центрифугирования.
  2. Центрифуга шприцы с ограничен конце ориентированной вниз в охлажденном (4 º C) ковша центрифуге при 225 мкг в течение 10 мин.
  3. Три слоя материала появится после центрифугирования. Выгнать нижний слой избыточного пасмурный водной фазы и выбросить. Второй слой ярко-белый и содержит концентрированные Loms. Передача концентрированный пену газонепроницаемого шприца с помощью трехходового запорного крана для предотвращения загрязнения окружающей среды газа. Откажитесь от окончательного слоя, в котором содержится свободный кислород газа из разорванных модулей LOM.
  4. Качество пены может быть оценена путем достижения ≥ 90% газа концентрированной пены. Calculели концентрацию газа следующим образом:
    Объем% газа = [(вес Пена / Объем пены) - 1] х 100
    1. В качестве контроля Второй качества, размер микропузырьков по перекрытия светового потока, чтобы определить, размер частиц находится в пределах ожидаемого диапазона. Следует отметить, что изменение во времени гомогенизации или состава может изменить размер пузырьков.
  5. Плотно закрывайте колпачок стеклянный шприц с Луер-фитинг. Концентрированные Loms можно разбавить Plasma-Lyte А в момент использования. Шприцы могут быть сохранены в 22, 4, или -20 ° С; более низкие температуры могут обеспечить повышенную стабильность срока хранения 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая гомогенизации сдвига позволяет эффективно (то есть в течение одного дня) производство достаточных модулей LOM для исследования животных и не требует технических знаний. Как только опытным, до 2 л концентрированных модулей LOM могут быть изготовлены в течение 90 мин.

Размер Микросепаратор и морфология оценивали с помощью световой микроскопии и перекрытия светового потока. Когда в 10 мкл образца визуализировали модулей LOM, сферические Loms были отмечены, как и относительный н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важные шаги к созданию концентрированные, высоко окисленные Loms включают в себя: 1) обеспечение того, чтобы свободное пространство в НСТ остается полностью кислородом; 2) обеспечение того, чтобы чистота липидных наполнителей является оптимальным (в том числе условий хранения и использования продукции GMP); 3) обеспечение того, чтобы смешать порошковые липиды полностью с водной фазой до заливки системы; и 4) обращая особое внимание на увеличение доли газа в пределах HCT чтобы гарантировать, что объемная доля га...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование: Армия США медицинских исследований и Materiel Command (USAMRMC) и управляется телемедицины и передовых технологий исследовательского центра. Shunxi Джи способствовали модификацию шприцев, как описано здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,2-дистеароил-<ЭМ>СН-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)Полярные липиды Avanti770365Альтернативный продукт: не соответствует GMP из NOF America (Coatsome MC-8080)
Холестеринсигма ОлдричC75209
Плазменный лит AVWR80089-818В качестве альтернативы можно использовать
сосуд для сбораSpecialty Glass, Inc.Контактноелицо: Пэм Зурбрик - 281-595-2210
Монитор состава газа (кислород)Precision MedicalPM5900L
Роликовый насос Sarns 8000Calicut Medical16407Часть модульной перфузионной системы
BIOtherm ТеплообменникMedtronicECMOtherm-II
Verso лабораторный поточный смесительSilverson Machines, IncTH-IL-102-VERSOИспользуйте многоступенчатые рабочие головки и удлинитель передней части с Т-образным элементом
для входного порта Silverson VersoИнновациипроцессе Пользовательскийконтакт: Брайан Ливитт - 508-423-2266
Лабораторный смеситель L5M-ASilverson Machines, IncNC0136483Используйте сетчатый эмульсорный экран (тонкий)
Зубчатые щипцы Rochester-OchsnerFisher Scientific13-812-18
140 мл шприцKendall Healthcare Monoject8881114030Убедитесь в наличии замка Люэра.
IX71 Микроскоп с инвертированным светомOlympusIX71
Фотокамера для микроскопа Retiga-2000RQImagingRET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A СаморазбавлениеPSS-NICOMP Системы определения размеров частицСняты с производства
NaCl Glass в

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи