Выделение новорожденных внепеченочных холангиоцитах

Summary

Техника для изоляции холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков у новорожденных мышей описан. Воздуховоды являются тщательно препарировали, а затем клетки выделяют выроста в толстых гелей коллагена. Этот метод является полезным инструментом для изучения внепеченочных развитие протоков желчи и патологии.

Abstract

Интра и внепеченочных желчных протоках печени являются умственно различны, и может быть по-разному влияет на некоторых заболеваний. Тем не менее, различия между внутри-и внепеченочных холангиоцитах, а также между новорожденных и взрослых клеток, не до конца понятны.

Методы выделения холангиоцитах из внутрипеченочных желчных протоков, хорошо известны ^1-4. Выделение внепеченочных протоков клеток, особенно из новорожденных, до сих пор не описано, хотя это было бы весьма полезным для понимания различия между различными популяциями cholangiocyte и в изучении таких заболеваний, как атрезия желчных путей, которые появляются целевой внепеченочных протоков. Описанный здесь является оптимизированная методика изолировать оба новорожденных и взрослых мышей внепеченочные клетки желчных протоков. Этот метод дает чистую популяцию клеток с минимальными загрязнения от мезенхимальных клеток, как фибробласты.

Это метод основан на удалении внепеченочных протоков и желчного пузыря, а затем тщательного вскрытия и выскабливание, чтобы удалить жир и фибробластов слоев. Структуры встроены в толстых слоев коллагена и культивировали в течение приблизительно 3 недель, чтобы разрастание холангиоцитах в монослоев, которые затем могут быть трипсином и повторно высевали для экспериментального использования.

Introduction

Происхождение и развитие внутри-и внепеченочных холангиоцитах заметно отличаются. Печень развивается из выпячивания вентральной энтодермы передней кишки ^5. Хвостовой область дивертикула формирует внепеченочных желчных дерево, в то время как черепная область генерирует внутрипеченочный желчный дерево ^5. Внутрипеченочные холангиоцитов воздуховодов выводятся из клеток-предшественников вокруг протоков пластины в пригородных портала регионах ^6. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в либо гепатоцитов или холангиоцитах ^6. Это имеет значительные клинические последствия, учитывая, что cholangiopathies может специально....

Protocol

Вся процедура осуществляется при комнатной температуре, если не указано иное. Все животные работа должна проводиться в гуманных условиях по протоколу утвержденного местного комитета Институциональная уходу и использованию животных (IACUC) на.

1. Подготовка оборудования и решений

1. Настройка мыши операционный стол в непосредственной близости от капота культуры ткани и инкубатора (рис. 1А). Примечание: Необходимое оборудование включает в себя рассекает микроскопом, источник света, длинные 12,5 см прямые ножницы Iris, 6 дюймовый без зубчатые изогнутых щипцов с прекрасными советами и 4 дюйма зубчатые щипцы с изогнуты....

Results

Использование этого результаты протоколов в изоляции населением новорожденных мыши внепеченочных холангиоцитах с отличной чистоты, о чем свидетельствует иммунофлуоресцентного окрашивания K19 (рис. 2А и 2В); мы достичь подобных результатов изолирующие клетки от взрослых мышей. Мы наблюдали, что он принимает 3 недели для клеток из недавно выделенных желчных протоков с образованием монослоев на толстых гелей коллагена. В холангиоцитов расти в линейном виде по всей толстой коллагена, образуя листы клетки из.......

Discussion

Описанный здесь метод, чтобы изолировать чистые холангиоцитах из внепеченочных желчных протоков мышей мышей всех возрастов, в том числе новорожденных. Методика имеет то преимущество, что внепеченочных холангиоцитов можно изучать отдельно от внутрипеченочных холангиоцитах, и может облегчить исследования для определения ключевых различий между этими популяциями клеток. Мы недавно опубликовали исследование, демонстрирующее снизилась реснички в внепеченочных холангиоцитах изолированных этим методом и инфицированных резус ро.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/Life technologies	11320-033	500 мл, используется в БЭК средах
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 мл, используется в БЭК средах
MEM с заменимыми аминокислотами	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 мл, используется в БЭК средах
Инсулин-трансферрин-селен	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 мл, используется в БЭК средах
На пируват	Cellgro	25-000-CL	5 мл, используется в БЭК средах
Химически определенный липидный концентрат	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 мл, используется в БЭК средах
Пенициллин-стрептомицин	Cellgro	30-002-CI	5 мл, используется в БЭК средах и 500 μ l в выделении
Гентамицин	Gibco/ Life technologies	15750-060	0,2 мл, используется в БЭК средах и 500 μ l в выделении
Этаноламин	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0,13 мл, используется в среде
БЭК MEM витаминный раствор	Gibco/Life technologies	11120-052	5 мл, используется в среде БЭК
Ингибитор трипсина сои	Biowhittaker	17-605E	5 мл, используется в средах БЭК. Растворитель PBS, смесь до 5 мг/мл стоковой концентрации
L-глутамин	Cellgro	25-005-CL	5 мл, используется в БЭК средах
Экстракт гипофиза крупного рогатого скота	Gemini	500-102	1,1 мл, используется в БЭК средах
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902	0,5 мл, используется в БЭК средах, Stock conc 393 μ г/мл разбавить этанолом
3 3',5-трийодо-L-тиронина	Sigma Aldrich	T6397	0,5 мл, использовать в БЭК средах, Стоковый конс 3,4 мг/мл разбавить этанолом
Эпидермальный фактор роста	Millipore	01-101	0,5 мл, использовать в БЭК средах, 25 μ г/мл разбавить DMEM F12+1%BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	5 мл, использовать в средах БЭК, использовать в исходной концентрации 0,411 мг/мл и разбавить DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1 мл, использовать в средах БЭК и 500 μ l в изоляции
Коллаген крысиного хвоста	BD Biosciences	354236	варьируется в зависимости от концентрации коллагена
PBS 10x	USB Corporation	75889	использование при 10x, стерли, используется для производства коллагена, используемое количество зависит от концентрации коллагена
dH2O	N/A	N/A	стерильный, используется для производства коллагена, используемое количество зависит от концентрации
коллагена NaOH 10 Н	Fischer Scientific	ss255-1	Развести до 1 Н, стерильный, используется для производства коллагена, используемое количество зависит от концентрации
коллагеназы коллагеназы типа XI из Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	развести в DMEM и стерильно отфильтровать перед применением
трипсин-ЭДТА (1x) 0,25%	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 мл, инкубировать максимум 10 мин
трипсин-ЭДТА (10x) 0,5%	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 мл, инкубация макс. 10 мин
Препарирующий микроскоп	Nikon	SMZ645	Другие модели приемлемы
Источник света (волоконно-оптический осветитель)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Другие модели приемлемы
12,5 см прямые ножницы радужной оболочки	глаза Kent Scientific		Другие модели
приемлемы 6" незубчатые изогнутые щипцы с тонкими наконечниками	Электронная микроскопия Науки		Другие модели приемлемы
4" зубчатые нержавеющие щипцы с тонкими наконечниками	Электронная микроскопия Науки		Другие модели приемлемы