Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Автоматизированный анализ динамических Ca

16.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51560

⸱

16 июня 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

В этой статье

Краткое содержание

Здесь роман регион протокола анализа процентной ставки, основываясь на сортировку наилучшего соответствия эллипсы, назначенные регионах позитивный сигнал в двумерное промежуток времени последовательности изображений демонстрируется. Этот алгоритм может позволить следователям всесторонне проанализировать физиологические Ca 2 + сигналы с минимальным пользовательского ввода и предвзятости.

Аннотация

Внутриклеточного Са 2 + сигналы, как правило, учился с флуоресцентными красителями Са 2 + индикаторов и методов микроскопии. Однако количественный анализ Ca 2 + данных изображений занимает много времени и при условии смещения. Автоматизированные алгоритмы анализа сигналов, основанные на интересующей области обнаружения (ROI) были реализованы для измерений одномерной линией сканирования, но нет текущий алгоритм, который объединяет оптимизированный выявление и анализ трансформирования в двумерных последовательностей изображений. Вот алгоритм для быстрого сбора и анализа трансформирования в последовательности изображений описывается. Он использует эллипсы подходят для шума с фильтром сигналов, чтобы определить оптимальное размещение ROI, и вычисляет Ca параметры 2 + сигнальные амплитуде, продолжительности и пространственного распространения. Этот алгоритм был реализован в виде свободно распространяемой плагин для ImageJ (NIH) программного обеспечения. Вместе с анализа сценариев, написанных для открытым исходным кодом статистической программного обеспечения обработки R,Такой подход обеспечивает высокую емкость трубопровода для выполнения быстрого статистического анализа экспериментальных выхода. Авторы полагают, что использование этого протокола анализа приведет к более полному и непредвзятой характеристике физиологической Ca 2 +-сигнализации.

Введение

Са 2 + является повсеместное вторичный мессенджер молекулу и цитозольные Ca 2 + уровня сигнализации строго регулируется. Внутриклеточного Са 2 + сигналы сложны и включают отдельные переходные, колебания и распространяющихся волн 1 - 4. Пространственное и временное управление Ca 2 +, как полагают, лежат в основе физиологического специфику сигнала, и поэтому анализ Са 2 + шаблонов сигнала представляет значительный интерес для исследователей в нескольких полей 5.

Са 2 + индикатор красители, такие как Fluo-4 и Фура-2 обычно используются для измерения внутриклеточных 2 + сигналы Ca с флуоресцентной микроскопии 5-12. Как правило, временные Са 2 + сигналы оцениваются как зависящих от времени изменений в средней флуоресценции в пределах определенной пользователем области или области интереса (ROI) 5,6,13 - 16. В настоящее время, анализ эксплуатации КОРОЛЬ много времени и труда всоздающий напряжение, потому что это требует, чтобы пользователи определить многие трансформирования и выполнять повторяющиеся вычисления 17 - 19. Эти методы также могут быть подвержены значительным ошибки пользователя, в том числе введения искусственных режимов сигнала и исключения низкой амплитуде или диффузных сигналов 18,20.

Автоматизированные алгоритмы обнаружения ROI ранее были реализованы с использованием различных статистических подходов, чтобы определить оптимальное размещение ROI, но они, как правило, ограничен анализа строчной развертки или псевдо-линии сканирования изображений, что ограничивает анализ для одного пространственного измерения в момент 17, 19 - 22. Кроме того, многие существующие алгоритмы не являются адекватными, чтобы охватить все разнообразие Ca 2 событий + релиз, которые варьируются от периодических локализованных переходных к распространяющихся волн 23,24. Комплексная оценка физиологических 2 + сигналов Са часто осложняется наличием значительного искусственн изображениядействовать, что смешивает сигнал к дискриминации шума во многих экспериментальных системах.

Ранее, автоматизированная обнаружения ROI алгоритм решения к Са 2 + сигнал переходный обнаружения, реализован в виде плагина для программного обеспечения NIH ImageJ (Национальные Институты Здоровья, Bethesda, MD), была разработана и утверждена 25,26. Этот алгоритм, называемый LC_Pro, был разработан, чтобы выявить и проанализировать трансформирования охватывающие Ca 2 + сигналов переходных процессов в двумерных изображений последовательностей промежуток времени. Вот практический экспериментальный протокол и представитель демонстрация применения алгоритма в свиной эндотелия коронарных артерий обеспечивается, с дополнительной постобработки с помощью с открытым исходным кодом статистического программного обеспечения для обработки R генерировать полезную графический вывод.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Вскрытие судно и обработка изображений

  1. Урожай ткани из внутренних несовершеннолетних свиней, как описано в Мартенса и др. 27. Поместите собранные свиного правый желудочки в полидиметилсилоксана (PDMS) нижняя рассечение блюдо с HEPES буферный физиологический раствор (PSS).
    1. С помощью стереомикроскопа, анализировать и удалить сегмент левой передней нисходящей коронарной артерии (~ длина 8 мм, диаметр 0,5 мм) от окружающей ткани с помощью щипцов и пружинные ножницы удалением сегмента сосуда от окружающих слоев сердечной ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть стенку сосуда.
    2. Поставьте PDMS блок (1 х 0,5 х 0,5 см) в рассечение блюдо, и использовать иглу, чтобы повесить это на дно. Вырежьте примерно 40 мкм диаметром вольфрамовой проволоки на двенадцать ~ сегменты длиной 0,3 см, образуя micropins, и разместить их в блюдо. Использование щипцов, обеспечить один конец сегмента сосуда к блоку с micropiн.
    3. Осторожно вставьте небольшие весенние ножницы в просвете сосуда, и разрезаются вдоль по одной стороне судна, чтобы открыть его полностью. Расположите открытый сегмент сосуда с эндотелия вверх.
    4. Используйте оставшиеся micropins обеспечить границы открывшемся сегмента сосуда, чтобы блокировать такие, что судно образует плоский прямоугольник. ПРИМЕЧАНИЕ: Micropin вершины должны быть согнуты на 90 ° и не вставлены заподлицо с поверхности блока. Следует проявлять осторожность, чтобы растянуть подготовку судна без перенапряжения; Окончательный ширина должна быть ~ 1.5x стартовый Unstretched ширину.
    5. Подготовка небольшого объема (~ 1 мл) Fluo-4 утра загрузки раствора путем смешивания Fluo-4 утра (10 мкм), растворенный в ДМСО с плюрониевого (0.03%) в забуференном HEPES PSS (содержащий в мМ: NaCl 134, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 глюкозы), и вставьте весь блок в загрузочный решение для примерно 40 мин при комнатной температуре в темноте.
    6. После загрузки, мыть блок, в HEPES буферныхPSS в течение 5-10 мин.
    7. Установите блок на 50-100 толстыми прокладками мкм в покровного стекла нижней камере, содержащей HEPES буферный PSS. Примечание: Металлические штифты могут быть использованы в качестве распорок и обеспечить сегмент сосуд вниз и не касаясь распорки.
    8. Наведите камеру на сцене инвертированного микроскопа, оснащенного для конфокальной микроскопии, и сосредоточиться на эндотелиальной слоя клеток.
    9. Время захвата покадровой последовательности изображений базального относительной флуоресценции для ~ 3 мин при 20-кратным увеличением и частотой кадров ~ 8 кадров в сек с использованием конфокальной изображения последовательность aquisition программного обеспечения.
    10. После ~ 3 мин записи базальной флуоресценции, заменить HEPES буферный раствор PSS с таким же объемом (~ 1 мл) вещества Р (100 мкм), растворенного в забуференном HEPES PSS и записи для ДОПОЛНИТЕЛЬНО 3 мин.

2. Автоматизированный анализ

  1. Рендер последовательность (ы) изображения флуоресцентного деятельности кальция из конфокальной приобретения программного обеспечения, как 8 бит, гrayscale '. TIF' файлы формата, не имеющие масштабной информации.
  2. Открыть ImageJ, нажмите «открытой» в меню файла и выберите соответствующую последовательность изображений в окне проводника, чтобы просмотреть последовательность (ы) изображения в ImageJ.
  3. Определить соответствующий диаметр ROI при помощи функции прямоугольную ROI для оценки верхней и нижней границы пространственного распространения активности в последовательности (ы) изображения. ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее прямоугольная диаметр является подходящим выбором для диаметра ROI.
  4. Создайте новую папку на жестком диске компьютера, а также добавить последовательность (ы) изображения в каталог папок.
  5. В ImageJ, нажмите окно "плагины", затем нажмите кнопку "LC_Pro ', чтобы начать анализ.
  6. Введите значение диаметра ROI и выберите пороговое фильтр значения (либо 0,05 или 0,01).
  7. Нажмите кнопку "лечения от наркозависимости" флажок и введите значения момент времени непосредственно до и после был добавлен препарат (в секундах).
  8. Нажмите «ОК», ивойти в каталог последовательность изображения в окно File Explorer.

3. Графический выход

  1. Скачать R версию 3.0.2 с http://www.r-project.org/ .
  2. Откройте 32 разрядную версию R.
  3. Нажмите кнопку "Файл", затем "открытого сценария 'и выберите R сценарий в' traceplot.R 'для создания графических экспериментальные отчеты.
  4. Установите калибровку и gplots пакеты для определенных "пакеты ',' установить пакеты 'и выбрав appropirate пакеты.
  5. Нажмите "Файл", затем "изменить каталог 'команда, и использовать окно проводника, чтобы выбрать каталог, который соответствует выходу анализа LC_Pro.
  6. Нажмите на окне сценария, а затем команду "запустить все", чтобы запустить скрипт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Пользовательский алгоритм, LC_Pro, была разработана и внедрена для того, чтобы выполнить автоматический анализ Са 2 + динамика на конфокальной последовательностей изображений. Как показано на рисунке 1, алгоритм использует последовательные модули обработки, что) обнаруживать и сопровождать сайты динамического Ca 2 + изменить выше статистической (р <0,01) шума, В) определить зоны интереса (ROI) автоматически при активных центров на места, и С) рассчитать средние интенсивности флу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Расшифровка сложных Са 2 + сигналов на клеточном и многоклеточного уровне потребует строгие экспериментальные и аналитические подходы. Здесь подход описан в это время решены конфокальной изображения последовательности Ca 2 + в зависимости флуоресценции подвергаются автоматизированной анализа, которая определяет и количественную статистически соответствующие Са 2 + сигналов в неповрежденных сотовых полей в конкретном случае, представленные, сегмент артерии выделяли от сердца свиньи, возла...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Национальными Институтами Здоровья Гранты HL-085887, HL-092992, S10RR027535 и СС-93676.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Диссекционная чашкаFisher Sci#08-772-70
Полидиметилсилоксан (PDMS)Fisher Sci#NC9644388должен быть отлит в чашки
HEPES-буферизированный PSSSigma#H3375-250GHEPES кислотный
стереомикроскопNikon Inst.
ЩипцыFine Science Tools#11223-20
Пружинные ножницыFine Science Tools15003-08
Вольфрамовая проволокаScientific Inst Svcs#406
Fluo-4 AMLife Tech.#F-14201
Pluronic F-127Life Tech.
Металлические штифтыFine Science Tools#26002-10
Крышка стеклянной нижней камерыСпециально разработанный
Вращающийся диск конфокальный микроскопPerkin ElmerRS-3
ImageJ softwareскачать на: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro плагин для imageJскачать по адресу: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R softwareскачать по адресу: http://www.r-project.org/
R traceplot scriptскачать по адресу: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing
Набор эластомеров #MNA42000#P3000MP

Ссылки

  1. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
  2. Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  3. Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
  4. Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
  5. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
  6. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
  7. Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
  8. Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
  9. Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
  10. Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  11. Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
  12. Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
  13. Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
  14. Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
  15. Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
  16. Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
  17. Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
  18. Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  19. Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
  20. Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
  21. Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
  22. Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
  23. Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
  24. Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
  25. Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ROIImageJRP
Автоматизированный анализ динамических Ca
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.