Техника для изоляции холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков у новорожденных мышей описан. Воздуховоды являются тщательно препарировали, а затем клетки выделяют выроста в толстых гелей коллагена. Этот метод является полезным инструментом для изучения внепеченочных развитие протоков желчи и патологии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение новорожденных внепеченочных холангиоцитах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Интра и внепеченочных желчных протоках печени являются умственно различны, и может быть по-разному влияет на некоторых заболеваний. Тем не менее, различия между внутри-и внепеченочных холангиоцитах, а также между новорожденных и взрослых клеток, не до конца понятны.
Методы выделения холангиоцитах из внутрипеченочных желчных протоков, хорошо известны 1-4. Выделение внепеченочных протоков клеток, особенно из новорожденных, до сих пор не описано, хотя это было бы весьма полезным для понимания различия между различными популяциями cholangiocyte и в изучении таких заболеваний, как атрезия желчных путей, которые появляются целевой внепеченочных протоков. Описанный здесь является оптимизированная методика изолировать оба новорожденных и взрослых мышей внепеченочные клетки желчных протоков. Этот метод дает чистую популяцию клеток с минимальными загрязнения от мезенхимальных клеток, как фибробласты.
Это метод основан на удалении внепеченочных протоков и желчного пузыря, а затем тщательного вскрытия и выскабливание, чтобы удалить жир и фибробластов слоев. Структуры встроены в толстых слоев коллагена и культивировали в течение приблизительно 3 недель, чтобы разрастание холангиоцитах в монослоев, которые затем могут быть трипсином и повторно высевали для экспериментального использования.
Введение
Происхождение и развитие внутри-и внепеченочных холангиоцитах заметно отличаются. Печень развивается из выпячивания вентральной энтодермы передней кишки 5. Хвостовой область дивертикула формирует внепеченочных желчных дерево, в то время как черепная область генерирует внутрипеченочный желчный дерево 5. Внутрипеченочные холангиоцитов воздуховодов выводятся из клеток-предшественников вокруг протоков пластины в пригородных портала регионах 6. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в либо гепатоцитов или холангиоцитах 6. Это имеет значительные клинические последствия, учитывая, что cholangiopathies может специально направлены одну категорию холангиоцитах. Например, атрезия желчных путей изначально влияет на внепеченочные протоки новорожденных, в то время как Alagille синдром влияет внутрипеченочные протоки.
Есть несколько описаний изоляции внутрипеченочных холангиоцитах и желчных протоков единиц от мышей и крыс. Вvestigators выделили отдельные клетки путем выделения канала и последующего вырост, или путем расщепления печени и антитела снести холангиоцитов выражающих конкретные маркеры клеточной поверхности, 1-4. Функциональные и поляризованные единиц желчных протоков были выделены расщеплением печени и размера фильтрации 7. Желчных протоков единиц способны реагировать на секреторные стимулы и продемонстрировать жидкости секрецию 7, в то время как изолированные холангиоцитов было показано, что развитие протоками структур в пробирке 1,2. Ограничения этих методов включают необходимость специализированной технической экспертизы и специального оборудования для перфузии печени с пищеварительными ферментами. Кроме того, существует риск загрязнения с мезенхимальных клеток 3.
Способ изолировать внепеченочные холангиоцитах желчных протоков, в частности, из новорожденных внепеченочных желчных протоков, ранее не была описана. В этом документе излагаются упрощенную технику, чтобы изолировать новорожденных Aы также взрослых внепеченочных желчных протоков клеток при высоких уровней чистоты. Этот метод будет способствовать изучение различий между внутри-и внепеченочных холангиоцитах и исследований в области механизмов болезней, как атрезия желчных путей, которые включают внепеченочных протоков.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Вся процедура осуществляется при комнатной температуре, если не указано иное. Все животные работа должна проводиться в гуманных условиях по протоколу утвержденного местного комитета Институциональная уходу и использованию животных (IACUC) на.
1. Подготовка оборудования и решений
- Настройка мыши операционный стол в непосредственной близости от капота культуры ткани и инкубатора (рис. 1А). Примечание: Необходимое оборудование включает в себя рассекает микроскопом, источник света, длинные 12,5 см прямые ножницы Iris, 6 дюймовый без зубчатые изогнутых щипцов с прекрасными советами и 4 дюйма зубчатые щипцы с изогнутыми наконечниками (рис. 1б).
- Поместите стерильных инструментов в стеклянном стакане с 70% спиртом на операционном столе.
- Заполните три стерильные 60 мм чашки Петри стерильной изолирующей среды (табл. 1); разместить два на операционном столе и один в капюшоне, все на льду.
- Наведите крысиный хвост коллагена,стерильный 10x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), стерильную воду, стерильный 1 N NaOH и желчных эпителиальных клеток (БЭК) Медиа (табл. 1) в капот культуры ткани. Примечание: коллаген должен быть на льду.
2. Желчных протоков Выделение и Культура
- Усыпить новорожденных мышей между 0-3 дней жизни, под воздействием углекислого газа до потери сознания не последовало смещением шейных позвонков, в IACUC принципов (рис. 1в).
Примечание: старые мыши могут быть использованы в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей. - Поместите животное в положении лежа на спине и сделать небольшой горизонтальный разрез пересечения средней линии в районе таза. Продлить этот разрез в поперечном направлении и вверх обе стороны живота, образуя U образный клапан. Поверните клапан до подвергайте органы брюшной полости. После того, как живот открыта, тщательно перемещать кишечник из брюшной полости в направлении правой стороны животного для лучшей визуализации печени и общего желчного протока. Примечание: это может быть необходимым продлить боковые разрезы в грудную клетку, чтобы получить лучшую идентификацию печени.
- Использование рассекает микроскопом, определить общий желчный проток, печень и кишечник. Определить общий желчный проток первый (рис. 1D), используя осторожность, так как структуры очень деликатный. С зубчатыми и неправительственных зубчатыми щипцами, придирчиво чистый и обрывать соединительной ткани, включая жир, окружающий желчь. Используйте один пинцет, чтобы удерживать канал, а другой для очистки.
- Используйте подобную технику для очистки желчного пузыря.
- Поместите очищенные каналы и желчного пузыря в первую блюдо изоляции СМИ на льду. Мягко массируйте структуры с не зубчатыми щипцами в то время как в средствах массовой информации для дальнейшего удаления соединительной ткани и удалить желчь из желчного пузыря.
- Трансфер протоки и желчный пузырь, чтобы второй блюдо изоляции СМИ.
- После выделения каналов и желчные пузыри из 5 животных, трансферчасти к третьей чашке Петри, в капюшоне. Примечание: Если клетки должны быть изолированы от более чем 5 животных, делать периодически, с использованием свежих решения для каждой группы по 5 животных.
- Подготовка толстые гели коллагена в капот культуры ткани:
Примечание: любой размер блюдо можно использовать. 60 мм чашки для культивирования с конечным объемом 3 мл коллагена для каждой группы из 5 новорожденных работает хорошо. Это следует приготовить свежую во время погружения свежеизолированных протоки.- Поместите коллагена хвоста крысы, стерильную 10x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) 10x, стерильную дН 2 O, и стерильной 1 N NaOH на льду.
- Рассчитать объемы дН 2 0, 10х PBS, NaOH, и коллагена, необходимого для гелей с конечной концентрацией 2 мг / мл коллагена в 1х PBS, используя объем 1 N NaOH, равную 0,023 кратного объема коллагена добавлен. Примечание: Если альтернативный источник коллагена используется, следуйте инструкциям производителя по нейтрализации и образования геля.
- Смешать дН 2 0, 10x PBS, и 1 N NaOH, затем добавить коллагена и пипетки хорошо, чтобы обеспечить равномерное смешивание.
- После того, как коллаген раствор загустел в гель консистенции при комнатной температуре, немедленно вставлять каналы в коллагена.
- Место в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы позволить коллагена затвердеть.
