Методическая статья

Озвучивание при содействии Иммунофлуоресцентное Окрашивание поздней стадии эмбрионального и личиночного Drosophila Ткани На месте

DOI:

10.3791/51528

⸱

14 августа 2014 г.

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуноокрашивание - это эффективный метод визуализации конкретных типов клеток и белков в тканях. Используя ультразвуковую обработку, описанный здесь протокол устраняет необходимость препарирования тканей Drosophila melanogaster из эмбрионов и личинок поздней стадии перед иммуноокрашиванием. Мы предлагаем эффективную методологию иммуноокрашивания цельных личинок с фиксацией формальдегида.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, проведенные в Дрозофилы эмбрионов и личинок обеспечивают решающую понимание процессов развития, таких как спецификации клеточных судеб и органогенеза. Иммуноокрашивание позволяет для визуализации развития тканей и органов. Тем не менее, защитная кутикула, что образует в конце эмбриогенеза предотвращает проникновение антител в эмбрионы поздней стадии и личинок. В то время как рассечение до иммунной регулярно используется для анализа дрозофилы личинок тканей, это доказывает, неэффективны для некоторых анализов, потому что маленькие ткани может быть трудно локализовать и изолировать. Озвучивание предоставляет альтернативу вскрытия в личиночной иммуноокрашивания протоколов дрозофилы. Это позволяет быстро, одновременной обработки большого количества зародышей на поздней стадии и личинок и поддерживает на месте морфологии. После фиксации в формальдегид, образец обрабатывают ультразвуком. Образец затем подвергают иммунным окрашиванием с антиген-специфического первичного муравьевibodies и флуоресцентно меченных вторичные антитела визуализировать типы клетки-мишени и специфических белков с помощью флуоресцентной микроскопии. В процессе обработки ультразвуком, правильное размещение ультразвуковую зонда над образцом, а также от длительности и интенсивности ультразвука, имеет решающее значение. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ незначительные модификации стандартных протоколов иммуноокрашивания могут потребоваться для высоких пятен качества. Для антител с низким отношением сигнал-шум, более длительное время инкубации, как правило, необходимо. Как доказательство концепции для этого протокола обработки ультразвуком при содействии, мы показываем immunostains трех типов тканей (яичках, яичниках и нервной ткани) в диапазоне стадиях развития.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбрионы дрозофилы и личинки предоставит прекрасную модель для изучения процессов развития во многих органах и тканях. Визуализация отдельных клеток часто необходимо в этих исследованиях для выяснения сложных условий, в которых клетки развиваются. Визуализация клеток в тканях может быть достигнуто через иммунной окраски. Ну описанных иммуноокрашивания протоколы касаются эмбриональных тканей Drosophila <17 ч после откладки яиц (AEL) 1-3. Тем не менее, защитные кутикулы формы к концу эмбриогенеза, предотвращая эффективное проникновение антител. Таким образом, эти Иммуноокрашивание протоколы неэффективны при анализе тканей у эмбрионов поздней стадии и на последующих этапах развития личинок (1-й возрастной стадии (L1), 2-й возрастной стадии (L2), и 3-й возрастной стадии (L3)). Эта неэффективность накладывает барьер для нашего понимания динамических процессов, которые происходят в течение этого длительного периода развития 4. Tissие рассечение является широко применяется методика, чтобы обойти этот барьер 5-7. Однако, рассечение может оказаться неэффективным. Добыча может быть обременены трудностями в поиске или выделения эмбриональных и личиночных тканей. Кроме того, физическое удаление ткани-мишени может привести к повреждению путем разрыва их или будучи не в состоянии извлечь их во всей их полноте.

Озвучивание это метод, который использует звуковые волны, чтобы нарушить межмолекулярных взаимодействий. Он был использован нарушить целостность кутикулы личинок Drosophila, чтобы immunostain разработке нейронных типов клеток 6. Этот протокол был адаптирован для immunostain поздней стадии эмбрионального и личинок половые железы, которые могут быть как малые, как 50 мкм в диаметре 8-10. С помощью таких исследований, процесс мужской зародышевой линии стволовых клеток (ГСК) формирование ниши был охарактеризован в конце стадии эмбрионов Drosophila 8-10 и механизмы, регулирующие развитие стволовых клеток и DIFференциации в поздней стадии эмбриональных половых желез и личинок были выяснены 9-12. Таким образом, обработка ультразвуком обеспечивает эффективную альтернативу рассечения тканей, что может быть трудно, потому что от размера ткани. Кроме того, это позволяет иммунным окрашиванием тканей Drosophila в месте, в результате чего клетки в контексте всего организма и сохранение морфологии на месте. Здесь мы описываем шаг за шагом протокол для флуоресценции иммуноокрашивания поздней стадии эмбрионального через начале / середине L3 тканей в месте. Анализ Drosophila гонадного и нервной ткани показано в Представитель Результаты чтобы продемонстрировать эффективность этого протокола. Кроме того, этот протокол иммунное окрашивание может быть приспособлен для анализа других тканей Drosophila, а также ткани в других организмах с наружным кутикулы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Подготовка Collection Кейджем

  1. Обезболить молодых, плодородные мух с CO 2. Трансфер наркотизированных мух в клетку. Для получения оптимального выхода, используйте 100-120 взрослых мух, начиная от 2-7 дневного возраста в соотношении 4: 1 самок и самцов. Разрешить летит соответствующий период акклиматизации, ~ 24 ч до получения образца для фиксации. Если клетка была создана с девственными женщин в паре с мужчинами, применение 36 - 48 ч акклиматизации период.
  2. На открытом конце клетки, поместить предварительно подготовленную яблочный сок агаром с одной дозы размера капли дрожжевого теста в центре над открытием клетке. Тогда, закрепите ленту. Уплотнение стыка между яблочного сока агаром и клетку с парафильмом.
  3. Поместите клетку во вторичной емкости яблочный сок с агаром в качестве основы и позволяют мухи, чтобы воспроизвести при определенной температуре в течение определенного периода времени, как определено в эксперименте.
    Примечание: раз взятия пробы Wiбуду меняться. Например, при сборе поздних эмбрионов на стадии ранней / L1 личинок (17 - 24 ч), чтобы мухи, чтобы отложить яйца на яблочный сок чашки с агаром в течение 7 ч при 25 ° С до старения образца в течение 17 ч при 25 ° С. Аналогично, для коллекции середине-конце первого возрастной стадии личинок (36 - 48 ч) позволяют мухи откладывают яйца в течение 12 ч при 25 ° С до старения образца в течение 36 ч при 25 ° С.
  4. После того, как период времени будет завершена, нажмите клетку на стол так, что мухи упасть от яблочного сока агаром без анестезии. Быстро заменить используемую пластину на свежую, содержащую каплю дрожжевого теста. Закрепите новую тарелку с лентой и парафильмом и хранить клетку с яблочного сока агаром в качестве основания.
  5. Осторожно снимите падение дрожжей от используемого пластины с металлическим шпателем. Место крышка от используемого яблочного сока пластины и позволяют положил эмбрионов возраста, если экспериментально необходимости.
    Примечание: В то время как старение образцы, плиты можно хранить при 25 ° С, если более высокие температуры не ExperimentaLLY требуется. Примеры того, как стареют эмбрионов для коллекции, описанной выше (примечание для шага 1,3). Удаление дрожжей пасты предварительного пробовать старение выполняется для предотвращения личинок от ползания в дрожжах и разбивая агар под. Остальные яблочный сок агар и дрожжи пасты остаток обеспечивают питательными веществами роста личинок. В то время как эмбрионы, установленные непосредственно в дрожжевой пастой теряются за счет удаления дрожжи пасты, эта потеря предпочтительнее дрожжей и агар остатка в образце, что позволяет уменьшить окрашивания эффективность. Если один выбор, чтобы не удалить дрожжевую пасту, дрожжи могут быть сжиженного фосфатным буфером Triton X-100 (PBTx), смешивают с кистью, а затем удаляют из образца с ячейки сетчатого фильтра до фиксации.

2 Фиксация

  1. После того, как эмбрионы, установленные на яблочный сок агаром постарели в нужную точку времени, используйте маленькую кисть, смоченную раствором фосфатного буфера Тритон Х-100 (PBTx) тщательно удалить образец из йэ пластины.
    Примечание: Позднее личинки подвижны и могут ползать на внутренней стороне крышки. Этот пример может быть собран аналогично путем удаления с кистью.
  2. Протрите образца-Ладена кисть против внутренней стороне хребта ячейки сетчатого фильтра. Тогда, промойте стены сито и кисть с шприц бутылку, содержащую решение PBTx. Поставьте Петри крышку блюдо под сито, чтобы захватить решение PBTx.
  3. Ведь образец был передан в сито, влить достаточно PBTx в сито, чтобы поднять образец от сетки. Затем поднимите фильтр и вылейте содержимое чашки Петри на жидкую контейнер для отходов.
  4. Повторите шаг 2,3 три раза, чтобы удалить дрожжи и летать отходов, которые могут быть переданы вместе с образца.
  5. Налейте достаточно 50% отбеливателя (NaOCl) / воды (DDh 2 O) решение в сито, чтобы поднять личинок от сетки. Разрешить личинки, чтобы сидеть в растворе в течение 5 мин. Затем поднимите фильтр и вылейте тОн содержимое чашек Петри в жидкой контейнер для отходов.
    Примечание: Отбеливатель требуется только в эмбриональных образцов в возрасте от 0 - 22 ч, с тем, чтобы удалить хорионический мембрану. Применение хлорной извести на старых образцов может быть опущен, но его включение не наносит ущерба. Если упущение желательно, заменить отбеливатель на этом этапе с PBTx. Слабым раствором хлорки следует использовать в течение 24 часов подготовки раствора.
  6. Вымойте образец в ситечко с PBTx путем заливки достаточно PBTx в сито, чтобы поднять образец от сетки. Разрешить образца, чтобы сидеть в растворе в течение 3 мин. Затем поднимите фильтр и вылейте содержимое чашки Петри на жидкую контейнер для отходов.
  7. Повторите шаг 2,6 пять раз.
  8. Dab дно ячейки фильтра сухой, а затем перенести образец в сцинтилляционный флакон, содержащий 1,75 мл раствора PEMS с помощью кисти.
  9. Работа в вентилируемом вытяжном шкафу, добавьте 250 мкл 37% формальдегида и 8 мл гептана, содержащую реагенты в сцинтилляционный флакон.
    Примечание: Формальдегид и гептан являются опасными. В целях безопасности, продолжают работать в вентилируемом вытяжном шкафу и носить соответствующую перчатки для шагов 2,9 - 3,3.
  10. Разрешить флакон встряхнуть при 200 оборотах в минуту или аналогичного умеренной скоростью в течение 20 мин.
  11. Добавьте 10 мл метанола в сцинтилляционный флакон, не удаляя предыдущую водную фазу и позволить, чтобы флакон энергично встряхивают при 500 оборотах в минуту в течение 1 мин.
    Примечание: Метанол является опасным. Продолжайте работать в вентилируемом вытяжном шкафу и носить соответствующую перчатки.
  12. Удалить флакон от шейкере и сразу разлить содержимое в ячейки сетчатого фильтра над контейнером жидких отходов в капюшоне. Добавить дополнительный метанол в ампулу и проходить через сито клеток по мере необходимости, чтобы гарантировать, что все образцы были удалены.
    Примечание: Сотовые фильтры могут слить медленно. Чтобы исправить это, прикоснуться лабораторную салфетку, чтобы в нижней части ячейки фильтра, чтобы привлечь раствор через сито быстрее. Метанол, формальдегид, и гептан должны бытьне хранятся в специальных контейнерах с отходами до надлежащей утилизации как за ведомственным руководящим принципам.
  13. Сухой нижней части ячейки сетчатого фильтра с помощью лабораторной ткани, затем с помощью кисти, чтобы передать образец захваченного в сито в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 0,5 мл метанола.
    Примечание: Если несколько сцинтилляционных флаконов в использовании, выполните шаги 2,12 и 2,13 один флакон в то время, чтобы предотвратить образец от высыхания на сотовые фильтров.
  14. После того, как образец был добавлен в микроцентрифужных трубки, удаления метанола при помощи пипетки. Убедитесь, образец осела на дно пробирки.
  15. Промыть образец в микроцентрифужных трубки путем добавления приблизительно 0,5 мл метанола на трубе. Подождите образца урегулирования затем удаления метанола с помощью пипетки.
  16. Повторите шаг 15 в три раза.
  17. Добавить 0,5 мл метанола к трубе, а затем сохранить в -20 ° C морозильник для последующего использования.

