Охвате Анализ: Протокол для оценки взаимодействия между ЦНС фагоцитов и нейронов

Краткое содержание

Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС) с высокой способностью фагоцитозу или поглотить материал в их внеклеточной среде. Здесь широко применимы, надежный и очень количественный анализ для визуализации и измерения микроглии-опосредованной полном охвате синаптических компонентов описан.

Аннотация

Фагоцитоз представляет собой процесс, в котором клетка поглощает материал (вся клеток, частей клеток, мусора и т.д.) в окружающей его внеклеточной среде, а затем переваривает этот материал, как правило, через деградации лизосом. Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС), чьи фагоцитарной функции была описана в широком диапазоне условий от нейродегенеративных заболеваний (например, бета-амилоид зазора при болезни Альцгеймера) для развития здорового мозга (например, синаптической обрезка) ^1-6. Следующий протокол является охвате анализа разработан для визуализации и количественной микроглии-опосредованной полном охвате пресинаптических входов в развивающихся мыши системы retinogeniculate ^7. В то время как этот анализ был использован для оценки функции микроглии в данном конкретном контексте, подобный подход может быть использован для оценки других фагоцитов по всему мозгу (например, астроцитов) и остальной частью тела(например, периферические макрофаги), а также другие условия, в которых происходит ремоделирование синапсов (например, повреждение головного мозга / болезнь).

Введение

Synaptic схемы реконструировать в течение всей жизни животного. В развивающемся мозге, синапсы образуются в избытке, и должны пройти синаптическую обрезку, которая предусматривает селективное удаление подмножества синапсов а также поддержание и укрепление этих синапсов, которые остаются ^8-10. Этот процесс необходим для достижения точного характеристику подключения взрослого нервной системы. У взрослых, синапсы также может быть пластик, особенно в контексте обучения и памяти. Структурные корреляты этой пластичности, как полагают, включают в себя добавление и / или ликвидации дендритных шипиков и пресинаптических бутонов ^11-13. В дополнение к этим ролям в здоровой нервной системы, синаптической ремоделирования также участвует в заболевание нервной системы / травмы ^12,14,15. Например, после травмы спинного мозга, отрубленные аксоны должны впоследствии реконструировать и формировать новые синапсы для достижения функционального восстановления ^16-19.

нт "> Появившись как важного аспекта синаптической пластичности является процесс фагоцитоза или охвате синапсов, предназначенных для удаления ^3,5,20. Недавно мы показали это явление в контексте синаптической обрезки в здоровой, послеродовой мозга мыши ^7. частности , микроглии, резиденты ЦНС иммунные клетки и фагоциты, были показаны поглотить пресинаптические входы в пиковый период и в области развития синаптической обрезки, послеродовой спинной латерального коленчатого тела (dLGN) таламуса. Генетическая или фармакологическая блокада этой охвате привело к длительным дефицитом в синаптической связи.

В этом протоколе, мы описываем надежный и очень количественного анализа для измерения фагоцитов опосредованного полном охвате пресинаптических входов. Для целей настоящей статьи, этот анализ будет представлен в контексте развивающегося retinogeniculate системы, которая включает ганглиозных клеток сетчатки (РГК), проживающего в сетчатке, чтопроецировать пресинаптические вклад в dLGN (рис. 1А). Для начала, лизосомального деградации устойчивых антероградная стратегия маркировка будет описано, которая используется для визуализации RGC-специфические пресинаптические входы в dLGN (рис. 1) ^7,21. После этого описания, подробной методики для работы с изображениями и количественного измерения полном охвате помощью конфокальной микроскопии в сочетании с 3 мерные (3D) поверхности объема оказания будет дано. Эта методика основана на подготовку фиксированной ткани, но также могут быть адаптированы для использования в живых визуальных исследований. Важно отметить, что в то время как анализ был подтвержден в контексте здорового, послеродовой системы retinogeniculate, можно применять те же методы для оценки других взаимодействий фагоцитов-нейронов по всему мозгу и во время болезни, а также функцию фагоцитов в других органах и системах.

Протокол

1. Антероградная Маркировка РГК пресинаптических входов

Примечание: Все эксперименты, связанные с использованием животных были рассмотрены и под контролем институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) в соответствии со всеми руководящими принципами NIH.

1. Стерилизовать поле и инструменты.
2. Обезболить мышь с 4% об изофлураном в индукции камеры оргстекла (этот объем% изофлюран работает для новорожденных-взрослый мышей). Соблюдайте мышей тесно, чтобы избежать чрезмерной обезболивающих. ВНИМАНИЕ: Избегайте вдыхания с эвакуации вакуум отходящих газов.
3. После 1-3 мин, (старшего мышей потребует меньше времени) обеспечить соответствующий уровень анестезии достигается, зажимая хвост (не должно наблюдаться никакой реакции) и наблюдая частоту дыхания (ставка должна быть медленный и стабильный).
4. Наведите мышь под стереомикроскопом на бок и место носового конуса доставки 3-4% по объему изофлурана по языку (новорожденные <послеродовой день 10 (P10) ~ 4% по объему;> P10 ~ 3% по объему).
5. Expose склеры. Для инъекций новорожденных до открытия глаз, используйте пару маленьких весенних ножницами, чтобы открыть веко и оттяните кожу, чтобы разоблачить склеры. Для более старых мышей, используйте пальцы, чтобы отступить кожу вокруг глаз, чтобы разоблачить склеры. ВНИМАНИЕ: В новорожденных, иногда другой, перпендикулярной Срез у угла глаза необходимо. Будьте осторожны при резки угол века, поскольку есть кровеносный сосуд, который, если сократить, будет кровоточить.
6. С помощью стерильного 30,5 г иглу, чтобы проколоть маленькое отверстие в боковой части глаза на линии, где начинается склеры. Позаботьтесь, чтобы не повредить объектив, вставив иглу просто достаточно далеко, что угловая переходит в глаза.
7. Разрешить стекловидное тело течь из отверстия и использовать стерильный ватный-наконечником аппликатором поглощать жидкость.
8. После того, как стекловидное тело уже перестала течь из отверстия, вставить затупляли иглу, прикрепленную к шприца Гамильтона с предустановленной антероградной трассировки красителяв отверстие. ВНИМАНИЕ: Вставьте иглу медленно, чтобы избежать прокалывания другую сторону глаза и не повредить объектив.
9. Медленно вводить краситель в глаз. Как правило, холерный токсин β-субъединицы, конъюгированного с Alexa 594, 647, или 488 (CTB-594, CTB-647, или CTB-488, 5-6 мкг / мкл) используется для anterogradely входов RGC трассировки. Для новорожденных (≤ P10) 1-2 мкл достаточно и для мышей> P10 ~ 3 мкл достаточно. Примечание: Alexa красители особенно устойчивы к деградации лизосом
10. Оставьте иглу в отверстие в течение нескольких секунд, а затем медленно удалить.
11. Используйте ватную палочку, чтобы поглотить лишнюю жидкость и предотвратить краску от утечки.
12. Нанесите небольшое количество мази с антибиотиком для глаз. Если глаз вскрывают хирургически, мягко перемещать веки вместе.
13. Если инъекционных оба глаза, повторите процедуру на другой глаз.
14. После инъекции (ы), оставить мышь под инфракрасной лампой или на тепловой площадку, пока не начнет восстанавливаться от AnesthОВОС.
15. Вернуться мышь на чистую домашнюю клетку и контролировать, чтобы убедиться, что это полностью проснулся, прежде чем вернуться в колонию.

2. Подготовьте Tissue для работы с изображениями

Этот протокол подготовки ткани используется для репортерных мышей, в котором фагоциты, меченные флуоресцентными маркерами (например, CX3CR1-EGFP для микроглии). Если репортер линия не доступна, следователь может immunostain срезах тканей (см. Обсуждение).

1. ~ 24 часа в сутки после инъекции, пожертвовать мышь и препарировать мозг.
2. Оставьте зафиксировать мозг в Сокол трубки, заполненной 4% параформальдегида (PFA) в течение ночи при 4 ° С. ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным. Избегайте вдыхания и контакта с кожей с помощью в вытяжном шкафу или на столе нисходящего и носить средства индивидуальной защиты. Примечания: Фиксация может быть короче (≥ 4 ч). Кроме того, вместо фиксации капли, 4% PFA перфузии может быть использован с последующим 2-24 ч капли исправить. Однако сравнение Заливатьд падать фиксированные новорожденных и мозга взрослого человека не выявлено никакой разницы в качестве изображения или количественного.
3. Промыть 3 раза мозга в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).
   1. Вылейте мозг и PFA в пустую взвешивания лодке.
   2. Используйте лопаточку, чтобы передать мозг на другой весят лодку, наполненную PBS.
   3. Вымойте мозга в два раза больше в PBS (трансфер мозг еще два весят лодки, наполненные PBS).
4. Трансфер мозг к Сокола трубки, заполненной 30% раствора сахарозы. Оставьте мозг сахарозы при 4 ° С, пока мозг не опускается на дно пробирки (24-48 ч).
5. Как только мозг погружается, подготовить мозг для секционирования. Следующие шаги подготовка 40 мкм с плавающей секции с помощью скользящего микротома с морозильной стадии (криостат также может быть использован).
   1. Используйте лезвие для удаления части мозга, которые не нужны (для dLGN, удалить ростральные и хвостовой части мозга).
   2. Замораживание лифчикв алюминиевой фольги над сухим льдом. В течение этого времени заморозить этап микротомных и заполнить каждую лунку 24-луночного планшета с 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (PB).
6. Установите замороженный мозг (он должен появиться непрозрачный) на сцене замерзания.
   1. Нанесите небольшое количество оптимального температурного резки соединения (ОКТ) на сцену.
   2. После октября начинает замерзать, лежал мозг в октябре Конец мозга, которые будут сокращены должен быть обращен вверх (например, для dLGN, сталкиваются с хвостовой частью вверх).
   3. Накройте мозг и октябре с очень мелко измельченного сухого льда.
   4. Оставьте сухой лед на мозг / октябрь в течение ~ 30 сек.
   5. Используйте большую кисть, чтобы удалить сухой лед. Мозг и октябре должны быть заморожены на сцену.
7. Начните секционирования через ткань, пока область интереса (ROI) не будет достигнута.
8. После того, как ROI достигается, используйте маленькую кисть, чтобы удалить разделы из лезвия и передавать их в Плат 24-ае содержащего 0,1 М PB (шаг 2.5.2). Держите кисть влажная путем смачивания его в 0,1 М PB до удаления разделов от лезвия. Примечание: Разделы можно оставить в 0,1 М PB в течение ночи при 4 ° С.
9. После того, как разделы были собраны, визуализировать антероградную маркировку под флуоресцентным микроскопом рассекает и выберите разделы, которые содержат ROI.
10. Установите разделы на слайде с небольшим кистью.
    1. Нанесите небольшое пул 0,1 М PB для заряженной стекло микроскопа.
    2. Трансфер срезы ткани в бассейн ПБ.
    3. Используйте PB и кисть, чтобы сориентироваться и распространять ткани.
    4. Используйте Kimwipe для фитиля от лишнего PB. Позаботьтесь, чтобы избежать затекания от раздел.
    5. Позволит полностью высохнуть на воздухе.
    6. Нанесите небольшое падение монтажной среды к каждому разделу и смонтировать покровное на вершине (22 х 50 мм, № 1.5).
    7. Уплотнение края слайда с лаком для ногтей и хранить при температуре -20 ° С до визуализации сессии. Примечание: Хотя изображения св неделю препарат рекомендуется, слайды можно поддерживать при температуре -20 ° С в течение нескольких недель до визуализации.

3. Изображений тканей

Все изображения получены на вращающемся диске конфокальной микроскопии (UltraView Vox вращающийся диск конфокальной микроскопии оснащена диодных лазеров (405 нм, 445 нм, 488 нм, 514 нм, 561 нм и 640 нм)). Изображения можно также приобрести на любом микроскопе с возможностью приобретения высокого разрешения Z-стеки (например, лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, epifluorescent микроскопом с последующим деконволюции и т.д.). Размер рамы, как правило, 1000 х 1000 пикселей.

1. Найти ROI в 10-кратным увеличением и получить изображение. Для визуализации микроглии в системе retinogeniculate, ROI является наиболее медиальной разделы dLGN.
2. Переход к большему усилению (объективной 60X План Апо, NA = 1.4, как правило, используется).
3. Приобретать первое поле зрения, содержащей фагоциты используя 0,2 мкм Z-шагс.
4. Приобретать 15-19 больше полей, содержащих фагоциты на одно животное.

4. Подготовка изображений для количественного (ImageJ)

1. Открыть Z-Stack в ImageJ.
2. Перейдите в меню Image, выберите цвет и Сплит каналов.
3. Вычитание фона от канала (ов), содержащего охвачен материал.
   1. Выберите окно канала, содержащий охватившего материал (например, пресинаптические входы).
   2. Перейдите в меню Process и выберите Subtract Background. Используйте катящийся шар радиусом 10 пикселей для антероградной отслеживания пресинаптических входов в dLGN. Примечание: Радиус катящийся шар определяется опытным путем. Тем не менее, как правило, должны быть такого размера, как радиус наибольшего объекта на изображении, который не является частью фона.
4. Гладкая канал, содержащий фагоцитов.
   1. Выберите окно канала, содержащий фагоцитов (например, микроглии).
   2. Перейдите в меню Process и сельЭСТ Фильтры, значит. Используйте средний фильтр 1,5 (это сглаживает изображение на оказание поверхности в более поздних стадий).
5. Вычтите фон из канала, содержащего фагоцитов.
   1. Выберите окно канала, содержащий фагоцитов (например, микроглии).
   2. Перейдите в меню Процесс выберите вычитания фона (настройки должны быть определены эмпирически). Используйте катящийся шар радиусом 50 пикселей для EGFP-позитивных микроглии.
6. Слияние каналов, зайдя в меню Image и выберите Цвет, Объединить каналы.
7. Растениеводство ROI содержащий фагоцитов из объединенный файл (это делает поверхность рендеринга быстрее, см. шаг 5).
   1. Нарисуйте рамку вокруг рентабельности использования прямоугольное выбора в панели инструментов.
   2. Перейдите в меню Image и выберите Обрезать.
8. Снова Сплит каналов (см. шаг 4.2).
9. Сохранить каждый канал как отдельный файл TIFF.

5. Подготовка изображения для количественнойв Imaris

1. Открытые Imaris и убедитесь, что значок громкости выбран в левом верхнем меню (рис. 2).
2. Открыть первый канал обрезанного изображения (любой из каналов может быть открыт первый, просто быть последовательным).
3. Добавить другой канал (ы). Перейдите в меню Правка выберите пункт Добавить каналов и выберите следующий канал в файле. (Повторите этот шаг для оставшихся каналов). Примечание: Чтобы изменить цвет, перейдите в окно настройки дисплея и нажмите на название канала (рис. 3А). После этого появится диалоговое окно для настройки цвета. Если окно настройки дисплея не видно, перейдите в меню Правка и выберите пункт Настройка дисплея.
4. Отрегулируйте значения пикселов. Перейдите в меню Правка и выберите пункт Свойства изображения. В этом окне, отрегулируйте х, у, и значения г пиксельные (Эти значения зависят от микроскопа, объективной, камера, и г-поэтапного приобретения и могут быть найдены в программном обеспечении, используемом для сбора данных изображения).
5. Шаг 5.5 приведет к оченьнебольшое изображение. Для восстановления исходного размера щелкните на Fit иконке в нижнем правом углу (рис. 2).
6. В окне Настройка дисплея, настроить яркость и контрастность для каждого канала с помощью левой и средней треугольники.

6. 3 х мерные (3D) Поверхность Оказание фагоцитов

1. В верхней панели инструментов, убедитесь, что режим Surpass выбран (рис. 3в).
2. В окне Настройка дисплея, снимите все каналы, кроме фагоцитов канала. Это удалит их из поля зрения.
3. Нажмите на значок поверхности визуализации (рис. 2).
4. Создать окно будет отображаться в левом нижнем углу (рис. 4А), убедитесь, что сегмент ROI снят в этом первом окне. Нажмите синюю кнопку вперед на дне.
5. Отрегулируйте сглаживание.
   1. В следующем окне выберите фагоцитов канал из выпадающего меню (рис. 4В). Регулируетколичество деталей, которые будут поверхность и должна быть определена эмпирически (0,1 мкм сглаживание обычно используется для микроглии).
   2. Выберите Absolute пороговой.
   3. Нажмите на синюю кнопку вперед на дне.
6. Порог изображение.
   1. Нажмите на гистограмме и перетащите, пока изображение не всплыли соответствующим (рис. 4С). Это определяется эмпирически путем поворота изображения для обеспечения серые поверхности наложены на флуоресцентное изображение точное представление поверхность. Примечания: Чтобы повернуть, выберите Навигация в меню Pointer в правом верхнем углу экрана (рис. 3В), нажмите и удерживайте изображение для поворота. Для возврата изображения к исходной ориентации, выберите Происхождение внизу слева в меню Вид.
   2. Нажмите на синюю кнопку вперед на дне.
7. В следующем окне, есть возможность отфильтровать любые поверхности от размера и т.д. Если изображение не очень шумно, не фильтровать и удалятьу фильтры, которые автоматически отображаются на экране. Нажмите на зеленую стрелку в нижней закончить поверхность оказания фагоцитов. Новый набор вкладок появится (рис. 5)
8. При необходимости, удалить все поверхности, которые не являются частью фагоцита интересов.
   1. Убедитесь, что для параметра Выбрать выбирается в меню Pointer (рис. 3В).
   2. Нажмите на любой поверхности, который нужно удалить, чтобы он становится желтым. Для удаления нескольких поверхностей, нажмите на поверхностях, удерживая нажатой кнопку управления.
   3. Нажмите кнопку Удалить на вкладке Карандаш.
9. Выберите и слейте все поверхности фагоцитов в одной поверхности.
   1. Кликните на закрома (т.е. закладке Фильтр; Рисунок 5C).
   2. Нажмите кнопку Добавить.
   3. Выберите любой фильтр, перетащите гистограмму в крайнее левое положение (все поверхности должны быть желтого цвета).
   4. Вернитесь на вкладку Карандаш и нажмите Unify.
10. Перейдите на вкладку Graph (рис. 5А ) и нажмите на детали и выберите любые параметры просмотров. Выберите том (рис. 5D). Для отображения нескольких параметров, перейдите на значок гаечного ключа в левом нижнем углу (рис. 2) и выберите параметры для записи.
11. Запишите объем фагоцита и сохраните файл перед тем как продолжить.

7. 3D поверхности Оказание охватившего Материал

1. Создать новый канал для материала, который был охвачен фагоцита.
   1. Если выбран поверхности фагоцитов, нажмите на вкладку карандашом.
   2. Нажмите Маска Все.
   3. В диалоге, который появляется, выберите канал, соответствующий охватившего материала (например, антероградная розыска пресинаптических входов; Рисунок 5В).
   4. Проверьте дубликат канала перед нанесением маски и нажмите кнопку ОК.
   5. Новый канал появится в окне Настройка дисплея, который содержит только материал, который был охвачен и находится внутрифагоцитов.
2. Поверхность оказывать канал, содержащий общую охвачен и nonengulfed материал.
   1. Снимите все каналы в окне Настройка дисплея для канала, который необходимо всплыли исключением и снимите поверхность, созданную для фагоцитов.
   2. Нажмите на иконку рендеринга поверхности снова (см. шаг 6.3) и создать поверхность для канала с помощью те же действия, описанные для фагоцитов (шаги 6.4-6.11). Примечания: Обязательно выберите правильный канал до сглаживания и определение порога (этап 6,5; Рисунок 4б). Запишите порогового значения (см. шаг 6.6; Рисунок 4C). Это значение также может быть получена после оказания поверхности завершена (вкладка Жезл; 5А).
3. Запишите объем общего охватившего и не охватившего материала и сохраните файл перед тем как продолжить.
4. Поверхность оказать охватившего материал (материал в фагоцитов).
   1. Визуализация флуоресценцию тольконовый канал охватившего материала (см. шаг 7.2.1).
   2. Выполните те же действия, что и выше (шаги 7,2-7,3). Примечания: Не забудьте выбрать правильный канал из раскрывающемся меню до сглаживания (выбрать новый канал, созданный на шаге 7.1). В порогового окна, вручную ввести пороговое значение, которое было установлено на оказание общее охватившего и не охвачен материал (см. шаг 7.2.2).
5. Запишите объем охватившего материала и сохранить файл, прежде чем продолжить.

8. Рассчитать общий объем поля зрения

1. Создать новую поверхность для любого канала.
2. В окне выбора порога (этап 6.6), сдвиньте гистограмму всю дорогу влево так, чтобы вся поле всплыли.
3. Закончить наплавки все поле и регистрируют объем (шаги 6.7-6.11).
4. Сохраните файл.

9. Подсчитать количество фагоцитированы Материал

1. Рассчитайте плотностьОбщая охвачен и не охвачен материал канал, используя следующий алгоритм:
   Объем Total охвачен и Non-охватившего материала (шаг 7.3) / Объем поле (этап 8).
2. Рассчитать% полном охвате на ячейку, используя следующий алгоритм:
   (Объем охватившего материала (шаг 7.5) / Общий объем фагоцитов (шаг 6.11)) х 100
   Примечания: Для учета изменений в размерах клеток, данные нормализуются к общему объему фагоцитов. Если цифры от шага 9.1, крайне непостоянны по полям, это может быть необходимо для нормализации данных, начиная с шага 9.2 с расчетом в 9,1.

Результаты

В последнее время мы использовали этот охвате анализа визуализировать и количественно микроглии-опосредованной полном охвате пресинаптических входов в развивающихся retinogeniculate системы (рис. 1) ^7. РСК из CX3CR1-EGFP гетерозиготных мышей anterogradely проследить с CTB-594 и CTB-647 в левого и правого глаза соответственно. После этого трассировки, EGFP-положительные микроглии в пределах dLGN были обследованы. Эти изображения были впоследствии поверхности оказанные для измерения объема.

Обсуждение

Для того, чтобы точно измерить фагоцитоз, охвачен материал должен быть помечены таким образом, что исследователь может визуализировать один раз деградация лизосомальных произошло. Кроме того, высокое разрешение изображений требуется, с последующим использованием программного обеспечения, которое позволит исследователю для визуализации объема всей клетки и количественно его содержимое. В этом протоколе, мы описываем высоконадежный и количественный метод измерения фагоцитов опосредованного полном охвате помощью CTB, конъю...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Грелка	Vet Equip, Inc.	965500
Источник теплой воды для грелки	Kent Scientific	TP-700
Стерео микроскоп	DSC Оптический	Zeiss Opmi -6 Хирургический микроскоп Скользящий микротом
с замораживающим столиком	Leica	SM2010 R
Лезвие микротома	Leica	14021607100
Флуоресцентный препарирующий микроскоп	Nikon	SMZ800 с Эпифлуоресцентная насадка
Вращающийся диск конфокальный микроскоп	Perkin Elmer	UltraView Vox Вращающийся диск Конфокальный
10 & микро; l Газонепроницаемые шприцы Hamilton	Hamilton	80030	Используйте разные шприцы для каждого цвета красителя/индикатора
Иглы Hamilton	Hamilton	7803-05, характеристики: тупой, 1,5"
Alexa-конъюгированный холерный токсин и бета; субъединица (CTB)	Invitrogen	488: C22841	Reconstitute в стерильном физиологическом растворе, 80 &; l (488), 100 &микро; L (594), 20 и микро; l (647)
594: C22842
647: C34778
фосфатный буферный физиологический раствор ( PBS)	Sigma	P4417-50TAB
Неомицин и полимиксин В сульфаты и бацитрацин цинк Офтальмологическая мазь USP (мазь с антибиотиком)	Bausch & Lomb	24208-780-55
30,5 G игла	Becton Dickinson	305106
Пружинные ножницы	Roboz	RS-5630
Аппликатор с ватным	наконечником Fisher	23-400-125
Параформальдейд (PFA)	Электронная микроскопия Sciences	15710	Разбавление от 16% до 4% в PBS. Параформальдеге токсичен, использовать в вытяжном шкафу и носить средства индивидуальной защиты.
Инструменты для пресечения – ножницы, щипцы, шпатель	Маленькие ножницы: Fine Science Tools	Маленькие ножницы: 14370-22
Большие ножницы: Roboz	Большие ножницы: RS-6820
#55 щипцы: Fine Science Tools	#55 щипцы: 11255-20
Шпатель: Ted Pella, Inc.	Шпатель: 13504
Сахароза	Sigma	S8501-5KG	Содержит 30% сахарозы в PBS (вес/об)
OCT Compound	VWR	25608-930
Весить лодку	США Scientific	2347-1426
24-луночные планшеты	BD Biosciences	353047
Одноосновной фосфат натрия	Sigma	S6566-500G	Получите 0,2 М одноосновного фосфата натрия (PB-A) в ddH2O и 0,2 M двухосновного фосфата натрия (PB-B) в ddH2O. Чтобы сделать 0,1 М ПБ, соедините 19 мл ПБ-А и 81 мл ПБ-В, заполните до 200 мл ddH2O
Sodium phosphate dibasic;	Sigma	S5136-500G
Покровные стекла, 22 X 50 мм, No 1.5	VWR	48393 194
Заряженное предметное стекло для микроскопа	VWR	48311-703
Vectasheild	Vector Laboratories	H-1200