Method Article

Открывая белковых взаимодействий и Характеризуя Protein функций с помощью HaloTag технологии

DOI:

10.3791/51553

⸱

July 12th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Promega Corporation, 2MS Bioworks LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HaloTag технология представляет собой многофункциональный технология, которая показала значительных успехов в изоляции больших и малых белковых комплексов из клеток млекопитающих. Здесь мы выделить преимущества этой технологии по сравнению с существующими альтернативами и продемонстрировать его полезность для изучения многочисленные аспекты функции белка внутри клеток эукариот.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования в протеомики взорвалась в последние годы с развитием возможностей масс-спектрометрии, которые привели к характеристике многочисленных протеомов, в том числе от вирусов, бактерий и дрожжей. Для сравнения, анализ протеома человека отстает, частично из-за огромного количества белков, которые должны быть изучены, но и сложности сетей и взаимодействий них настоящих. Чтобы специально решать проблемы понимания человеческого протеома, мы разработали HaloTag технологии для изоляции белка, особенно сильным для изоляции мультибелковых комплексов и позволяет более эффективно захват слабых или переходных взаимодействий и / или белков в низкой численности. HaloTag является генетически закодированы слитый белок тег, предназначенный для ковалентного, конкретные, и быстрое иммобилизации или наклеивания этикеток белков с различными лигандами. Используя эти свойства, многочисленные приложения для клеток млекопитающих были разработаны для характераИзе функцию белка и здесь мы представляем методологии в том числе: белковых выпадающие меню, используемых для открытия новых взаимодействий или функциональных анализов и клеточной локализации. Мы находим значительные преимущества в скорости, специфичности и ковалентной захвата слитых белков на поверхности для протеомного анализа по сравнению с другими традиционными нековалентных подходы. Мы демонстрируем эти и широкий полезность технологии с использованием двух важных эпигенетических белки в качестве примеров, человеческий bromodomain белковых BRD4 и гистондеацетилазы HDAC1. Эти примеры демонстрируют мощь этой технологии в обеспечении открытие новых взаимодействий и характеризующих клеточную локализацию у эукариот, которая будет вместе Дальнейшее понимание функциональных протеомики человека.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание клеточной функции, ответ на стимулы, а также изменения в области развития и / или болезненных состояний, неразрывно связано с де-свертка протеоме на протяжении всех этих различных динамических состояний 1,2. Многое было сделано, чтобы понять протеома низших организмов, однако, учитывая количество белков и все возможные взаимодействия, это было очень сложным в решении протеома человека 1,3-7. Достижения в области масс-спектрометрии значительно позволило способность проводить эти исследования, и здесь мы представляем дополнительный и значительный прогресс с развитием технологии HaloTag как для эффективного захвата белковых комплексов и функциональные характеристики белков человека из клеток млекопитающих 8-10. Эта технология недавно было показано в ряде исследований, является критическим фактором для открытия важных взаимодействий, что позволяет понимания романа функции белка и understandiнг болезни 11-13.

Гибридный белок HaloTag изначально был разработан для решения несколько задач традиционных тегов сродства и антител по сравнению с захвата белка, очистки, и маркировки 8-10. В почти всех методов захвата белка и очистки, существует нековалентных шаг взаимодействие, которое используется для обогащения конкретного белка 14. На этой стадии, белок и / или комплекс может отделять за счет диффузии, особенно если процесс требует часа вместо минут. Для решения этой проблемы, слитый белок был специально разработан для быстро и необратимо взаимодействовать с его лигандами, которые могут быть либо частицы, поверхности, или флуорофоров 9. Поэтому, как только она связана с его лигандом, это остается связанным, который является одним из самых дифференцирующим фактором по сравнению с другими тегами сродства. Также продемонстрировано здесь, является способностьдля решения различных биологических вопросы с одним конструкции, что возможно путем чередования лиганды 9 (рис. 1). Например, чтобы допросить белковых взаимодействий или функцию, поверхностные лиганды используются для захвата белка или комплексов (рис. 1). В отдельном эксперименте, то же слитый белок может быть помечены флуоресцентно изучать клеточную локализацию, торговлей или белкового обмена (рис. 1). Важно помнить, однако, что как только лиганд связан, является ли это поверхностный или флуорофор, она является необратимым, и поэтому другие лиганды не может быть впоследствии связаны в том же эксперименте.

Анализ существующих технологий к карте белковых взаимодействий выявить трудности для эффективного изолировать специфические взаимодействия, в том числе те, которые являются более переходных или находятся в нижней изобилии 1,6,7,14,15. Кроме того, недавняя работа многочисленной группыс показывает обеспокоенность тем, что в рамках традиционных методов изоляции, особенно в области человеческих протеомики, существует значительное количество белковых примесей, которые могут маскировать сигналы от истинных interactors в масс-спектрометрического анализа 16. Свойства, разработанные для белка HaloTag и его совместно разработанные адрес смолы а эти проблемы. В протокол для сложных Pulldowns (рис. 1), связывание комплексов может быть достигнуто в течение 15 мин, и содействие сложный захват и снижение уровней неспецифического связывания 8. Кроме того, необратимо привязки позволяет эффективно захвата низких белков численности и дает возможность использования гораздо меньшим количеством клеток, снова уменьшения фона 8. После того, как захват комплексов устанавливается, протокол включает в себя мягкие условия стирки для поддержания сложной целостности. Элюцию захваченных комплексов может быть выполнена двумя способами и выбору, какой метод диктуется целью вниз по течению анальныйлиз. Если желание заключается в анализе или обнаружить взаимодействующих белков методом вестерн-блоттинга или масс-спектрометрии, то рекомендуется для элюирования комплексы с денатурирующих таких как SDS или мочевины (рис. 1). Это особенно выгодно для масс-спектрометрии как белок, слитый с первоначально HaloTag, названный белок приманки, останется за границу к смоле и, следовательно, не будет доминировать популяцию пептидов, обнаруженных в масс-спектрометрии. Это также означает, однако, что белок приманки, скорее всего, не будет видно при анализе вестерн-блот, значительная разница в качестве по сравнению с другими нековалентными очищения сродства или коллег по immunoprecipitations. Если цель состоит в том, чтобы очистить комплекс нетронутыми, чтобы быть использованы для функциональных исследований, элюирование может быть выполнена с использованием TEV (Tobacco Etch Вирус) протеазу, которая признает родственным последовательность, кодируемую расщепления между слитого белка и белка приманки (рис. 1). ТHESE образцы также могут быть проанализированы методом масс-спектрометрии, но, как показано позже, они будут содержать значительное количество белка приманки, которые могут помешать обнаружению нижней изобилии, определенные interactors.

Здесь мы представляем раскрывающиеся и визуализации протоколы, применяемые к двум важным терапевтических белков, в bromodomain белка BRD4 и гистондеацетилазы, HDAC1 17. Мы показали, с этих примерах взаимодействия с ожидаемыми партнеров, как определено масс-спектрометрии, ферментативной активности после сложного изоляции для HDAC1, и надлежащего клеточной локализации для обоих. Вместе эти результаты демонстрируют многофункциональный характер и силу технологии для характеристики эукариотических белковых взаимодействий и функции.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Ниже протокол может быть использован с любым HaloTag синтеза и в любой клеточной линии выбора стабильно или временно трансфицированных. Для этих примеров, мы дадим протоколы для кратковременной трансфекции HaloTag слияний в HEK293T или HeLa клеток. Для всех экспериментов, мы рекомендуем использовать только для управления белка.

1. Fusion Экспрессия белка Тест

  1. Получить слитый белок конструкцию:
    1. Получить предварительно сделанный HaloTag фьюжн вектор или построить на имеющихся векторов. Для получения дополнительной информации о доступных конструкций, пожалуйста, см. Таблицу специфических реагентов.
    2. Если сделать любой клон, рекомендуется, чтобы упорядочить проверки ДНК.
  2. Тестирование выражение гибридного белка и контроля:
    1. Для каждого образца готовят 250 мкл 1X SDS красителем буфера (60 мМ трис-HCl рН 6,8, 0,75 мМ бромфеноловый синий, 12,5% глицерина, 100 мМ дитиотреитола, 0,5% SDS).
    2. Для каждого слитого белкаи контроль, плиты 0,5 мл HEK293T или HeLa клеток в их соответствующие средства массовой информации при плотности 2-4 × 10 5 клеток / мл в стандартной 24-луночный планшет.
    3. Выдержите в течение 18-24 ч при 37 ° С и 5% CO 2, то трансфекции в соответствии с рекомендациями.
    4. 24 часа в сутки после трансфекции, добавить 0,5 мкл 5 мМ тетра-метил родамином (TMR) лиганда в средствах массовой информации в каждой лунке и осторожно перемешать пластину.
    5. Инкубировать трансфицированные клетки, содержащие лиганд в течение 15 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
    6. Аспирируйте прочь СМИ лиганд и мыть каждую лунку клеток мягко 1 мл РТ PBS.
    7. Аспирируйте от PBS и выполнить второй мыть с 1 мл РТ PBS.
    8. Удалить PBS и добавить 200 мкл 1X SDS буфера для загрузки красителя непосредственно к клеткам.
    9. Внесите лизат от пластины в 1,5 мл пробирку Эппендорф.
    10. Отварить лизата в течение 5 мин при 95 ° С
    11. Удаление 5-10 мкл реакции и нагрузки на SDS-PAGE гель.
    12. Используйте флуоресцентный сканер обнаружения(TMR Возбуждение: 555 нм, эмиссия: 585 нм) для обнаружения полосы. Используйте флуоресцентные белковых маркеров в качестве стандартов.
    13. Если флуоресцентный сканер обнаружения недоступен, выполнять вестерн-блоттинга с использованием антител против либо белка приманки или слитый белок тега для обнаружения экспрессии слитого белка.