3 Регидратация и Получение образца для Иммуноокрашивание

  1. Удаления метанола из трубки микроцентрифужных с помощью пипетки, в результате чего образец в трубке. Магазин метанол отходы в соответствующий контейнер для отходов до момента надлежащей утилизации.
    Примечание: Для повышения эффективности обработки ультразвуком, использовать не более 3 мм образца не поселился в нижней части 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Избыток образца могут быть переданы в отдельную пробирку с помощью пипетки перед началом стадии регидратации выше. Режущий наконечник пипетки с чистым лезвием бритвы может быть использован для предотвращения засорения наконечника пипетки.
  2. Добавить 1,0 мл 50% метанол / фосфатный буфер Твин (PBTw) раствора в пробирку и рок в течение 3 мин.
  3. Удалить раствора метанола в надлежащем контейнер для отходов и промыть 1,0 мкл PBTw дважды. После каждого полоскания, позволяют образец урегулировать, прежде чем делать от PBTw с помощью пипетки.
  4. Добавить 1,0 мл бычьего сывороточного альбумина / фосфатным буферным Tween (BBTw) смешивают в ампулу и породы. Через 3 мин на рокера, позволяют SAMPле урегулировать и снимите BBTw с пипеткой.
  5. Повторите шаг 3,4 два раза, заботящиеся чтобы удалить как можно больше BBTw как можно, не теряя образец после последней стирки.
  6. Добавить 0,5 мл BBTw к трубе и поместите трубку на льду.

4 Озвучивание образца

  1. Установите ультразвукового до 10% максимальной амплитуды и назначить время работы 2 сек постоянной ультразвуком.
    Примечание: Эти настройки являются специфическими для обработки ультразвуком указывается в материалах и оборудования таблице и может потребовать оптимизации для различных sonicators.
  2. Перед обработкой ультразвуком образца, очистить ультразвукового зонда, помещая наконечник зонда в 50 мл коническую пробирку, заполненную деионизированной воды и выполнения обработки ультразвуком для очистки зонда. Сухой ультразвукового зонда с лабораторным ткани после запуска.
  3. Погрузите зонд в микроцентрифужных пробирку, содержащую образец таким образом, чтобы она располагалась примерно от 3 до 4 мм выше образца и начать ультразвуком.
  4. Снимите мicrocentrifuge трубки и поместить его на льду в течение по крайней мере 30 секунд, чтобы рассеивать тепло от ультразвуком и позволяют образец, чтобы поселиться в нижней части трубки микроцентрифужных.
  5. Повторите шаги 4.3 и 4.4 мере необходимости, исходя от возраста образца обрабатывается.
    Примечание: Для оптимального объема образца ультразвуком, эмбрионов моложе 17 ч не требуют ультразвуком, но те, между 17 и 24 часами (этап 17 / раннего L1) требуют двух sonications. Личинки между 24 - 36 (в начале / середине L1), 36 - 48 (СЧ / поздно-L1), 48 - 60 (в начале / середине L2), 60 - 72 (СЧ / поздно-L2), 72 - 84 ( рано-L3), 84 - 96 (в начале / середине L3), 96 - 108 (середина / поздно-L3) ч требуют 5, 9, 11, 13, 15, 18, и 22 sonications соответственно. Смотреть обсуждение дальнейшей разработки на время обработки ультразвуком.
  6. Промыть 1,0 мл BBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать до отвода BBTw с помощью пипетки.
  7. Добавить 1,0 мл BBTw во флакон и рок. Через 3 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и снимите BBTw с пипеткой.
  8. Повторите шаг 4.7 в два раза.

