Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в

12.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51530

⸱

19 июня 2014 г.

 ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich, 2Institut de Recherche pour le Développement (UMR 232), Centre National de la Recherche Scientifique (ERL 5300), Université de Montpellier II

В этой статье

Краткое содержание

Мы предоставляем здесь эффективную и надежную протокол для иммуноокрашивания, флуоресцентная в гибридизация, окрашивания ДНК с последующим количественным, изображений с высоким разрешением в целом монтажа арабидопсис яйцеклеток. Этот метод был успешно использован для анализа хроматина модификации и ядерной архитектуры.

Аннотация

В цветущих растений, судьба клеток переход соматической к репродуктивного отмечен спецификации спор материнских клеток (ГМК) в цветочных органов взрослого растения. Самка SMC (мегаспоры материнская клетка, MMC) отличает в яйцеклетки зачатка и претерпевает мейоз. Выбранный гаплоидны мегаспоры затем подвергается митоза, чтобы сформировать многоклеточный женского гаметофита, которая даст начало гамет, яйцеклетку и центрального ячейку вместе с вспомогательными клетками. Ограниченная доступность из ГМК, meiocyte и женского гаметофита внутри яйцеклетки технически сложным для цитологического и цитогенетического анализа на уровне одной клетки. В частности, прямое или косвенное иммунодетекции сотовых или ядерных эпитопов нарушается плохим проникновением реагентов внутри изображений клеток растений и одноклеточных является наследству отсутствием оптической прозрачности в целом монтажа тканей.

Таким образом, мы разработали эффективный метод для анализа Nuclорганизация уха и модификация хроматина в высоком разрешении одной клетки в целом монтажа встроенных Arabidopsis яйцеклеток. Он основан на рассечения и вложения основных яйцеклеток в тонком слое акриламида гель на предметное стекло. Встроенные яйцеклетки подвергаются химической и ферментативных обработок, направленных на улучшение ясности тканей и проницаемость к иммуноокрашивания реагентов. Эти процедуры сохранить клеточные и организации хроматина, ДНК и белка эпитопы. Образцы могут быть использованы для различных последующих цитологических анализов, в том числе хроматина иммунным окрашиванием, флуоресценции в гибридизация (FISH) и окрашивания ДНК для анализа гетерохроматина. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) изображений, с высоким разрешением, а затем 3D-реконструкции позволяет для количественных измерений при разрешении одноклеточных.

Введение

В цветущих растений, создание репродуктивных линий начинается с дифференциации ГМК, женской MMC и мужской микроспора материнской клетки. ГМК развивается из суб-эпидермального нуцеллярных камере в дистальной части семяпочки зачатка, и микроспора материнская клетка развивается из спорообразующих ткани в пыльников гнезде, которые расположены глубоко внутри цветочных органов 1. ГМК пройти мейоз производить гаплоидные споры, которые затем дают начало к гаметофитов на митоза. Женского гаметофита, или зародышевого мешка, состоит из одной яйцеклетки, одной центральной ячейки, две синергид и три antipodals. Мужского гаметофита, или пыльца, состоит из одного вегетативной клетки и двух сперматозоидов. В то время как мужского гаметофита остается относительно доступным статьям исследование, женский гаметофит встраивается внутрь яйцеклетки, сам заключенный в цветочном пестика, и, таким образом ставит конкретные задачи перед молекулярных и цитологических анализов. Однако в последнее время с помощью лазерамикродиссекции предложил элегантное решение, позволяющее транскриптомных анализирует в ГМК и женских гаметофитного клеток 2-4. В дополнение к экспрессии генов кандидата анализирует, используя, например, РНК в гибридизация или гена-репортера анализов, цитологические анализы позволяет исследовать динамику эндогенных клеточных компонентов, использующих конкретные постоянного сотовой окрашивания или косвенный иммуноокрашивания. В частности, цитогенетический окрашивание с использованием рыбы и окрашивание ДНК вместе с иммунным модификаций хроматина или компонентов хроматина являются центральными подходы для выяснения динамики хроматина и ядерной организации в Arabidopsis 5. Как правило, мейоза влечет за собой конкретные динамику хромосом, который был хорошо исследованы в растительной мужчина meiocytes 6,7; дальнейших крупномасштабных, реорганизация хроматина соты, вероятно, отражает динамический эпигенетическую перепрограммирования был описан во время развития пыльцы 8-10. В противоположность этому, в результатеотносительной недоступности женского meiocyte и гаметофита, эти исследования остаются технически трудно применять, и часто требуют секционирования или ручной вскрытие и ферментативного расщепления (см. ниже). Кроме того, распространены отсутствие оптической прозрачности в целом монтажа является препятствием для изображений с высоким разрешением половых клеток у интактных яйцеклеток.

Классический метод цитологического анализа организации хромосом в целом монтажа яйцеклеток использует окрашивание Фельгену в 11-13. Она включает в себя кислотного гидролиза (с использованием хлорноватистой кислоты) ДНК, что приводит к денатурации белков и, таким образом, вызывает разрушение структуры хроматина. Кроме того, организации хромосом в женских meiocytes и гаметофитного клеток можно наблюдать с помощью DAPI окрашивание и иммуноокрашивания на полу-тонких срезов или расчлененных зародышевых мешков и MMC (см., например, 14-18). Ясно, однако, руководство вскрытие и секционирования может быть трудоемким ипрепятствует на качественном и количественном анализе большого количества хроматина эпитопов.

Здесь мы предлагаем эффективный протокол подготовить большое количество Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для различных вниз по течению окрашивания цитологического в целом монтажа. Короче говоря, бутоны инкубируют в закрепителя решения, ряды яйцеклеток расчленены из пестика и заливали в акриламида на слайде, как это сделано для пыльцы meiocytes 19,20. Встроенные яйцеклетки дополнительно очищен и фиксировали в метаноле, этаноле, и ксилол до клеточной стенки пищеварения и проницаемости. Обсуждаются возможные вариации этих шагов. Образцы затем могут быть использованы для окрашивания ДНК, иммуноокрашивания, и рыба. Режим подготовка является эффективным и позволяет параллельно экспериментальной установки (до 16 слайдов, могут быть получены в день для различных вниз по течению анализа). Лечение описанные включить однородные сигналы в целом монтажа и хорошо сохранились гистологические, сотовой,и ядерная организация в репродуктивных клеток и окружающих нуцеллярных клеток, которые пользуются качественные и количественные сравнения между типами клеток. Калиброванный, CLSM основе с высоким разрешением изображения с последующим 3-мерной реконструкции позволяет значимые количественные измерения флуоресцентных сигналов. Мы успешно использовали эту процедуру для анализа динамики хроматина в дифференциации MMC 21 и разработке женского гаметофита 22; мы представляем здесь репрезентативные результаты анализа гетерохроматина, хроматина иммуноокрашивания, GFP иммуноокрашивания и рыба в целом монтажа яйцеклеток. Мы также считаем, что наш протокол будут пригодны для других тканей и видов растений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эта процедура описана в рабочий процесс на рисунке 1, а установка для вскрытия и вложения тканей представлены на рисунке 2.

1. Тканей Фиксация

  1. Сбор 20-30 плодолистиков в пробирке, содержащей свежеприготовленный БВО фиксирующий буфер на льду.
  2. Закрепите ткань 30 мин при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
  3. Вращайте пробирки, содержащие плодолистиков в фиксатора в настольный микроцентрифуги 1 мин при 400 х г.
  4. Удалить внимательно фиксирующий буфер и добавить 1 мл PBT, поместить пробирки на льду.

2. Вскрытие и внедрение

  1. Подготовьте пять Эппендорф труб друг с 200 мкл свежеприготовленного, 5% акриламида смеси.
  2. Подготовьте пять SuperFrost слайды предварительно очищенную с 70% этанола и помечены карандашом.
  3. Оттепель один аликвоты 20% APS и 20% НПД каждый, на льду.
  4. Возьмите 4-5 плодолистиков с отключения кончиком, местоих на чистую слайд, удалить избыток жидкости.
  5. Сделать продольные разрезы с помощью тонкой иглы и отсоедините пестика стены, чтобы освободить ряды яйцеклеток, как показано рисунке 2, избежать высыхания, покрывая с PBS (не более 10 мкл).
  6. Быстро добавить и смешать 12 мкл НПД, 12 мкл APS с аликвоты 200 мкл акриламида смеси.
  7. Добавить 30 мкл активированного акриламида на рассеченных семяпочек.
  8. Накрыть мм покровным 20 х 20, не говоря полимеризации при комнатной температуре, 45-60 мин.
  9. Удалить покровное лезвием бритвы. На этой стадии образцы можно хранить в течение ночи при 4 ° С в баночку, содержащую Коплин PBS.

3. Обработка ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, кроме 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 и 3.4.3 осуществляются в Коплин банки с 80 мл раствора при химической капот при комнатной температуре. Слайды передаются с плоским наконечником щипцов.

  1. Ткань разъяснения ификсация:
    1. Инкубировать 5 мин в метаноле.
    2. Инкубировать 5 мин в этаноле.
    3. Инкубировать 30 мин в смеси этанол: ксилол (1:1).
    4. Инкубировать 5 мин в этаноле.
    5. Инкубировать 5 мин в метаноле.
    6. Инкубировать 15 мин в метаноле и PBT (1:1), дополненной 2,5% формальдегида.
    7. Промойте 2 х 10 мин в PBT. На данном этапе, слайды могут храниться в течение ночи при 4 ° С.
  2. Клеточная стенка пищеварения:
    1. Оттепель аликвоту клеточной стенки пищеварения смеси на льду.
    2. Возьмите слайд из фляги Коплин, слейте избыток жидкости, поместив его вертикально на бумажное полотенце.
    3. Добавить 100 мкл клеточной стенки пищеварения смеси над акриламида площадку и накройте мм покровным 23 х 46. Повторите эти действия для других слайдов. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С во влажной камере (описанного в материалах).
    4. Вымойте слайды 2 х 5 мин в PBT.
  3. РНКазы А лечение:
    1. Возьмите слайд из фляги Коплин, процедить тыс.е избыток жидкости, как раньше.
    2. Инкубируют каждый слайд с 100 мкл РНКазы А при 100 мкг / мл в PBS с 1% Твин-20 в течение 1 часа при 37 ° С во влажной камере.
    3. Вымойте слайды для 2 х 5 мин в PBT.
  4. После фиксации и пермеабилизации:
    1. После исправить в течение 20 мин в свежеприготовленный PBT-F.
    2. Промыть слайды в течение 10 мин в PBT.
    3. Проницаемыми в течение 2 ч в PBS с 2% Tween-20 при 4 ° С.
    4. Промыть слайды для 2 х 5 мин в PBT.

4. Иммуноокрашивание

Примечание: На этом этапе, оптимальная концентрация первичного антитела должна быть проверена с использованием различных разведений (1:200, 1:500, 1:1000) антител.

  1. Инкубируют каждый слайд с 100 мкл первичного антитела разбавленных в PBS с 0,2% твина-20 в течение 12-24 ч при 4 ° С.
  2. Промыть слайдов в течение 2-4 PBT ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
  3. Применить1:200 вторичное антитело в PBS + 0,2% Tween-20 в течение 24 ч при 4 ° С.
  4. Промыть слайдов в PBT в течение 1 часа при комнатной температуре при легком встряхивании.
  5. Контрастирующая с 10 мкг / мл пропидийиодидом в PBS в течение 15 мин, затем смыть 15 мин в PBS при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
  6. Крепление в анти-замиранием жидкого mountant с добавлением 10 мкг / мл пропидийиодидом. Пусть монтажа средних затвердеть в течение 1 часа до приобретения изображения, CLSM.

5. Количественный изображений

  1. Приобретение изображения:
    1. Получение изображений с высоким разрешением с помощью КЛСМ, в идеале, используя режим сканирования резонанса, который позволяет лучшее сохранение флуоресцентных сигналов над длительной обработки изображений 23, и 63X глицерина погружение линзы.
    2. Проверьте параметры измерения, такие как интенсивность лазерного, усиления обскуры, размер воксела и коэффициентом увеличения в начале эксперимента, чтобы определить стандартную процедуру приобретения строго следовать во всемвсе горки для последовательных количественных измерений.
    3. Проверьте отсутствие перекрестных помех между флуорохромами. Если присутствует, установить последовательное сканирование. Получение изображений передачи отдельно, а не одновременно.
    4. Выполните серийный, трехмерное сканирование изображения с максимально возможным разрешением в х и у размеров и с 2x передискретизации в измерении г (правило Найквиста).
  2. Обработка изображений:
    1. Реконструировать серийные изображения в трех измерениях, используя коммерческую или открытое программное обеспечение.
    2. Определить контурные поверхности вокруг каждого ядра (или ячейки), представляющие интерес в 3D.
    3. Количественно флуоресценции в каждом канале в виде суммы интенсивностей пикселей в каждом объекте.
    4. Экспортировать данные в Excel для статистического анализа. Нормализовать антител сигналы против окрашивания сигналов например ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы предоставляем надежную протокол для подготовки масштабной и переработки Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания в целом монтажа. Благодаря вложению, семяпочки сохранить 3-мерную структуру (рис. 3). Кроме того, обработка ткани в том числе оптического разъяснения позволяет визуализации субклеточных структур в высоком разрешении. Рисунок 4 показывает окрашивание ДНК в целом монтажа яйцеклетки зачатков где гетерохроматина появляется как яркий, хорошо оп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В цветущих растений, женская репродуктивная линия окружена несколькими слоями клеток, включая нуцеллуса и яйцеклетка покровы, таким образом отдавая цитологический окрашивание в целом монтажа технически сложной задачей. Здесь мы представляем эффективную протокол, позволяющий подготовку и обработку большого количества яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания таких как иммуноокрашивания, окрашивание ДНК и флуоресценции в гибридизация в целом монтажа. Мы успешно использовали его для анализа женской реп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Ули Гроссниклауса (Университет Цюриха) за техническую и финансовую поддержку. Мы благодарны Валерии Гальярдини, Кристофу Эйхенбергеру, Артуро Боланосу и Петеру Копфу за общую лабораторную поддержку. Это исследование финансировалось Цюрихским университетом, грантами Швейцарского национального фонда CB (31003A_130722) и Ули Гроссниклаусом (31003A_141245 и 31003AB-126006), а также Национальным агентством исследований DG (программа ANR-BLANC-2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Растворы
BVO Фиксирующий буфер (на основе32)2 мМ EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) формальдегида, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT-F1x PBT, 2,5% (v/v) формальдегид
30% акриламид:бисакриламид3 г акриламида, 0,33 г бисакриламида, 1x PBS (приготовьте 10 мл, храните при 4°; C)
200 мл 5% акриламидной смеси в PBS34 мл 30% акриламид:бисакриламид, 166 мл 1x PBS (сделать свежим из 30% запаса)
20% персульфтеаммония, 0,2 г персульфта аммония, 1 мл стерильной воды (приготовить аликвоты с 1 мл и хранить при -20 °°; В)
20% сульфит0,2 г сульфита натрия, 1 мл стерильной воды (приготовьте аликвоты по 1 мл и храните при -20°С; C)
ферментов клеточной стенки0,5% (w/v) целлюлазы, 1% (w/v) дризелазы, 0,5% (w/v) пектолиаза
Реагенты и материалы
ФормальдегидSigma-AldrichF1635
DMSOSigmaD5879
TrisAmaresco0497
ЭтанолSchaurlauET00102500
МетанолSchaurlauME03062500
ксилолROTH4436.1
целлюлазаSigma1794
ДризелазаSigmaD8037
пектолиазаSigmaP5936
Tween-20Merck8.22184.0500
EGTASigmaE-4378
акриламидSigmaA-3553
бисакриламидSigmaM2022токсичный
персульфат аммонияSigmaA9164
сульфит натрияFluka71988
Анти-триметил-гистон H3 (Lys4)Север штата07-473
Анти-монометил-гистон H3 (Lys27)Север штата07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)Молекулярный зондA11008
ProlongGoldInvitrogenP36934
Пропидиумий йодидSigmaP4170токсичный
DAPISigmaD9542токсичная
РНКазаA Roche10109169001
банка CoplinHuber & CO10.055
ЩипцыDUMONT BIOLOGY
ШейкерHeidolph543-12310-00-0
Влажная камераПластиковый ящик с влажным бумажным полотенцем внутри, в ящик вставляется пластиковая опора для поддержки горок и удержания горок от воды.
Горка Superfrost PlusThermo FisherJ1800AMNZMenzel-Glä ser
FISH Tag DNA KItInvitrogenF32947
GFP boosterChromotek
натрия Смесь

Ссылки

  1. Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  3. Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
  4. Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
  5. Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
  6. Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
  7. Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
  8. Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
  9. Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
  10. Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
  11. Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
  12. Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
  13. Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
  14. Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
  15. Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
  16. Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
  17. Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
  18. Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
  19. Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
  20. Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
  21. She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
  22. Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
  23. Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
  24. Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
  25. Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
  26. Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
  27. Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
  28. Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
  29. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
  30. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  31. Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Семяпочки Arabidopsisанализ целых образцоводноклеточная визуализацияконфокальная микроскопияфлуоресцентная гибридизация in situпроницаемость тканейпротокол иммуноокрашивания3D-реконструкция
Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.