2. Белки Pulldowns

  1. Подготовка временно трансфицированных клеток:
    1. Для каждого слияние или контроль подготовить один 15 см блюдо с 30 мл клеток в 3-4 х 10 5 клеток / мл или 1-1,2 х 10 7 клеток всего за конструкта.
    2. Инкубировать в течение 18-24 ч при 37 ° С и 5% СО 2, то трансфекции построить, как рекомендовано.
    3. После 24-48 ч после трансфекции, извлекайте носитель и осторожно промыть слой клеток с 20-25 мл ледяной PBS.
    4. Удаление PBS мыть, а затем добавить 25-30 мл 4 ° С охлажденным PBS и осторожно очистить клетки от пластины.
    5. Сбор клеток в конических труб и CentriFuge в течение 5-10 мин при 2000 мкг в и 4 ° С.
    6. Удалите супернатант и поместить осадок клеток при -80 ° С в течение как минимум 30 мин или более 6 месяцев.
  2. Сбалансированность смолы HaloLink:
    1. Для каждого слитого или контрольного образца, готовят 12 мл смолы Уравновешивание / промывочного буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,005% и IGEPAL СА-630). Примечание: Очень важно, чтобы сделать и использовать смолы уравновешивающим буфером в 12 часов, как разбавленного IGEPAL CA-630 не является стабильным и эффективным за этот период времени.
    2. Аккуратно встряхните или перемешайте смолу для получения однородной суспензии.
    3. Для каждого выпадающем эксперимента, обойтись 200 мкл смолы в 1,5 мл микропробирок.
    4. Центрифуга в течение 1 мин при 800 мкг (например, 3000 оборотов в минуту в микроцентрифуге), затем осторожно удалить и отбросить супернатант (этанол), не нарушая смолы в нижней части трубки.
    5. Добавить 800 мкл смолы уравновешивания / Waш буфер и тщательно перемешать переворачивая пробирку несколько раз.
    6. Центрифуга в течение 2 мин при 800 х г, затем осторожно снять и отбросить супернатант.
    7. Повторите шаги 2.2.5 и 2.2.6 два более раз в общей сложности 3 стирок.
    8. Не снимайте окончательный мытье или супернатант до готовности добавить клеточные лизаты, описанные ниже (шаг 2.3.8), чтобы предотвратить смолы от высыхания.
  3. Связывание и стиральная термоядерных комплексов:
    1. Для каждого образца готовят 500 мкл буфера для лизиса млекопитающих (50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% дезоксихолата Na) и 1 мл 1X TBS буфере (100 мМ Трис-HCl рН 7,5 и 150 мМ NaCl).
    2. Оттепель ячейки гранул и ресуспендируют в 300 мкл млекопитающих буфера для лизиса с помощью пипетки вверх и вниз или кратко встряхиванием.
    3. Добавить 6 мкл 50X ингибитор протеазы коктейль (800 мкг / мл бензамидина HCl, 500 мкг / мл фенантролин, 500 мкг / мл апротинина, 500 мкг / мл лейпептина, 500 и #. 181; г / мл пепстатина A, 50 мМ PMSF) Примечание: протеазы коктейли, которые включают AEBSF не могут быть использованы, поскольку они мешают связывания слитый белок тег.
    4. Добавить 3 мкл ДНКазы RQ1 и инвертировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Dounce со стеклянной гомогенизатор 2,0 мл размера; . 25-30 ударов на льду, или пройти клетки через 25 или 27 G иглой в 5-10 раз для завершения лизиса Примечание: Озвучивание не рекомендуется, поскольку комплексы могут развалиться и перегрева может повлиять на тег активность слитого белка.
    6. Центрифуга при 14000 х г в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы очистить лизата.
    7. Трансфер четкое лизат, приблизительно 300 мкл общего объема, в новую пробирку и место на льду.
    8. Добавить очистить лизата дополнительные 700 мкл 1X TBS буфера и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
    9. Возьмем, уравновешенную смолы трубки полученного на стадии 2.2.8 и удалить последней промывки / супернатант из смолы, не нарушая смолы в нижней части трубки.
    10. Добавить в каждой ЕПбыть смолы, в 1 мл разведенного лизата.
    11. Инкубируют при перемешивании на ротатора трубки (или нежной смеситель) в течение 15 мин при 22 ° С Примечание: Осаждение из смолы в течение этого времени снижает эффективность связывания. Если связывания при 4 ° С желательно, сделать это путем перемешивания в течение 1 часа.
    12. Центрифуга смолы трубы в течение 2 мин при 800 х г и отбросить супернатант.
    13. Добавьте 1 мл смолы Уравновешивание / промывочного буфера, сделанные на этапе 2.2.1 и тщательно перемешать путем обращения смолы трубку рукой несколько раз.
    14. Центрифуга смолы трубы в течение 2 мин при 800 х г и выбросьте мыть.
    15. Повторите шаги 2.3.12 следуют 2.3.14 еще три раза.
    16. Добавьте 1 мл смолы Уравновешивание / промывочного буфера и инкубировать при 22 ° С в течение 5 мин с постоянным вращением.
    17. Центрифуга смолы трубы в течение 2 мин при 800 х г и выбросьте мыть.
    18. В зависимости от конечного применения (см. Введение для дальнейшего объяснения), переход либо разделе 2.4 или 2.5.
  4. SDS элюирования для денатурирующих гелях, западных пятнами, или масс-спектрометрии:
    1. Ресуспендируют смолы из каждого образца в 50 мкл буфера для элюции SDS (1% ДСН и 50 мМ Трис-HCl рН 7,5)
    2. Встряхнуть пробирки при комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Центрифуга течение 2 мин при 800 XG и передачи элюатов в свежие пробирки для анализа.
    4. Для вестерн-блоттинга или серебро пятно геля, нагрузка 5-10 мкл на SDS денатурирующем геля.
    5. Для масс-спектрометрии, сохранить 40 мкл каждого образца при -20 ° С
  5. ТРВ протеазы элюирования для функциональных анализов, западных пятнами, или масс-спектрометрии:
    1. После удаления последней промывки смолы ресуспендируют в 50 мкл буфера ProTEV расщепления и 30 единиц TEV фермента.
    2. Инкубировать при 25 ° C при встряхивании в течение 1 часа.
    3. Центрифуга в течение 2 мин при 800 х г.
    4. Трансфер элюата в свежие пробирки.
    5. Образец Хранить при температуре 4 ° С в течение немедленного использования в функциональных анализов.

3.Сотовый изображений флюоресцентно меченых гибридных белков Использование цитоплазматической и ядерной проницаемой лиганд

  1. Трансфекции, этикетка, и изображения клетки:
    1. В 8 и патрон покровного стекла для каждого гибридного белка или контролем, пластина 400 мкл HeLa клеток в их соответствующие средства массовой информации в каждую лунку при плотности 1-2 х 10 5 клеток / мл.
    2. Выдержите в течение 18-24 ч при 37 ° С и 5% CO 2, то трансфекции в соответствии с рекомендациями.
    3. 18-24 ч после трансфекции, развести TMR лиганд 1:200 в соответствующих клеточных СМИ, затем добавить 100 мкл этого раствора в каждую лунку и осторожно перемешать.
    4. Инкубировать трансфицированные клетки, содержащие лиганд в течение 15 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
    5. Прочь СМИ Аспирируйте содержащие лиганд и заменить 500 мкл соответствующих средствах массовой информации, не имеющих слитого белка тегов лиганд, который был предварительно нагревают до 37 ° С
    6. Повторите два раза в общей сложности три раза.
    7. Положите клетки обратно в инкубатор (376, C и 5% CO 2) в течение 30 мин.
    8. Аспирируйте от средств массовой информации и заменить 500 мкл соответствующих средствах массовой информации, который был предварительно нагревают до 37 ° С
    9. Изображение на микроскопе, используя соответствующие параметры измерения (TMR возбуждения: 555 нм, эмиссия: 585 нм).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При работе с любой новой слитого белка, важно, чтобы первый тест для экспрессии этого белка после трансфекции, а также подтвердить, что белок соответствующую молекулярной массы производится. Как слитые белки HaloTag может быть флуоресцентно меченый и ковалентно с проницаемыми или в зависимости от локализации, непроницаемых лигандов, можно быстро определить выражение путем применения клеточных лизатов в денатурирующих гель-электрофореза с последующим сканированием на fluorimager. Используя протокол, описанный в разделе 1.2, выражение Halo-BRD4 (189 кДа) и только контроля HaloTag (Ctrl) наблюдается (34 кДа, рис. 2А). Как уже упоминалось в протоколе, выражение слитых белков также могут быть обнаружены с помощью традиционных западных помарки с анти-HaloTag антител, или если они имеются в наличии, антитела к белку приманки. Если это возможно, рекомендуется использовать люминесцентные лиганд вместо как это является более конкретным, быстрее и проще тдля обнаружения антител хан, а также количественное 10.