5 Иммуноокрашивание

  1. Блок образец путем добавления 5% нормальной сыворотки разбавленный в BBTw в микроцентрифужных трубки. Удалить блок после качалки в течение 1 часа.
    Примечание: Используйте нормальную сыворотку от вида, в котором генерируются вторичные антитела.
  2. Развести первичных антител к соответствующим рабочей концентрации в 5% нормальной сыворотки решения / BBTw.
  3. Рок образца в начальной O раствора антител / N при 4 ° С или, по крайней мере, 3 часа при комнатной температуре (примерно 22 ° C.
    Примечание: антитела время инкубации и температуры могут различаться. O / N. инкубации при 4 ° С или 3 ч при комнатной температуре, как правило, достаточно. Тем не менее, в течение двух дней инкубационного периода может повысить окрашивания качество, особенно в старых образцов или при низкоаффинные первичные антитела используются. Более длинные инкубации, как правило, проводили при 4 ° С. Аналогичные соображения должны быть сделаны при использовании вторичных антител (см 5,10).
  4. Разрешить образец оседают наДно пробирке. Откачать первичных антител с пипеткой. Сохранить антитела для повторного использования при желании.
  5. Промыть 1,0 мл BBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать до отвода BBTw с помощью пипетки.
  6. Добавить 1,0 мл BBTw во флакон и рок. Через 3 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и удалить BBTw с пипеткой.
  7. Повторите шаг 5,6 пять раз.
  8. Блок выборки добавлением 5% нормальной сыворотке решение / BBTw в микроцентрифужных трубки. Удалить блок после качалки в течение 30 мин до 1 часа.
    Примечание: Этот дополнительный этап блокировки не требуется, но может улучшить качество окрашивания для специфических антител.
  9. Развести вторичные антитела к соответствующим рабочей концентрации в 5% нормальной сыворотки решения / BBTw.
  10. Оберните микроцентрифужную пробирку алюминиевой фольгой для уменьшения обесцвечивания под действием светового излучения. Рок образца в средней раствора антител в течение 12 с 48 ч при 4 ° С или, по крайней мере, 3 часа при комнатной температуре (примерно 22 ° С.
  11. Разрешить образец оседают на дне пробирке. Откачать вторичные антитела с пипеткой.
  12. Промыть 1,0 мл PBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать, прежде чем делать от PBTw с помощью пипетки.
  13. Добавить 1,0 мл PBTw во флакон и рок. Через 5 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и снимите PBTw с пипеткой.
  14. Повторите шаг 5,13 три раза.
  15. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Добавить DAPI разбавляют 1: 1000 в PBTw. Рок образца заворачивали в алюминиевую фольгу в течение 3 мин; затем снимите DAPI решение с помощью пипетки. Промыть пять раз с 1,0 мл PBTw, позволяя образец урегулировать, прежде чем снимать PBTw с пипеткой.
  16. Добавить 80 - 100 мкл 1,4-диазабицикло [2.2.2] октан раствора (DABCO) в микроцентрифужных трубки и хранить при температуре -20 ° C.
    Примечание: Другой глицерина на основе анти-Fade агент может быть заменен на.

6 Анализ

  1. Перед установкой образца на слайды, добавить дополнительный 5 - 10 мкл DABCO / р-фенylenediamine (PPD) Antifade решение микроцентрифужных трубки.
    Примечание: Образец может быть добавлен к слайдов без вскрытия. Объем пробы добавляли к ползуна изменяется в зависимости от размера покровным стеклом. Когда пипеткой образец на слайде, пипетки могут быть обрезаны, используя лезвие, чтобы предотвратить образец стрижку. Часто бывает полезно, чтобы выровнять образец в строках для легкого анализа. Добавление PPD в качестве дополнительного агента Antifade может не потребоваться, но может предотвратить фотообесцвечиванию, если образцы хранятся в долгосрочной перспективе.
  2. Аккуратно поместите стекло крышки скольжения над образца. Тогда, безопасный покровное на месте с помощью лака для ногтей.
  3. Посмотреть установлен образец с помощью флуоресцентной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для демонстрации эффективности обработки ультразвуком на основе иммуноокрашивания в анализе поздней стадии эмбрионального и тканей личинки в месте, эмбрионы дикого типа и личинки были обработаны для иммуноокрашивания яичек, яичников и нервной ткани. Образцы были обследованы с помощью конфокальной микроскопии и представительства Результаты показаны (рисунок 1 и рисунок 2). Результаты показывают, что описано протокол вступает в силу для визуализации морфологических особенностей, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает метод успешно immunostain целевому Drosophila эмбрионального и тканей личинки на месте, тем самым устраняя необходимость для вскрытия. По ранее протоколов для окрашивания ранних эмбрионов 1,2,3, хорионический мембрану удаляют с помощью 50% отбеливателя (NaOCl). Образцы фиксировали в формальдегид и метанол. Поскольку личиночной кутикулы приводит старую образец плавать, весь образец затем проходит через клетки-фильтра, чтобы обеспечить сохранение личинок. Пример сохр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Рут Lehman и Dorthea GoDT который любезно поставляемой Vasa и Traffic Jam антитела. Мы хотели бы признать со Center Блумингтон в Университете Индианы для поддержания предоставленные запасов и развития Studies гибридомные банк, разработанные в рамках эгидой NICHD и ведет университете штата Айова. Мы благодарим всех членов лаборатории Wawersik за их советы и поддержку. Эта работа финансировалась Монро Ученые грантовой программы (для ФП и LB) и NSF предоставить IOS0823151 (к МВт).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Таблица 1: Реагенты и буферы
Фосфатный буфер Triton X-100 (PBTx)Для 5 л: 500 мл PBS 10X, 4,45 л ddH2O, 50 мл Triton 10%. Храните в RT.
Фосфатный буфер физиологический раствор 10X (PBS 10X)На 1 л в dH2O: 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na2HPO4, 2,4 г KH2PO4. Добавьте компоненты и заполните до соответствующего объема. Хранить при температуре 4 °C.
Triton 10%На 50 мл: 5 мл Triton, 5 мл PBS 10X, 45 мл ddH2O. Rock для смешивания. Храните в RT.
PEMS0,1 м трубки (pH 6,9), 2,0 мМ MgSO4, 1,0 мМ EGTA. Храните в RT.
ТрубкиДля 400 мл 0,25 М раствора (pH 6,9): 30,24 г Трубки dH20 NaOH. Растворите трубки в 300 мл dH2O, а затем отрегулируйте pH до 6,9 с помощью NaOH. Доведите общий объем до 400 мл с помощью dH2O и автоклава. Храните в RT.
Формальдегид37% формальдегида по весу в метаноле. Хранить в RT. Хранить смесь отходов формальдегида, гептана и метанола в плотно закрытом контейнере в вытяжном шкафу перед утилизацией в соответствии с рекомендациями учреждения.
ГептанCAS 142-82-5н-гептан. Хранить в RT. Хранить смесь отходов формальдегида, гептана и метанола в плотно закрытом контейнере в вытяжном шкафу перед утилизацией в соответствии с рекомендациями учреждения.
МетанолCAS 67-56-1Хранить в RT. Хранить смесь отходов формальдегида, гептана и метанола в плотно закрытом контейнере в вытяжном шкафу перед утилизацией в соответствии с институциональными рекомендациями.
Фосфатный буфер Tween (PBTw)Для приготовления 1 л: 100 мл PBS 10X, 890 мл ddH2O, 10 мл Tween 10%. Фильтр стерилизовать после добавления всех компонентов. Хранить при температуре 4 °C.
Твин 10%На 50 мл: 5 мл Твин, 5 мл PBS 10X, 40 мл дГ<саб>2О. Камень для смешивания. Храните в RT.
Буфер из бычьей сыворотки альбумин/фосфат Tween (BBTw)Для приготовления 1 л: 100 мл PBS 10X, 890 мл ddH2O, 10 мл Tween 10%, 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA). Добавьте BSA, затем простерилизуйте с помощью 0,2 μ м вакуумная фильтрующая установка. Хранить при температуре 4 °C.