- После того, как гель затвердевает (изменения цвета от прозрачного до белого), с наложением 3,5 мл БЭК СМИ (табл. 1) и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
- Удалить BEC СМИ 3 раза в неделю и заменить 3,5 мл свежей среды.
3. Изоляция Первичные холангиоцитах из толстого Коллаген Гели
Примечание: в течение 3 недель, листы холангиоцитах (клеток с большими ядрами расширения непосредственно из встроенных каналов) будут видны в густой коллагена. Если есть большое количество фибробластов в чашке, он должен быть отброшен. Если несколько регионов блюдо естьроста фибробластов, их можно вырезать скальпелем и удалены до расщепления холангиоцитах.
- Подготовка тонкие гели коллагена:
- Развести коллагена в концентрации 1 мг / мл стерильной PBS. Примечание: используйте 1 мл для 100 мм пластины; настроить соответствующим образом для других блюд размера.
- Распространение раствора коллагена равномерно с сотовым разбрасывателя (большие блюда) или кончика пипетки (небольшие блюда), а затем оставить при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Накладка с DMEM/F12 и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 10 мин.
- Удалить пластину из инкубатора и мыть с 1x PBS. Сразу аспирации 1x PBS.
- Coat со вторым тонким слоем коллагена, распространяющейся путем вращения тарелки или размещения пластины на шейкере. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 10 мин.
- После коллаген укрепил, крышка с DMEM/F12 и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 30 мин.
- Сплит клетки от гоИк коллагеновые гели:
- С клеточной культуры шпателем или клеточным скребком, очистить геля коллагена мягко от пластины таким образом, чтобы он плавает.
- Подготовка коллагеназы решение путем разбавления Тип XI коллагеназы (см. список материалов) до 10 мг / мл с DMEM/F12. Хорошо перемешайте и стерильный фильтр.
- Добавьте 1 мл раствора коллагеназы (см. выше) на 60 мм блюдо клеток в толстой коллагена. Не извлекайте носитель BEC (который должен быть 3 мл). Выдержите блюдо в течение 30 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Удалить раствор, содержащий клетки, и поместить в 15 мл коническую трубку.
- Спин вниз на 2200 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в подобной объема DMEM/F12.
- Спин решение снова в 2200 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 3 мл 0,5% трипсина и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% CO 2 в течение 5 мин. После инкубации пипетки решение вверх и вниз, чтобы разбить листы холангиоцитах. Добавить 5 мл БЭК ПРЕССЫй спин решение в 1500 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в DMEM/F12, затем спина раствор при 1500 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и вновь приостановить гранул в БЭК СМИ (табл. 1). Пластина клеток на ранее сделанных тонких гелей коллагена.
4. Прохождение и хранение клеток
Примечание: клетки на тонких коллагеновых гелей могут быть разделены по мере необходимости.
- Планшеты промывают стерильной PBS до инкубации в 0,25% трипсина при 37 ° С в течение 10-15 мин.
- Нейтрализовать с равным объемом БЭК информации, и осаждения на 1500 мкг в течение 5 мин. Промыть осадок с DMEM/F12, то осаждения при 1500 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в БЭК СМИ для распространения коллагена покрытием клеточных культур блюд.
Примечание: В качестве альтернативы, клетки могут быть повторно суспендируют в носителе и хранятся в -80 ° C морозильнике или жидкого азота (табл. 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование этого результаты протоколов в изоляции населением новорожденных мыши внепеченочных холангиоцитах с отличной чистоты, о чем свидетельствует иммунофлуоресцентного окрашивания K19 (рис. 2А и 2В); мы достичь подобных результатов изолирующие клетки от взрослых мышей. Мы наблюдали, что он принимает 3 недели для клеток из недавно выделенных желчных протоков с образованием монослоев на толстых гелей коллагена. В холангиоцитов расти в линейном виде по всей толстой коллагена, образуя листы клетки из...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь метод, чтобы изолировать чистые холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков мышей мышей всех возрастов, в том числе новорожденных. Методика имеет то преимущество, что внепеченочных холангиоцитов можно изучать отдельно от внутрипеченочных холангиоцитах, и может облегчить исследования для определения ключевых различий между этими популяциями клеток. Мы недавно опубликовали исследование, демонстрирующее снизилась реснички в внепеченочных холангиоцитах изолированных этим методом и инфицированных резус ро...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.
Благодарности
Авторы благодарны молекулярной патологии и обработки изображений ядро UPenn NIDDK Центра молекулярных исследований в желудочно-кишечных и заболеваний печени (P30 DK50306) об оказании помощи визуализации. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья (R01 DK-092111) и от Фреда и Сюзанны Biesecker детской печени Центра (до RGW) и стипендией с детства Заболевания печени исследований и образования сети (к SK).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/Life technologies | 11320-033 | 500 мл, используется в БЭК средах |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 мл, используется в БЭК средах |
| MEM с заменимыми аминокислотами | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 мл, используется в БЭК средах |
| Инсулин-трансферрин-селен | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 мл, используется в БЭК средах |
| На пируват | Cellgro | 25-000-CL | 5 мл, используется в БЭК средах |
| Химически определенный липидный концентрат | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 мл, используется в БЭК средах |
| Пенициллин-стрептомицин | Cellgro | 30-002-CI | 5 мл, используется в БЭК средах и 500 μ l в выделении |
| Гентамицин | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0,2 мл, используется в БЭК средах и 500 μ l в выделении |
| Этаноламин | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0,13 мл, используется в среде |
| БЭК MEM витаминный раствор | Gibco/Life technologies | 11120-052 | 5 мл, используется в среде БЭК |
| Ингибитор трипсина сои | Biowhittaker | 17-605E | 5 мл, используется в средах БЭК. Растворитель PBS, смесь до 5 мг/мл стоковой концентрации |
| L-глутамин | Cellgro | 25-005-CL | 5 мл, используется в БЭК средах |
| Экстракт гипофиза крупного рогатого скота | Gemini | 500-102 | 1,1 мл, используется в БЭК средах |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0,5 мл, используется в БЭК средах, Stock conc 393 μ г/мл разбавить этанолом |
| 3 3',5-трийодо-L-тиронина | Sigma Aldrich | T6397 | 0,5 мл, использовать в БЭК средах, Стоковый конс 3,4 мг/мл разбавить этанолом |
| Эпидермальный фактор роста | Millipore | 01-101 | 0,5 мл, использовать в БЭК средах, 25 μ г/мл разбавить DMEM F12+1%BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 мл, использовать в средах БЭК, использовать в исходной концентрации 0,411 мг/мл и разбавить DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 мл, использовать в средах БЭК и 500 μ l в изоляции |
| Коллаген крысиного хвоста | BD Biosciences | 354236 | варьируется в зависимости от концентрации коллагена |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | использование при 10x, стерли, используется для производства коллагена, используемое количество зависит от концентрации коллагена |
| dH2O | N/A | N/A | стерильный, используется для производства коллагена, используемое количество зависит от концентрации |
| коллагена NaOH 10 Н | Fischer Scientific | ss255-1 | Развести до 1 Н, стерильный, используется для производства коллагена, используемое количество зависит от концентрации |
| коллагеназы коллагеназы типа XI из Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | развести в DMEM и стерильно отфильтровать перед применением |
| трипсин-ЭДТА (1x) 0,25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 мл, инкубировать максимум 10 мин |
| трипсин-ЭДТА (10x) 0,5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 мл, инкубация макс. 10 мин |
| Препарирующий микроскоп | Nikon | SMZ645 | Другие модели приемлемы |
| Источник света (волоконно-оптический осветитель) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | Другие модели приемлемы |
| 12,5 см прямые ножницы радужной оболочки | глаза Kent Scientific | Другие модели | |
| приемлемы 6" незубчатые изогнутые щипцы с тонкими наконечниками | Электронная микроскопия Науки | Другие модели приемлемы | |
| 4" зубчатые нержавеющие щипцы с тонкими наконечниками | Электронная микроскопия Науки | Другие модели приемлемы |
Ссылки
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