После выражение надлежащего полноразмерного белка, слитого проверяется, белковые Pulldowns может быть выполнена. Показано на рисунке 2B являются серебряные окрашенные гели биологических повторах Halo-BRD4 и Ctrl Pulldowns элюированных SDS (Протокол раздел 2.4), которые демонстрируют высокую воспроизводимость. Гели пятно серебра показывают значительное количество белков можно найти, чтобы взаимодействовать с белком BRD4 и очень низким фона в контроле (рис. 2В). Как уже упоминалось во введении, в этом процессе вымывания, Halo-BRD4 не будет элюировали из смолы, пока она остается ковалентно связаны. Таким образом, существует не является существенным полоса при этом молекулярной массой быть обнаружены в Окрашивание серебром (рис. 2В) или Вестерн-блот (данные не показаны). Чтобы определить, если эти белки являются специфическими для BRD4, жидкостной хроматографии масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) проводили на Cомплекс смесь, полученную после SDS элюирования. Показано на рисунке 2C спектральные графы и нормированная спектральная фактором изобилие (NSAF) значения для известных interactors из BRD4 18-20 найденных при анализе масс-спектрометрии Halo-BRD4. Высокая обилие компонентов из pTEFb 18,20, а также в BRD9 19 белка подтвердить конкретную захват BRD4 комплексов. По прогнозам серебряных пятен гелей (рис. 2В), множество других белков, также были определены как потенциальные interactors из BRD4, что не были замечены в контроле (данные не представлены). Поскольку эти ранее неизвестные, они должны быть независимо проверены другими методологиями, чтобы подтвердить, действительно ли белок является истинным Interactor, и если да, если это прямо или косвенно связаны с BRD4.

Изолированные комплексы также могут быть изучены на активность; он рекомендовал для элюирования комплексы с использованием TEV протеазы (Протокол раздел 2.5), так что они поддерживают functionaliти. В фигуре 3А, серебряной окраски геля Halo-HDAC1 выпадающих комплексов, освобожденных из смолы, используя TEV протеазы показана. Как TEV протеазы будет расщеплять в линкерной области между слитого белка тега и его партнера слияния, значительных количеств белка приманки, в этом случае HDAC1, наблюдаются (фиг.3А). Чтобы определить, является ли это фракция содержит HDAC1 активностью, элюированные образцы были испытаны TEV в люминесцентного анализа HDAC, HDAC-Glo 21. Как показано на фиг.3В, образцы HDAC1 Pulldown показали высокий уровень активности HDAC1 (колонка 1), которая была специально ингибируется известного ингибитора HDAC, SAHA 22 (колонка 2). В качестве контроля для дополнительной демонстрации специфичности, не ингибирование HDAC не наблюдалось со связанной Sirtuin семьи ингибитора EX-527 22 (колонка 3) и никакой сигнал не был обнаружен с помощью буфера в одиночку без образца HDAC1 выпадающего добавлено (колонка 4).

Важным компонентом функцииаль протеомика и понимание комплексы, также понимая локализации белка и / или торговлей. Как эти конструкции же слияния может быть помечены флуоресцентно внутри клеток, мы контролировали их локализации с использованием изображений конфокальной. После протокола в разделе 3, HeLa клетки временно трансфицированные Halo-BRD4 (рис. 4а) и Halo-HDAC1 (рис. 4В) были помечены флуоресцентно с лиганда ПМР и образ. Как показано на фиг.4А и 4В, и локализована в ядре, как ожидалось 17. Эти данные показывают, что присутствие тега не изменяет физиологическую клеточную локализацию его партнерами синтеза.

figure-results-1
Рисунок 1. Схема белка пулдауна и конфокальной визуализации приложений. Использование в качестве Ингл построить несколько приложений для понимания функции белка в клетках млекопитающих возможны. Для всех, слитая конструкция Halo либо стабильно или временно выражается в прикрепленных или суспензии клеток млекопитающих. Для белкового комплекса Pulldowns, клетки лизируют, комплексы ковалентно снятые на смолы и элюируют через любой SDS элюирования (левый путь) или TEV расщепления (справа тропа). SDS элюирования рекомендуется для приступить к масс-спектрометрического анализа, в то время как ТРВ расщепление является оптимальным для выполнения функционального анализа. Для характеристики выражение, клеточную локализацию, события торговли людьми, или белкового обмена, живые клетки, выражающие слитые белки флуоресцентно помечены и дальнейшему анализу на гелях SDS-PAGE или использованием изображений конфокальной. Обе клеточные проницаемые или непроницаемые флуоресцентные лиганды доступны в зависимости от локализации или презентации слитого белка в клетке.

На рис 2 "FO: содержание-шир =" 6 дюймов "Первоначально" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Выражение Рисунок 2. Halo-BRD4 белок, пулдаун, и масс-спектрометрический анализ. Гели (А) SDS страница, показывающая выражение Halo-BRD4 гибридного белка, 189 кД, и Halo гибридного белка тега только, 34 кД, контроля (Ctrl) в пределах HEK293T сотовой лизата с надписью с ПМР лиганда (Протокол раздел 2.1). Гели были отсканированы с fluorimager для обнаружения и был использован флуоресцентный маркер молекулярной массы. (В) Серебро пятно гели биологических повторяет для Pulldowns из Halo-BRD4 и Ctrl образцов элюированных SDS. Молекулярные размеры вес указаны для геля. (С) Спектральные отсчетов (левая панель) и нормированные спектральные факторы обилие (NSAF) значения (правая панель) на долю которых приходится белка молекулярную массу белков, выявленных в масс-спектрометрического анализа биологических повторах Halo- BRD4 и Ctrl. Показаны белков, известных, чтобы взаимодействовать соIth BRD4, в том числе компонентов pTEFb (CDK9 и Cyclin Т) 18,20, а также BRD9 19. Нет пептиды из этих белков не были определены в Ctrl.

figure-results-2
Рисунок 3. Halo-HDAC1 комплекс изоляция и анализ деятельности. () Серебро пятно гели, показывающие изоляцию Halo-HDAC1 комплексов и фоне из Ctrl после TEV расщепления (Протокол раздел 2.5). Известный HDAC1 группа (55 кДа) и протеазы группа ТРВ помечены. Свободное HDAC1 порождается TEV расщепления в оптимизированной связующего звена между последовательностью слияния HaloTag и HDAC1 после захвата на смоле (рис. 1). (В) График, показывающий активность HDAC1 сложные изоляция образцов в люминесцентного гистондезацетилазы анализа, HDAC- Glo 21. В колонке 1 графика показывает высокую лEvels из HDAC деятельности, содержащиеся с образцами выпадающих Halo-HDAC1 (HDAC1). Колонка 2 показывает эта активность может быть специально уменьшилось добавлением ингибитора HDAC, SAHA 22, к выборкам выпадающих HDAC1. В качестве контроля Колонка 3 демонстрирует дезацетилазы ингибитор, специфичную для Sirtuin семьи, но не HDACs, EX-527 22, не ингибирует HDAC1 активность и колонке 4 показана никакая деятельность не наблюдается, используя только буфер.

figure-results-3
Рисунок 4. Halo-BRD4 и Halo-HDAC1 конфокальной микроскопии. Живых клеток конфокальной микроскопии из HeLa клеток, трансфицированных гало-BRD4 (а) или галоген-HDAC1 (В) флуоресцентно меченных с ПМР лиганда. (A) Halo-BRD4 выражение ограничено к ядру и (B) выражения Halo-HDAC1 преимущественно писЛир. Левая сторона панелей флуоресцентный канал и правая сторона наложение флуоресцентного канала с каналом DIC для каждого. Изображения были получены на конфокального микроскопа, снабженного + CO 2 климатическую камеру 37 ° C с использованием соответствующих наборов фильтров. Масштабные бары = 20 мкм.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлены две слитые белки, Halo-BRD4 и Halo-HDAC1, характеризуется в эукариотических клетках млекопитающих для экспрессии, белковый комплекс изоляция и активность, и клеточная локализация. В работе с помощью этих различных протоколов, есть несколько важных шагов для успеха каждого эксперимента. Как и в случае с любым слитого белка, уровень экспрессии и размещения тега сам может иметь решающее значение для поддержания физиологии. Поэтому важно учитывать, что N-и / или C-концевые слияния необходимо будет разработан, если предшествующее знание или работать с другой тег не была продемонстрирована для конкретного белка выбора. Что касается выражения, если уровень слишком высок, разбавление ДНК может быть выполнена во время трансфекции или использования векторов с более слабых промоторов можно достичь уровень, соответствующий. Предыдущая работа была выполнена, показывая эффективную изоляцию макромолекулярных комплексов на эндогенный леВелс выражения 8, что позволяет работать при очень низких уровней экспрессии. Если это возможно, исследования Клеточная локализация также будет в состоянии дать представление, как к оптимальному тега позиции размещения, а также относительного уровня экспрессии, необходимой для правильного физиологии.

После того, как слитые белки готовы к выпадающих экспериментов, для получения максимального успеха с протоколом очень важно следовать рекомендациям сроки в лизиса, связывания и стиральных секциях, как один из самых больших преимуществ является скорость комплексной изоляции Процесс. Если любой из этих шагов удлинены во времени, таких как требуется для метода захвата на основе антител, существует риск диссоциации комплекса или возросла неспецифическое связывание 8. Аналогично, если времена укорачиваются во время клеточного лизиса или обязательными, клетки не могут быть полностью лизируют или эффективно захватили соответственно. Если количество стирок является ОВЦСослаблены или хорошее перемешивание смолы не происходит при связывании или стирок, то фоновые уровни неспецифических белков будет увеличено. Кроме того, средства лизиса очень важно по сравнению с эффективностью связывания со смолой. Попытки разрушать ультразвуком образцов, снимите рекомендованным моющим, добавить SDS или другой яркий моющее средство, и / или включают ингибитор протеазы AEBSF приведет к уменьшению или потере связывания белков слияния и их комплексов со смолой.

Существующие методы комплексной изоляции от клеток млекопитающих и протеомики борьбы анализа человеческого с проблемой снижения фона в анализе методом масс-спектрометрии 16. Это было настолько значительным, что хранилищем загрязняющих белков был создан многочисленными масс-спектрометрии групп 16. Фон в образцах масс-спектрометрии выпадающих можно определить как нечто, что предотвращает идентификациюистинные interactors белка приманки. Таким образом, фон может возникнуть в результате загрязнения неспецифические белки или также большие концентрации приманки белка или антител, используемых для осаждения приманки белки. Значительная работа была сделана в оптимизации как протокол выпадающее представленные здесь, а также смолы, чтобы минимизировать уровень неспецифических загрязняющих белков в процессе выпадающего. Это видно в гелях пятно серебряных и масс-спектрометрического анализа контролем (рис. 2). Для решения высоких уровней приманки белка или антител, которые могут быть в равной степени вредны как загрязнители и с которой другие методологии борьбы, пулдаун с SDS вымывания рекомендуется (протокол раздел 2.4). В связи с ковалентного к смоле, этот процесс будет оставить большую часть белка отправной слияния ковалентно присоединенную к смоле. Небольшой процент приманки наблюдается в масс-спектрометрического анализа, который, как полагаютпроисходит путем гидролиза, но это не представляет проблемы для обнаружения других более слабых или переходных взаимодействий 8.

Как уже упоминалось во введении, значительные успехи в протеомики эта возможность включена значительные успехи в масс-спектрометрии 1,7. Таким образом, важно, чтобы выделить важные параметры выбора масс-спектрометрического анализа на deconvolute смесь белков, полученных в Pulldowns. Инструменты должны быть прочными и способны обычно и эффективно анализировать образцы, содержащие небольшое количество белка, часто меньше чем <1 мкг. Наноразмерных хроматографии с участием 50-75 мкм колонны с внутренним диаметром ВЭЖХ с расходом в диапазоне 100-300 Нл / мин обычно используют для совместимости с малыми размерами образца и максимизировать чувствительность масс-спектрометра. Чтобы максимизировать информацию, полученную в одном анализе государственной Oе в искусство масс-спектрометры, способные принимать масс-спектры высокого разрешения в масштабе времени, совместимый с вышеупомянутыми наноразмерных разделений, ≥ 10 Гц, обычно используются. Эти инструменты имеют attomolar уровней чувствительности и может регулярно получать данные с суб стр предшественника и ионных продукт допусков ошибок масса. Эти эксплуатационные характеристики служат для увеличения выхода количества идентифицированных белков и уверенность, связанную с этими идентификаторами.

С помощью этих данных мы демонстрируем физиологическую клеточную локализацию, правильное белок: белковых взаимодействий наряду с потенциалом для открытия новых взаимодействий, и изоляцию активных комплексов все с помощью одного конструкцию. Действительно альтернативные технологии могут быть использованы для каждого из этих различных аспектов, но, вероятно, не для всех 23,24. С помощью технологии HaloTag, многофункциональный подход может быть использован, продвижение протеомныеИС исследования и получения более полного понимания функции белка в клетках млекопитающих.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Публикация сборы для этой статьи спонсируются Промега Corporation. Danette Л. Дэниелс, Джеки Мендес, Элен Benink, Эндрю Niles, Нэнси Мерфи и Марьета Urh являются сотрудниками Промега Corporation, коммерческого владельца по уступке патентов технологии HaloTag и ее приложений. Майкл Форд, Ричард Джонс, Рави Amunugama, и Дэвид Аллен являются сотрудниками MSBioworks, что обеспечивает массовые услуги спектрометрии, описанные в этой рукописи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Мартина Розенберг, доктор Гари Tarpley, и д-р Кейт Вуд для поддержки этой работы, и д-р Джеймс Кали за критическое прочтение рукописи. МГ, JM, HB, Н.М.,, JC, и MU являются сотрудниками Промега Corporation. М.Ф., RJ, РА, Д. А. являются сотрудниками MS Bioworks, LLC.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HeLa CellsATCC CCL-2Адгезивные
HEK293T клеткиATCCCRL-11268Адгезивные
клеточные питательные средыInvitrogen/Gibco
PBS - сертифицированная культура тканейInvitrogen/Gibco
FuGENE HD Трансфекционный реагентPromegaE2311
HaloTag Control VectorPromegaG6591
HaloTag-BRD4Kazusa DNA Research InstituteFHC11882N-концевой HaloTag fusion
HaloTag-HDAC1Kazusa DNA Research InstituteFHC02563N-концевой HaloTag fusion
HaloTag Клоны, содержащие содержимоеPromegaVarioushttp://www.promega.com/FindMyGene/
HaloTag Flexi Vectors для клонирования (N- или C-концевые)PromegaРазличныеВыбирайте в зависимости от уровня экспрессии и ориентации HaloTag HaloTag
TMR LigandPromegaG8251
IGEPAL CA-630Sigma18896
HaloTag Система вытягивания и маркировки млекопитающихPromegaG6500содержит HaloTag TMR лиганд
HaloTag Mammalian Pull-Down SystemPromegaG6504
Коктейль ингибиторов протеазы, 50XPromegaG6521
Буфер для лизиса млекопитающихPromegaG9381
Моноклональное антитело HaloTagPromegaG9211
ProTEV Plus PromegaV6101
RQ1 DnasePromegaM6101
HaloLink СмолаPromegaG1912
HDAC-GloPromegaG6420
PBS + 0,1% Triton X-100Для дополнительной визуализации
4% параформальдегид/0,2 М сахароза/PBSДля дополнительной визуализации
Этанол
Сосуды и чашки
Инкубатор
для клеточных культурОдноразовый подъемник для клетокThermo Fisher Scientific08-773-1
Гомогенизатор стекла, такой как Kontes Dounce Tissue GrinderThermo Fisher ScientificK885300-000225-27 G игла также может быть использована
Микроцентрифужный
вращатель трубок, такой как LabquakeThermo Fisher Scientific4002110QИдеально подходит для этапов
связывания и промывкиВстряхивающая платформа, такая как термомиксер Eppendorf ThermoFisher Scientific05-400-200Идеально подходит для элюирования SDS и ступеней расщепления TEV
Камерное защитное стеклоThermo Fisher Scientific155409Для дополнительной визуализации
Флуоресцентный микроскроп (555 нм Ex/585 нм Em)Для дополнительной визуализации
для тканевых культур

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).">Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).
  2. From genomics to proteomics. Nature. 422, 193-197 (2003).">Tyers, M., Mann, M. From genomics to proteomics. Nature. 422, 193-197 (2003).
  3. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).">Coulombe, B., et al. Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome. Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).
  4. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).">Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
  5. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).">Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  6. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).">Sardiu, M. E., et al. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).
  7. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).">Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
  8. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).">Daniels, D. L., et al. Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics. J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).
  9. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).">Encell, L. P., et al. Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands. Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).
  10. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).">Ohana, R. F., et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).
  11. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).">Black, J. C., et al. KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors. Cell. 154, 541-555 (2013).
  12. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).">Deplus, R., et al. TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS. EMBO J. 32, 645-655 (2013).
  13. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).">Galbraith, M. D., et al. HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia. Cell. 153, 1327-1339 (2013).
  14. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).">Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).
  15. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).">Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).
  16. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).">Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. 10, 730-736 (2013).
  17. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).">Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  18. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).">Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19, 523-534 (2005).
  19. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).">Rahman, S., et al. The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3. Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).
  20. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).">Yang, Z., et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 19, 535-545 (2005).
  21. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).">Halley, F., et al. A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening. J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).
  22. To selectivity and beyond. Nat Biotechnol. 28, 1259-1266 (2010).">Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotechnol. 28, 1259-1266 (2010).
  23. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).">Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).
  24. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).">Urh, M., Rosenberg, M. HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis. Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HaloTag TechnologyProtein Pull downsProtein IsolationMammalian CellsProtein InteractionsCellular LocalizationWestern BlotMass SpectrometryBRD4 ProteinHDAC1 Protein

Related Articles