Нормальная козья сыворотка (NGS)ackson ImmunoResearch Laboratories005-000-121Для приготовления 10 мл: Нормальная козья сыворотка 10 мл ddH2O. Добавьте ddH2O во флакон NGS и простерилизуйте с помощью 0,2 μ m syrninge filter. Хранить аликвоты при температуре -20°С.
1,4-диазабицикло[2.2.2]октановое (DABCO)CAS: 281-57-9Для изготовления 100 мл: 25 мл ddH2O, 1 мл Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 г DABCO solid, 3,5 мл 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 мл глицерина. В стакан объемом 250 мл с мешалкой добавьте ddH2O, Tris HCl и DABCO. Перемешайте, а затем добавьте 6N HCl, 10 N NaOH и глицерин. Затем добавляйте 10N NaOH по каплям, пока раствор не достигнет pH 7,5. Кратный. Хранить аликвоты при температуре -20°С.
DABCO +-фенилендиамин (PPD) раствор1,765 мл NaHCO3, 0,353 Na2CO<3/sub>, 0,02 г PPD (CAS: 106-50-3). Растворите PPD в растворе NaHCO3 и растворе NaCO3. Прибавьте 60 и мкм; л PPD раствора до 500 мкм; ДАБКО. Хранить аликвоты при температуре -20°С.
яблочного сокаДля приготовления ~200 тарелок: 45 г агара (CAS#9002-18-0), 45 г сахарного песка (купленный в магазине), 500 мл яблочного сока (купленный в магазине), 15 мл Тегосепт 10%, 1,5 мл ddH2O. Добавьте агар в ddH2O в колбу объемом 4 л и затем автоклавируйте в течение 30 мин. Смешайте яблочный сок и сахар на нагретой тарелке. Постепенно добавляйте смесь яблочного сока в автоклавный агар. Перемешайте на разогретой тарелке для перемешивания, затем разложите 10 мл объемом в 35 мм чашки Петри и дайте постоять при RT для застывания. Хранить при температуре 4 °C.
Тегосепт 10%Для приготовления 100 мл: 10 г Тегосепта, 100 мл этилового спирта. Хранить аликвоты при температуре -20°С.
Дрожжевая паста~50 г сухих активных дрожжей. Постепенно добавляйте ddH2O в стакан с дрожжами, помешивая, до достижения пастообразной консистенции. Хранить при температуре 4 °C.
Таблица 2: Окрашивающие материалы
DAPIInvitrogenD35711:1000, бульон в дозе 5 мг/мл.
Кролик анти-Васа1:250, подарок от Рут Леманн.
Мышиный анти-фасциклин IIIИсследования развития Hybridoma Bank (DSHB)7G101:10
Мышиный анти-1B1Исследования развития Hybridoma Bank (DSHB)1B11:4
Гуневая свинка анти-Traffic Jam1:2500, подарок от Дортеи Годт (Li et al, 2003).
Мышиные анти-ProsperoDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)Prospero MR1A1:10
Крыса анти-ElavDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)7EBA101:30
мышиный анти-RepoDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)8D121:10
Козий анти-кролик Alexa546InvitrogenA110101:500
Козий анти-мышь Alexa488InvitrogenA110291:500
Козья свинья против гунье Alexa633InvitrogenA211051:500
Козья антикрыса Alexa488InvitrogenA110061:500
Таблица 3: Материалы и оборудование
Клетки для мухручной работы; Genesee Scientific Corporationне применяется; Бутылки: 32-130; Предварительно изготовленный каркас: 59-101Изготовлен путем резки прозрачной литой акриловой трубки (диаметром 1 3/4 дюйма) на сегменты высотой 4 дюйма с помощью составной торцовочной пилы со скоростью 400 оборотов в минуту. Ультратонкий экран из нержавеющей стали (был прикреплен к одному торцу ванны с помощью акрилового клея. Альтернативный метод с использованием пустой бутылки из-под еды от мух можно найти в протоколах Drosophila ISBN 0-87969-584-4. Клетки также могут быть приобретены в Genesee Scientific Corporation.
Ультразвуковой аппарат: Цифровой сонификатор Branson 250Модель Брэнсона: Цифровой сонификатор Branson 250
Ультразвуковой зондБрэнсонМодель #: 102C (CE)EDP: 101-135-066; Серийный номер: OBU06064658
Шприцевой фильтрNalgene190-25-200,2 μ m целлюлоза, ацетатный мембранный фильтр
Система визуализации: Вращающийся дисковый конфокальный микроскоп с многоцветным источником света, цифровая ПЗС-камера и программное обеспечение для визуализацииМикроскоп: Olympus, Источник света: Lumen Dynamics, Камера: Q-Imaging, Программное обеспечение для визуализации: Intelligent Imaging Inc.Микроскоп: BX51 с вращающимся диском DSU, Источник света: X-Cite 120Q, Камера: RETIGA-SRV, Программное обеспечение для обработки изображений: Slidebook 5.0
Вакуумный фильтрующий блокNalgene450-00200.2 μ m Мембранный фильтр из нитрата целлюлозы
Тарелки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202(2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи