Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в Arabidopsis

Summary

Мы предоставляем здесь эффективную и надежную протокол для иммуноокрашивания, флуоресцентная в гибридизация, окрашивания ДНК с последующим количественным, изображений с высоким разрешением в целом монтажа арабидопсис яйцеклеток. Этот метод был успешно использован для анализа хроматина модификации и ядерной архитектуры.

Abstract

В цветущих растений, судьба клеток переход соматической к репродуктивного отмечен спецификации спор материнских клеток (ГМК) в цветочных органов взрослого растения. Самка SMC (мегаспоры материнская клетка, MMC) отличает в яйцеклетки зачатка и претерпевает мейоз. Выбранный гаплоидны мегаспоры затем подвергается митоза, чтобы сформировать многоклеточный женского гаметофита, которая даст начало гамет, яйцеклетку и центрального ячейку вместе с вспомогательными клетками. Ограниченная доступность из ГМК, meiocyte и женского гаметофита внутри яйцеклетки технически сложным для цитологического и цитогенетического анализа на уровне одной клетки. В частности, прямое или косвенное иммунодетекции сотовых или ядерных эпитопов нарушается плохим проникновением реагентов внутри изображений клеток растений и одноклеточных является наследству отсутствием оптической прозрачности в целом монтажа тканей.

Таким образом, мы разработали эффективный метод для анализа Nuclорганизация уха и модификация хроматина в высоком разрешении одной клетки в целом монтажа встроенных Arabidopsis яйцеклеток. Он основан на рассечения и вложения основных яйцеклеток в тонком слое акриламида гель на предметное стекло. Встроенные яйцеклетки подвергаются химической и ферментативных обработок, направленных на улучшение ясности тканей и проницаемость к иммуноокрашивания реагентов. Эти процедуры сохранить клеточные и организации хроматина, ДНК и белка эпитопы. Образцы могут быть использованы для различных последующих цитологических анализов, в том числе хроматина иммунным окрашиванием, флуоресценции в гибридизация (FISH) и окрашивания ДНК для анализа гетерохроматина. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) изображений, с высоким разрешением, а затем 3D-реконструкции позволяет для количественных измерений при разрешении одноклеточных.

Introduction

В цветущих растений, создание репродуктивных линий начинается с дифференциации ГМК, женской MMC и мужской микроспора материнской клетки. ГМК развивается из суб-эпидермального нуцеллярных камере в дистальной части семяпочки зачатка, и микроспора материнская клетка развивается из спорообразующих ткани в пыльников гнезде, которые расположены глубоко внутри цветочных органов ^1. ГМК пройти мейоз производить гаплоидные споры, которые затем дают начало к гаметофитов на митоза. Женского гаметофита, или зародышевого мешка, состоит из одной яйцеклетки, одной центральной ячейки, две синергид и три antipodals. Мужского гаметофита, или пыльца, состоит из одного вегетат....

Protocol

Эта процедура описана в рабочий процесс на рисунке 1, а установка для вскрытия и вложения тканей представлены на рисунке 2.

1. Тканей Фиксация

1. Сбор 20-30 плодолистиков в пробирке, содержащей свежеприготовленный БВО фиксирующий буфер на льду.
2. Закрепите ткань 30 мин при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
3. Вращайте пробирки, содержащие плодолистиков в фиксатора в настольный микроцентрифуги 1 мин при 400 х г.
4. Удалить внимательно фиксирующий буфер и добавить 1 мл PBT, поместить пробирки на льду.

2. Вскрытие и внедрение

Results

Мы предоставляем надежную протокол для подготовки масштабной и переработки Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания в целом монтажа. Благодаря вложению, семяпочки сохранить 3-мерную структуру (рис. 3). Кроме того, обработка ткани в том числе оптического разъяснения позволяет визуализации субклеточных структур в высоком разрешении. Рисунок 4 показывает окрашивание ДНК в целом монтажа яйцеклетки зачатков где гетерохроматина появляется как яркий, хорошо оп.......

Discussion

В цветущих растений, женская репродуктивная линия окружена несколькими слоями клеток, включая нуцеллуса и яйцеклетка покровы, таким образом отдавая цитологический окрашивание в целом монтажа технически сложной задачей. Здесь мы представляем эффективную протокол, позволяющий подготовку и обработку большого количества яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания таких как иммуноокрашивания, окрашивание ДНК и флуоресценции в гибридизация в целом монтажа. Мы успешно использовали его для анализа женской реп.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Растворы
BVO Фиксирующий буфер (на основе32)			2 мМ EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) формальдегида, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5% (v/v) формальдегид
30% акриламид:бисакриламид			3 г акриламида, 0,33 г бисакриламида, 1x PBS (приготовьте 10 мл, храните при 4°; C)
200 мл 5% акриламидной смеси в PBS			34 мл 30% акриламид:бисакриламид, 166 мл 1x PBS (сделать свежим из 30% запаса)
20% персульфте			аммония, 0,2 г персульфта аммония, 1 мл стерильной воды (приготовить аликвоты с 1 мл и хранить при -20 °°; В)
20% сульфит			0,2 г сульфита натрия, 1 мл стерильной воды (приготовьте аликвоты по 1 мл и храните при -20°С; C)
		ферментов клеточной стенки	0,5% (w/v) целлюлазы, 1% (w/v) дризелазы, 0,5% (w/v) пектолиаза
Реагенты и материалы
Формальдегид	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Этанол	Schaurlau	ET00102500
Метанол	Schaurlau	ME03062500
ксилол	ROTH	4436.1
целлюлаза	Sigma	1794
Дризелаза	Sigma	D8037
пектолиаза	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
акриламид	Sigma	A-3553
бисакриламид	Sigma	M2022	токсичный
персульфат аммония	Sigma	A9164
сульфит натрия	Fluka	71988
Анти-триметил-гистон H3 (Lys4)	Север штата	07-473
Анти-монометил-гистон H3 (Lys27)	Север штата	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Молекулярный зонд	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Пропидиумий йодид	Sigma	P4170	токсичный
DAPI	Sigma	D9542	токсичная
РНКаза	A Roche	10109169001
банка Coplin	Huber & CO	10.055
Щипцы	DUMONT BIOLOGY
Шейкер	Heidolph	543-12310-00-0
Влажная камера			Пластиковый ящик с влажным бумажным полотенцем внутри, в ящик вставляется пластиковая опора для поддержки горок и удержания горок от воды.
Горка Superfrost Plus	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek