Electrospun волокнистых Строительные леса поли (глицерин-dodecanedioate) инженерного нервных тканях От эмбриональных стволовых клеток мыши

Электропрядения является одним из эффективных методов обработки для получения микро-к-нанометра каркасов размер волокна. Основной принцип электроформования включает в себя Taylor конус раствором, который проходит в отверстие иглы с применением высокого напряжения между кончиком иглы и заземленной коллектора. Когда электростатическое отталкивание в растворе преодолевает поверхностное натяжение, заряженная струи жидкости выбрасывается из кончика иглы, проходит через воздух с испарения растворителя, и, наконец, осажденный на заземленной коллектора. Шприцевой насос обеспечивает непрерывный поток выходящего из фильеры растворе и, таким образом, несколько копий electrospun волокон может быть изготовлен в течение короткого периода времени. В ходе выходе из фильеры прибыть на коллекторе, взимается струя будет пройти растяжения и битья по ряду параметров, которые включают вязкости и поверхностного натяжения полимерного раствора, в electrostatiс силой в решении, и взаимодействие внешнего электрического поля, и т.д. ^2.

В процессе электропрядения, коллекционер служит подложкой, где микро-до-нм волокна могут быть депонированы. В этом исследовании, новый тип волокна коллектора был разработан для получения волокнистых матов с нужного размера (длина х ширина). Традиционно, алюминиевая фольга используется в качестве коллектора но трудно передать волокна от плоской поверхности на другую подложку. Трудность сбора нетронутыми фибролит от традиционного коллектора в основном за счет того, что electrospun волокна придают сильно к поверхности коллектора. Таким образом, мы модифицированный коллектор путем складывания кусок алюминиевой фольги в прямоугольной полосе и присоединение его перпендикулярно плоской металлической пластины. В electrospun волокна растягиваются по всей области между концом полосы и металлической пластиной, которые могут быть легко переданы другой Substratэ.

Интерес к термически сшитых эластомерных полимеров стремительно растет из-за новаторской работе группы Роберта Лангера, который представил поли (глицерин себацат) (PGS), полиэстера, который является аналогом вулканизированной резины в 2002 году ^3. Подобно PGS, мы успешно разработали поли (глицерин-додеканоат) (ПГД) по термической конденсации глицерина и додекандикарбоновой кислоты и продемонстрировала свою уникальным свойством памяти формы ^1. В отличие от жесткой синтетических материалов поли (гидроксил бутирата) или поли (L-лактида) (модули Юнга 250 МПа и 660 МПа, соответственно), ПГД проявляет эластомерного недвижимость как резина, с модулем Юнга 1,08 МПа, когда температура выше 37 ° С, что является близким матч на на месте периферического нерва (0,45 МПа). Кроме того, ПГД является биологически и время деградация может быть доработаны путем изменения соотношения глицерина и додекандикарбоновой кислоты. Додекандикарбоновой кислота является двенадцатилетний углерода субпозиция с двумя концевыми карбоксильными группами, HOOC (CH _{2) 10} COOH. Четные дикарбоновые кислоты, такие как себациновая кислота и додекандикарбоновой кислоты может быть метаболизируется до ацетил-КоА и введите трикарбоновых кислот (ТСА) / (лимонная кислота) цикла. Метаболический продукт из дикарбоновых кислот, сукцинил-КоА, является предшественником gluconeogenetic и промежуточное соединение TCA цикле ^4. Таким образом, некоторые исследования показали, что они могут быть использованы в качестве альтернативного субстрата топлива для энтерального и парентерального питания, особенно в патологических состояниях. Кроме того, PGD обладает уникальной памятью формы, так как его температура стеклования 31 ° C, при этом он показывает различные механические свойства при комнатной температуре и при температуре тела. В целом, ПГД является биологически, биосовместимых, демонстрируя уникальные упругие свойства с механическими свойствами, аналогичными нервных тканей; следовательно, является подходящим материалом для нервной ткани машиностроении. В этом протоколе, electrospunдлинные волокна, охватывающие большую площадь для хранения были изготовлены с помощью новой конструкции коллектора от ПГД. В леса волокна могут поддержать рост мыши плюрипотентных стволовых клеток и дифференцировки.

1. Настройка Электропрядения коллектор

1. Разрежьте алюминиевую фольгу в прямоугольный кусок.
2. Сложите прямоугольный кусок в прямоугольную полосу, и приложите его перпендикулярно плоской металлической пластины с лентой (рис. 1). Примечание: Размер волокнистого мата зависит от длины и ширины полосы. Таким образом, размеры полосы можно регулировать по мере необходимости.

2. Полимерные Подготовка решения

1. Смешайте глицерин и додекандикарбоновую кислоту (ДВР) в молярном соотношении 1:1 в химическом стакане при температуре 120 ° С в течение 100 ч, чтобы получить PGD полимера.
2. Растворить поли (этиленоксид) (ПЭО) и желатин в 65%-ном этаноле с весовом соотношении 1.5:3:95.5 в 15 мл пробирку, затянуть крышку и нагревают смесь в печи при 60 ° С в течение 1 часа при перемешивании пока она не станет однородной решение (базальной раствор).
3. Для электропрядения, смешать PGD полимер и базальную решение в 4:06 весовом соотношении. Примечание: ПГД концентрация имеет биг эффект от диаметра волокна. 30% -50% процентов PGD является приемлемым для производства волокон более 5 см с увеличением диаметра волокна.
4. Добавить 0,1% рибофлавин, чтобы полимерного раствора и хорошо перемешать.

3. Электропрядения

1. Поток полимерного раствора в 5 мл стандартного шприца с 18 G притупляются иглы из нержавеющей стали.
2. Вставьте шприц в шприцевой насос.
3. Прикрепите заземленный провод источника питания высокого напряжения на металлическую пластину и положительно заряженной приводят к игле.
4. Отрегулируйте расстояние между иглой и фольги полосы алюминия до 15 см.
5. Поместите шприцевой насос под углом около 15 ° к горизонтальной для предотвращения агрегации волокон в передней части полосы.
6. Включите шприцевой насос и регулировать расход насоса до 0,6 мл / час.
7. Включите источник питания высокого напряжения и установить рабочее напряжение до 14,6 кВ.

4.Волоконно Обработка

1. После сбора завершена, подвергать фибролит к ультрафиолетовому излучению в течение 60 мин для сшивания.
2. Передача волокнистый мат из фольги алюминиевой полосы в 100 мм чашки Петри, и подвергать его воздействию ультрафиолетового света течение еще 20 мин для стерилизации.
3. В кабинете биологической безопасности, разрезать волокнистый мат в круглые куски такого же размера с хирургическим скальпелем и поместить части в 24-луночный планшет.
4. Для клеточной терапии предварительно посева, погрузить образцы волокон в 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и инкубировали при 37 ° С в течение ночи.
5. На следующий день, аспирации PBS тщательно, добавить 1 мл дифференциации среды (DMEM/F12, N2, и FGF2) (см. рецепт в материалах таблице) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 3 часов.
6. Аспирируйте дифференциация среднего осторожно, добавьте 0,2 мл Матригель к каждому образцу волокна и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Примечание: Laminin также могут быть использованы для покрытия волокна. Добавить 0,2 мл 20 мкг / мл ламининна волокно и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов.
7. Осторожно снимите излишки Матригель из каждой лунки. Промойте 2 мл дифференциации среды один раз. Примечание: Образцы волокна готовы к клеточной культуре.

5. Сотовый Посев на волокна

1. Добавьте 1 мл Accutase к клеточной блюдо культуры MES и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С
2. Через 10 мин МОН клетки отделяют от культуры блюдо. Добавить 4 мл дифференциации среды к пластине. Соберите плавающие ЭСК в 15 мл трубки и пипетки клеток вверх и вниз, чтобы сломать колонии (около 15x).
3. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин и повторно приостанавливать клеток в 4 мл среды дифференцировки.
4. Граф клеток с помощью гемоцитометра. Передача 200 мкл клеточной суспензии в 15 мл пробирку и разбавить его с 10x дифференцировки среды. Трансфер 15 мкл разбавленного клеточной суспензии в камеру на гемоцитометре с покровным стеклом на месте. Считатьклетки в 1 мм площади центра и четырех угловых квадратов гемоцитометре под микроскопом. Примечание: Сотовый на мл = среднее значение в квадрате х на коэффициент разбавления х 10 ⁴
5. Поместите примерно 5 х 10 ⁴ ЭСК в каждую лунку. Медленно падение клеточной суспензии на середине образцов волокна, а скольжение в сторону скважины, чтобы предотвратить решение от спуске Волокнистый мат.
6. Добавить 1 мл дифференцировки среды в каждую лунку, и планшет держать в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО _2, чтобы позволить прикрепления клеток, рост и дифференциацию.
7. Аспирируйте старый субстрат из каждой лунки и заменить 1 мл свежего дифференциации среды через день.

6. Жизнеспособность клеток

1. Аспирируйте старую среду из каждой лунки.
2. Смешайте ^1/10 объема резазурин флуоресценции реагента с культуральной среды и добавляют 1 мл в каждую лунку.
3. Incubели в 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 4 часов, защищенном от прямых солнечных лучей.
4. Через 4 часа, передача 3 раза 100 мкл реагента из каждой лунки в 96-луночный планшет, а затем образцы готовы быть измерена на флуоресцентном спектрофотометре с использованием параметров 560EX nm/590EM фильтра.

7. Настоящее ПЦР Время

1. Через 14 дней культивирования добавить лизирующего буфера для образцов и изолировать общей РНК из клеток на образцах волокна.
2. Использование 4 мкл тотальной РНК, чтобы синтезировать кДНК в 20 мкл реакционной масштабах путем обратной транскрипции.
3. Подготовка реакционной смеси ПЦР в каждой оптической трубы: 10 мкл Master Mix (2x), 0,2 мкл красителя, 8 мкл нуклеазы без воды, 1 мкл кДНК, и 1 мкл праймера (праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1).
4. Установите программу ПЦР: а. 95 ° C 2:20 мин, 1 цикл б. 95 ° C 3 сек → 60 ° C 1 мин, 40 цикл с. 95 ° С 15 сек, 1 цикл г. 60 ° C 1мин, 1 цикл э. 95 ° С 15 сек, 1 цикл. Выберите сравнительный метод C _T для определения уровней экспрессии относительно генов.
5. После ПЦР закончена, анализировать в режиме реального времени результаты ПЦР с StepOne программного обеспечения и экспортировать результаты в Excel.

Основными компонентами электроформования показаны на рисунке 1. Большой размер коврик волокна обычно получают путем перпендикулярно прикрепленной полосы алюминиевой фольги и плоской металлической пластины. Рисунок 2 показывает конструкцию коллектора и мат электропрядения волокна. Ширина и длина может регулироваться для различных приложений. Длина волокна, изготовленного с PGD полимера и базальной Раствор смеси до 10 см. Морфология electrospun волокон показан на рисунке 3. Диаметры волокон, изготовленных из 40%-ной концентрации PGD находятся в диапазоне микрометра. Конфокальной микроскопии изображения дифференцированных клеток, полученных из ЭСК культивировали в течение 3 и 6 дней на волокна показаны на рисунке 4. Зеленые сигналы флуоресцентные пришел из сверхэкспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в клетках. Результатом резазурин флуоресценции реагента на рисунке 5 показано, что ЭСК клетки растутн на PGD волокон покрытия с матригеле и ламинином было эквивалентную жизнеспособность клеток и имели относительно более высокую пролиферацию по сравнению с непокрытой группы. Экспрессия гена из плюрипотентности и нервных клеток маркеров количественно ПЦР в реальном времени (рис. 6). Большинство ЭСК культивировали на волокнах выразил OCT4 маркеров плюрипотентности, Nanog и Sox2 в то время как меньшинство клеток выразил нейронная стволовых клеток отмечает PAX6 и нестин. Через 2 недели культуры, MES, выращенные на волокна показали повышенные уровни экспрессии нервных клеток, таких марок как МАР2 и DCX, а также олигодендроциты маркера Oligo1 и астроцитов GFAP маркера.

Рисунок 1. Электроформования создана. Полимерный раствор выбрасывается из затупленного иглы. Источника питания высокого напряжения основания плоская металлическая пластинай фольга полоса алюминия, между которыми микро-до-нано метр волокна осаждаются (синий).

Рисунок 2. Конструкция коллектора и мат electrospun волокна. Ширина и длина мата может быть легко изменена путем регулировки размера фольги полосы алюминия. Там нет предела для ширины мат, и самые длинные волокна могут быть длиной до 10 см.

Рисунок 3. СЭМ изображения electrospun из PGD и базальных раствором 4:06 (вес / вес). Средний диаметр волокна составляет около 2 мкм. Когда концентрация PGD уменьшается до 30%, средний диаметр волокон попадает в нанометровом диапазоне. БелыйМасштабная линейка составляет 10 мкм.

Рисунок 4. Конфокальной микроскопии образы дифференцированных ЭСК на волокна. Клетки, несущие GFP обладают яркой зеленую флуоресценцию при воздействии света в синий с ультрафиолетовом диапазоне. Увеличение числа зеленый флуоресцентный клеток на 6-й день показывает, что леса волокна может поддерживать адгезию и пролиферацию клеток. Белая масштабная линейка представляет 100 мкм. (3-й день и День 6).

Рисунок 5. Ячейка жизнеспособность ЭСК на ПГД волокон покрытие с Матригель и ламинином на 1, 3, и 5 дней, как определено резазурин fluoreСЦЕНА реагент. Клетки культивировали на непокрытых волокон, используемых в качестве контроля (р <0,05).

Рисунок 6. Qrt-ПЦР анализ экспрессии генов в дифференцированных ЭСК на ПГД волокон. Нервные маркеры очевидные клеток после 2 недель показали, что ЭСК клетки на каркасах дифференцировали в нервные клетки.

Нет конфликта интересов объявлены.