Протон Передача и конформации белка Динамика в светочувствительных белков с временным разрешением Шаг сканирования ИК-Фурье спектроскопии

Краткое содержание

Ключевые этапы функционирования белка, в частности конформационные изменения позвоночника и реакции переноса протонов, часто происходят в масштабе от микросекунд до миллисекунд. Эти динамические процессы могут быть изучены с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье с временным разрешением, в частности, для белков, функция которых запускается светом.

Аннотация

Мониторинг динамики протонирования и белковых магистральных конформационных изменений в функции белка является важным шагом на пути к пониманию его механизм. Протонирования и конформационные изменения влияют на вибрации картина боковых цепей аминокислот и пептидной связи, соответственно, оба из которых могут быть проверены с помощью инфракрасной (ИК) разница спектроскопии. Для белки, функция которых может быть повторно и воспроизводимо вызвано света, можно получать спектры разница инфракрасный с (суб) разрешением в одну микросекунду в широком спектральном диапазоне, используя шаг сканирования инфракрасной Фурье технику. С ~ 10 ² -10 ³ повторений фотореакции, минимальное количество, чтобы завершить сканирование по разумной спектральным разрешением и пропускной способности, уровень шума в разности поглощения спектров может быть по цене от ~ 10 ^{- 4,} достаточно следовать кинетики изменения протонирования из одной аминокислоты. Нижеуровень шума может быть достигнуто путем более усреднения данных и / или математической обработки. Количество белка, необходимое для достижения оптимальных результатов между 5-100 мкг, в зависимости от метода, используемого для отбора проб. Что касается дополнительных требований, белок должен быть сначала сконцентрированы в буфере низкой ионной силы, а затем сушат с образованием пленки. Пленка белок гидратируют до эксперимента, либо с небольшими капельками воды или при контролируемой влажности воздуха. Достигнутый уровень гидратации (г воды / г белка) калибруется от спектра поглощения ИК. Чтобы продемонстрировать технику, мы изучали фотохимический светового приводом протонного насоса бактериородопсине в своей родной фиолетовый среды мембраны и светового ионный канал channelrhodopsin-2 растворяют в производстве моющих средств.

Введение

Чтобы в полной мере выяснить, как белки выполняют свою функцию, необходимо измерить их, как они работают, то есть по пути реакции, что часто включает в себя ряд промежуточных и простирается на несколько порядков времени. Основные этапы функции белка часто происходят в микросекунды до миллисекунды временной диапазон ^1, в частности магистральные конформационные изменения и переносе протонов реакции в мембранных белков. Рентгеновской кристаллографии, возможно столп структурной биологии, предоставляет статические (усредненный по времени) электронных плотностей от хорошо дифрагирующих белковых кристаллов, как известно, трудно расти вместе с мембранных белков ^2. 3D модель атома может быть построен на основе электронных плотностей, хотя и редко, включая расположение атомов водорода. Значительный прогресс в временным разрешением рентгеновской кристаллографии, опираясь либо на лауэ дифракции ³ или фемтосекундных импульсов рентгеновского излучения ^4, добавляет измерение времени с высокой структурной информации врентной для рентгеновской кристаллографии ^5. Но отмене технические и аналитические проблемы, кристаллическая решетка может нарушить магистральных конформационные изменения и изменять динамику белков, неизбежный недостаток методов, основанных на белковых кристаллов ^5. Следовательно, динамические аспекты белков до сих пор лучше всего покрыта оптическими методами, как впервые на флеш-фотолиза ^6,7, хотя с общим недостатком ограниченной структурного понимания.

Преобразованию Фурье ИК-спектроскопия (ИК-Фурье) сочетает в себе временное разрешение оптических спектроскопии с ценным чувствительности к структуре белка, последней черты эксплуатируемого в бесчисленных статических структурных и функциональных исследований по мембранных белков ^8-11. В частности, ИК-Фурье спектроскопии разница оказалась идеальным инструментом для изучения крошечных спектральные изменения в виде белка транзитов из одного метастабильного состояния в другое ^12-19.

Studieс на динамики белков, других, чем на одном уровне молекулы ^20,21, требуют срабатывания процесс синхронизации. Реакцию обычно инициируется быстро и не инвазивно с помощью света в качестве триггера, как это сделано в исследовании белков с циклическими фотореакций. Одна из основных задач, связанных с временным разрешением исследований является достижение достаточного временного разрешения при сохранении хорошего спектрального разрешения и соответствующего соотношения сигнал-шум. Также важно, чтобы покрыть достаточно широкий спектральный и временного диапазона. Время-разрешенная шаг сканирования ИК-Фурье спектроскопии превосходит во всех этих аспектах ^22, с опубликованные примеры покрытия спектральные диапазоны так велик, как 3,900-850 см ^-1 и динамика, протяженностью ~ 9 заказы времени, с до 3,5 см ^-1 спектральные и 30 нс временное разрешение ^23-28.

Фурье-ИК-спектрометры показать снижение уровня шума и улучшение фотометрические точность в дисперсионных них ^29. Howevэ, в нормальном режиме записи быстрого сканирования FT-IR спектрометр страдают от временным разрешением ограничивается ≥ 5-10 мс, как следствие минимального времени мобильный зеркало интерферометра требует, чтобы завершить сканирование. С помощью техники шаг сканирования, напротив, временная зависимость динамического события отделяется от длительности проверки интерферометра. Вкратце, мобильные зеркало движется в дискретных шагов, а не постоянно сканирования для завершения сканирования. На каждом из этих шагов (мобильный) зеркало проводится фиксированной и преходящее записывается. Таким образом, время разрешения ограничивается времени восстановления кадмий-ртуть-теллурида (MCT) детектора, который обычно находится в диапазоне 10-100 нс. На практике, большой динамический диапазон интерферограммы (содержащего интенсивный сигнал в centerburst и малых сигналов в крыльях), требуется для правильного цифровизации аналоговый / цифровой преобразователь (АЦП) с целых 16-24 бит, что приводит к выборке ставки не выше ~ 200 кГц(5 мкс) ^30. Наносекундного времени разрешение может быть достигнуто путем измерения только изменения в интерферограммы, для которых немного АЦП 8-12 достаточно ^23,31-33. Технические аспекты ^30,34,35 и приложения ^36-38 временным разрешением шаг сканирования были подробно обсуждены в другом месте.

Цель текущего вклада является предоставление протокол, описывающий практические аспекты временным разрешением шаг сканирования ИК-спектроскопии на фоточувствительных мембранных белков. Здесь, производительность техники показан в течение двух методов отбора проб: передачи и нарушенного полного отражения (ATR). Использование ATR позволяет работать в присутствии избытка воды, которое не только обеспечивает полную условий гидратации белка, но также позволяет острый контроль образца рН и ионной силы ^49,50. Шаг сканирования эксперименты проиллюстрированы на два выбранных систем: бактериородопсина и channelrhodopsin-2.

Свет приводом протонного насоса бактериородопсин (Br) был предметом многочисленных биофизических исследований на протяжении более сорока лет ^39,40, что делает его самым понял мембранный белок до сих пор. Среди многочисленных методик, применяемых к изучению функций Марка ИК-спектроскопии, возможно, оказываемое одним из крупнейших воздействий. А именно, ИК-Фурье спектроскопии была ключом для разрешения групп, занимающихся переноса протона через мембрану, как приходилось в другом месте ^13,41,51.

Channelrhodopsin (ЧР) является первым светло-ионный канал в природе ^42,43. Свет возбуждение ЧР приводит к транзиторной открытия ионного канала. Его открытие поселились путь для развития Optogenetics, где молекулярные процессы контролируются с помощью световой ^44,45. ЧР принадлежит, как Br, в семье микробных родопсины но в отличие от Br, гораздо меньше известно о его функциональной механизма ^52. ChR2 сочетает в себе функции как IOн канал с протон-насосной деятельности ^46,47. Недавно мы обратились с временным разрешением шаг сканирования ИК-Фурье спектроскопии решить внутриотраслевой белковые реакции переноса протона и динамику белка магистральных конформационных изменений в ChR2 ^48.

Протокол

1. Общие аспекты образца и подготовка инструмента

1. Использование коммерческих ИК-Фурье спектрометр оборудован для временным разрешением измерений шаг сканирования. Для достижения наилучших результатов поместите спектрометр FT-IR на вершине вибрационном столе развязкой.
2. Эвакуировать из оптики отсек до нескольких мбар. Выпустите образец купе с сухим воздухом или азотом.
3. Поместите прозрачный материал ИК непрозрачный для видимого излучения в передней части детектора MCT спектрометра ИК-. Эта мера предосторожности необходима для предотвращения артефактов из возбуждающего лазерного импульса во время экспериментов шаг сканирования. Примечание: Мы используем германий (Ge) окно диаметром 25 мм. Его высокий показатель преломления вызывает нежелательно интенсивность теряет, в значительной степени избежать, используя фильтр Ge с антиотражающего покрытия.
4. Охладите MCT детектор Дьюара с жидким азотом. Примечание: Использование фотоэлектрических КРТ детекторов предпочтительнее, чем photoconductives из-за их линейного отклика и, таким образом, превосходит photometrТочность микросхемы и базовый надежность ^31,53.
5. Предварительно сконцентрировать образец, используемый для экспериментов по крайней мере 2 мг белка / мл в буфере с низким (<20 мм) ионной силы, чтобы предотвратить образование кристаллов соли в то время как высушивания суспензии белка с образованием гомогенной белковой пленки. Для образцов, что осадка, мыть / концентрировать их, применяя ультрацентрифугирование (например, мембранных белков через липосомы или в клеточных мембран патчей). Используйте centricons надлежащего отсечки для белков, которые не осадок (например, моющих средств солюбилизированные мембранных белков).
6. Для получения оптимальных результатов использования: а) белковые препараты, как чистый и активный, как это возможно; б) отношения липидов / белков ≤ 3 веса для белков в клеточных мембран патчей или восстановленных в липосомы; в) отношения моющее средство / белковые ≤ 1 в весе для моющих растворяют белков. Избегайте использования моющих средств или липидов, чьи колебательной полосы перекрываются с таковыми из белка (например, главы).

2. Подготовка Attenuated полного отражения экспериментов на бактериородопсина

1. Установите аксессуар ATR в камеру для образцов спектрометра ИК-. Примечание: Мы используем ZnSe / бриллиантовое ATR с 5 активных размышлений. Избегайте полупроводниковых материалов, таких как германия или кремния в качестве внутреннего отражения элемента (ИРЭ) аксессуара ATR, а их оптические свойства зависят от захватывающей видимого лазера.
2. Измерьте широкого диапазона (примерно 4,000-800 ^см-1) энергетический спектр в 4 см ^-1 Постановление чистую поверхность ИРЭ по обычной быстрого сканирования ИК-спектроскопии. С помощью этого спектра в качестве эталонного спектра для вычисления спектров поглощения на более позднем этапе.
3. Обложка поверхности ИРЭ АТР с 20 мкл буфера, используемого позже увлажняет образца (например, 4 М NaCl и 100 мМ NAPI при рН 7,4). Измерить поглощение ИК-буфера.
4. Снимите буфер, и промойте IRE поверхности Wiй воды. Не прикасайтесь к поверхности. Удаление остаточной жидкости с поверхности ИРЭ интенсивным потоком воздуха.
5. Распространение ~ 3 мкл бактериородопсина (BR) в пурпурных мембран (~ 6 мг белка / мл в деионизированной воде) в верхней части поверхности ИРЭ (~ 0,2 см ² площади). Высушите подвеска белка в слабом потоке сухого воздуха до фильм не будет достигнута.
6. Измерьте спектр поглощения сухой пленки (см. рис 1).
7. Осторожно добавьте 20-40 мкл буфера высокой ионной силы увлажняет сухой пленки (например, 4 М NaCl и 100 мМ NAPI при рН 7,4). Примечание: высокая ионная сила предотвращает чрезмерное разбухание мембраны фильма, позволяя сохранить больше белка, максимально близко к поверхности зондируемого (рис. 2).
8. Обложка держатель ATR с крышкой для предотвращения испарения воды. При желании разместить крышку жилет, подключенный к кровеносной бане до 25 ° С для регулирования температуры. Для белков с длинными photocycles (и #62; секунды), температурный режим может увеличить базовую стабильность.
9. Измерьте оптическую плотность спектр. Оценить процент оставшегося образца вблизи поверхности после регидратации пленки путем вычитания спектр поглощения буфера (рис. 3).
10. Подтвердите стабилизацию фильма набухания путем записи спектров поглощения в 5-20 минутными интервалами после регидратации (рис. 4). Этот шаг является необязательным, но рекомендуется.

3. Выполнение экспериментов передачи по Моющее средство-солюбилизированной Channelrhodopsin-2

1. Добавить 10 мкл ChR2 (~ 10 мг белка / мл), растворенного в 5 мМ NaCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) и децил-мальтозид (DM) в центре окна диаметром 20 мм BaF _2. Распространение его с помощью кончика пипетки к диаметром 6-8 мм (поверхностный белок плотность ~ 200 мкг / см ^2).
2. Образуют пленку USIнг нежный поток сухого воздуха. Для достижения наилучших результатов убедитесь, что пленка является однородной и имеет диаметр примерно соответствующий размер пучка ИК на крупнейшей апертуры.
3. Гидратов фильм, добавив 3-5 мкл смеси глицерина / воды распределенной в 3-5 капель вокруг сухой пленки, и плотно закрыть это с окна второго помощью плоской силиконовый уплотнительное кольцо ≥ 1 мм толщины. Примечание: Отношение глицерин / вода смеси контролирует относительную влажность между окнами ^54. Для гигроскопической образцы использовать соотношение 3/7 или 2/8 глицерин / вода (вес / вес). Капли глицерин / вода никогда не должен быть в непосредственном контакте с белковой пленки.
4. Вставьте BaF ₂ зажатой окна в держателе. Предотвращение прямой свет от достижения детектор, покрывая окна выборки с непрозрачного материала ИК, таких как бумага, с отверстием, соответствующим размер гидратированного пленки. Поместите держатель в камеру для образцов.
5. Контроль температуры держателя 25 °С помощью термостатической оболочкой, подключенного к контролируемой температурой кровообращения ванной.
6. Измерьте спектр поглощения. Убедитесь, что максимальное поглощение в области амид I (~ 1,700-1,620 см ^-1) находится в диапазоне 0,6-1,0.
7. Оцените массу и молярное соотношение белок / моющих средств / воды из спектра поглощения гидратированного пленки (рис. 5) с помощью спектров коэффициента ссылка вымирания для воды, ДМ, и представительных мембранных белков (рис. 6).
8. Подождите, пока уровень гидратации не стабилизируется до проведения экспериментов шаг сканирования (≥ 1 час).

4. Настройка и синхронизация возбуждающего лазера

Для экспериментов по тормозной использовать второй гармоники излучения импульсного Nd: YAG лазера (λ = 532 нм), чтобы вызвать фотохимический. Для экспериментов с ChR2, использовать возбуждение λ = 450 нм, как это предусмотрено в орческой параметрический генератор (ОПГ), приводимый в третьей гармоники (λ = 355 нм) в Nd: YAG лазера. Убедитесь, что лазерный импульс является достаточно коротким (~ 10 нс), чтобы минимизировать среднее фото-возбуждение. Примечание: Энергия лазерных импульсов должна быть как можно более постоянным. В нашей установке, интенсивность лазерного колеблется ≤ 10% вокруг среднего значения, что подтверждается измерения рефлекс лазера на фотодиод, подключенные к регистратор переходных и интеграции ответ (рис. 8).

1. Пара лазер к образцу. Отрегулируйте плотность энергии лазера в образце до 2-3 мДж / см ² в импульсе с помощью питания-метровый.
   1. Для установки ATR использовать оптическое волокно помещается поверх крышки ATR.
   2. Для экспериментов передачи, использовать зеркала, чтобы довести лазер для образца и, если необходимо, либо линзы коллимации или расходятся лазерный луч диаметром немного выше образца размером пленки.
2. Синхронизация LĀSER импульса записи данных с помощью спектрометра. Используйте Q-переключатель синхронизации-выход TTL пульс электроники в Nd: YAG лазера, чтобы вызвать спектрометра. Установите частоту возбуждения в Nd: YAG лазера до 10 Гц для тормозной и 0,25 Гц для ChR2 соответственно.
3. Используйте задержки импульсного генератора (PDG) для контроля скорости лазерного возбуждения, если частота следования из Nd: YAG-лазер не легко регулируется.
   1. Подключите лампы синхронизации отъезда из Nd: YAG лазера на внешний вход триггера PDG. PDG обеспечивает выход ~ 190 мкс с задержкой TTL импульса к добротности синхронизации в входе Nd: YAG-лазер для запуска генерации. Ворота PDG принять внешний запуск только после определенного периода времени с момента последнего принятого триггера (100 мс для BR или 4 сек для ChR2).

5. Времяразрешенные Подготовка Шаг сканирования и настройки

1. Поместите низких частот оптического фильтра на оптическом пути. Для выполнения временным разрешением измерения шаг сканирования в 1,800-850 см ^-1 спектральный диапазон, использовать фильтр непрозрачные выше 1950 см ^-1 и с хорошим передачи (> 50-80%) ниже 1800 см ^-1 (рис. 7).
2. Измените детектор переменного тока в постоянный связью режиме. Примечание: После этой регулировки сигнал интерферограмма больше не будет колебаться около нуля, а вокруг значением известный как DC-уровне.
3. Использование наибольшее возможное отклонение пучка спектрометра для более высокого потока фотонов и, следовательно, лучше отношение сигнал-шум, но в пределах линейности детектора.
4. Принесите DC-уровень интерферограмме к нулю и скорректировать электронный усиления для более эффективного использования динамического диапазона аналогового цифровому преобразованию (АЦП). Достижение DC-смещение уровня путем применения напряжения смещения к сигналу, представленной предварительного усилителя. Примечание: Эта опция входит в современных ИК-Фурье спектрометров. В противном случае, самодельный внешнее устройство может использоваться вместо, помещенного между предусилителем и АЦП ^38. Уход тогданеобходимы для того, чтобы электроника такого устройства быстро и линейная.
5. Запустите меню шаг сканирования спектрометра ИК-. Установите целевого спектрального пропускания для измерения на шаг сканирования в 1,975.3-0 см ^-1. Отрегулируйте спектральную полосу пропускания до доли лазерного волнового He-Ne ^(1/8-й в данном случае), незначительно превысив обрезание оптического фильтра.
6. Отключите все верхних частот электронный фильтр для предотвращения искажения кинетики в более поздние времена. Низкочастотный электронный фильтр может быть полезным, если его частота среза составляет порядка или выше частоты дискретизации АЦП (снижает шум псевдонимов).
7. Установите спектральные и разрешение фазы до 8 см ^-1 и 64 см ^-1, соответственно. Установите режим регистрации интерферограмм в одной стороне вперед. С помощью этих опций один интерферограмму требуется около 500 баллов.
8. Установите частоту дискретизации АЦП по самым высоким доступны в спектрометре (например, 160 кНг, или 6,25 мкс). Установите "триггер для эксперимента" для "внешних", то есть, лазер является хозяином. Установите количество линейно расположенных точек данных для записи: 7000 для BR (до 42 мс) и 20000 за ChR2 (до 125 мс). Примечание: Более длинные временные рамки могут быть покрыты без переполнения памяти АЦП с использованием квази-логарифмически времени интервала внешних импульсов TTL от генератора волн, чтобы вызвать получение данных ^38, или с помощью двух параллельных переходных записывающие устройства в качестве заменителей внутреннего АЦП ^{31, 32.}
9. Сохранить около 100 пунктов до запуска в качестве эталона для темной состояния образца. Примечание: В масштабе времени миллисекунд качество данных часто ограничивается колебаний в мобильном зеркало. Увеличение точки до запуска выше 100, таким образом, не ожидается существенного повышения качества данных.
10. Установите количество сопутствующих дополнений, то есть, количество средних фотореакции за зеркальной POSITионная. Для Br, использовать 20 со-дополнения (20 минут измерения времени в 10 скорости возбуждения Гц). Для ChR2 использовать 2 Совместное дополнения (70 мин измерения времени на уровне 0,25 скорости возбуждения Гц)
11. Повторите эксперимент 10x для тормозной и 35x на трех различных образцов пленки для ChR2, чтобы иметь, наконец, ~ 200 сопутствующих дополнений на положения зеркала.

6. Обработка данных

1. Проверьте состояние образца путем сравнения светоиндуцированного ИК разностный спектр, полученный из первого и последнего измерения. Рассмотрим отбрасывая любые измерения, где интенсивность разностного спектра падает ниже 60% от стоимости первого измерения.
2. Нормальное записанные интерферограмм.
   1. Использование OPUS программное обеспечение с спектрометра ИК-Фурье выбрать временным разрешением интерферограмм в среднем и добавьте их в "калькулятор Spectrum".
   2. Нажмите "=" для получения среднем интерферограмм.
      Примечание: Когда фаза интерферограммыпостоянна во время измерения безразлично к средним интерферограмм или спектров одноканальной. Постоянная фаза может быть подтверждена путем вычисления и сравнения фазовый спектр за первый и последний записанный интерферограмму.
3. Выполните преобразование Фурье усредненных временным разрешением интерферограмм для получения усредненной спектры одного канала с временным разрешением.
   1. Используя тот же программное обеспечение, что и в шаге 6.2.1, выберите усредненную временным разрешением интерферограмму и щелкните значок "интерферограмме к спектров". Используйте метод Мерц фаза коррекции, коэффициент нулевой заполнения 2 (два цифровых баллов в инструментальной резолюции), и функцию аподизации (например, треугольник, Blackmann-Harris 3-термины и т.д.).
   2. Щелкните нижнюю "Конвертировать", чтобы преобразовать временным разрешением интерферограмму в спектрах с временным разрешением.
4. Экспорт временным разрешением данные одного канала как "точки данных таблицы" или "; MATLAB "файл, используя" сохранить как "иконы в программном обеспечении OPUS. Продолжить обработку данных во внешней программе.
   1. Нормальное спектры одного канала до лазера, и конвертировать времяразрешенного данные одного канала на времяразрешенного разница поглощения спектров.
   2. Вычислить вектор для ожидаемого шума стандартного отклонения в разностных спектрах в зависимости от волнового числа (рис. 12), используя стандартное отклонение шума, ε, и имею в виду, S ₀ (ν), из 100 одной спектров канала, предшествующего лазер: ε / S ₀ (ν). Значение ε оценивается вычитанием последовательных спектров одного канала и вычисления стандартного отклонения скорректированного на √ 2.
   3. Удалить спектральные области слишком шумным, чтобы быть полезным (например, выше 1825 см ^-1 и ниже 850 см ^-1).
   4. Выполните квази-логарифмически в среднем (например, 20-спектры / времени десятилетие). Appearanсе данных улучшится, и количество спектров будет снижена с ~ 10 ⁴ до ~ 10 ² без значительного потери информации (рис. 9).
   5. Увеличение в четыре раза спектральную плотность точек (на 1 пункт / см ^-1) с использованием интерполяции Фурье (сообщение нулевой заполнение).
      Примечание: Мы выполните шаги 6.4.1 для 6.4.4 в самодельной программы, работающей в среде MATLAB.
5. Обработать полученную временным разрешением спектров (рис. 10, а) с сингулярного разложения, СВД, (рис. 13). Осуществлять шумоподавление данных, восстановления данных с ограниченным числом существенных компонентов SVD (фиг. 10b). Примечание: Мы выполняем СВД в MATLAB, с помощью функции "СВД" встроенный.

Результаты

1 показан спектр поглощения сухой пленки Br, нанесенного на поверхность алмазного внутреннего элемента, используемого для отражения ATR-спектроскопии. Характерные группы из колебаний пептидной связи (амид, амид I и амид II) ясно различимы. Примерный толщина сухой пленки может быть оценена как ~ 1 мкм, учитывая количество добавленного белка (18 мкг) и поверхность ATR (~ 0,2 см ^2), и принимая плотность белка, ~ 1,4 г / см ^{3, 58} и липидов в качестве 1,0 г / см ^{3, 59} и отношение липид / белок от 1/3 (вес / вес) в фиолетовый мембраны ^60.

Сухую пленку регидратации с избытком 4 М NaCl, 100 мМ NaPi при рН 7,4 (рис. 3). Концентрация уровень гидратации и эффективный белок в объеме зондировали с помощью затухающих волн могут быть выведены из масштабного коэффициента, необходимого для удаления цифровой полосы поглощенияот воды. Оптимальный коэффициент масштабирования составил 0,87, что означает, что в этом случае буфер занимает 87%, и образец 13% от объема вблизи поверхности. С учетом белка и липидов плотности и соотношение липид / белок в пурпурных мембран (см. выше), можно сделать вывод, эффективную концентрацию белка 125 мкг / мл в объеме зондировали с помощью затухающих волн. Мы можем сделать вывод, от уровня гидратации, что в данном конкретном случае, образец толщина пленки расширенной ~ 6 раз после регидратации, от ~ 1 до ~ 6 мкм. Для угла падения 45 °, и для нашей, и для большинства договоренностей ATR, глубина проникновения эванесцентной поля (г _р) для гидратированного белка фильма колеблется от 0,3 до 0,6 мкм в 1,800-850 см ^-1 интервала ^61. Поскольку затухающих поле практически нечувствительны к образцу, расположенного в два раза выше Д _р ^61, получаем, что количество белка, используемого в эксперименте ATR может быть в принципе уменьшен вес 5xОтсутствует какой-либо значительной потере сигнала.

При использовании буферов нижней ионной силы пленка расширяется больше, и количество белка в объеме зондировали на запредельном области уменьшается (рис. 2). Точную зависимость между пленкой отек и ионной силы буфера будет зависеть, среди прочих факторов, от природы липидов. Например, аналогичный пленка опухоль, полученный здесь, Br в пурпурных мембран с использованием 4 М NaCl был получен мембранный белок восстановленного в полярном Е. палочки липиды, используя только 0,1 М NaCl ^62. Если образец занимает менее 5% от объема зондируемого рассматривать повторно делает шаг гидратации с использованием буфера высшего ионной силы. Фильм отек после гидратации требуется некоторое время, чтобы достичь стабилизации (рис. 4). Для BR в пурпурных мембран процесс моноэкспоненциален, с постоянной времени 12 мин: это занимает не более 30-60 минут, чтобы иметь стабильную регидратированную фильм

На фиг.5 показан ИК-спектр поглощени гидратированного пленки, полученной ChR2 передачи. Здесь, гидратация была достигнута путем воздействия на сухой пленки в атмосфере контролируемой влажности, представленной смеси глицерин / вода. Спектр можно разложить на взносов воды, моющих средств и белка. Мы могли оценить количество каждого из них с помощью спектров коэффициент поглощения, масштабируется в соответствии экспериментальный спектр. Для воды мы взяли спектр коэффициент вымирания из литературы ^63, а для DM мы измерили его из раствора 100 мг / мл (рис. 6). Мы также использовали коэффициенты экстинкции для двух представительных мембранных белков: митохондриальная носителей АДФ / АТФ ⁶⁴ и BR (рис. 7). Коэффициент масштабирования указывает массовый поверхности плотность воды и DM из 260 мкг / см ² и 200 мкг / см ² в фильме, соответственно. Остальные поглощения (Figurэ 5, красная линия) поступает в основном из белка, по оценкам, на поверхностной плотностью 250 мкг / см ^2, используя коэффициент поглощения Амид II из двух разных белков мембранных (см. рисунок 6). Молярное соотношение для моющего средства белка / воды / была рассчитана на 1/60/2000, используя молекулярную массу 35 кДа, 480 дальтон и 18 Д, соответственно.

3D участок от типичных временным разрешением шаг сканирования ИК-эксперимента на тормозной представлена ​​на рисунке 10А, получен ATR и вовлечения 200 мин получения данных. Спектры могут быть извлечены в определенное время, например, когда L, M и N промежуточные фотохимического BR, как ожидается, для достижения их высокий населения (рис. 11). Их спектральные особенности были описаны широко ^13,41,65 и будет далее не обсуждается здесь. Рисунок 12 проявляются с следы на некоторых отдельных волновых чисел. А именно, рост кинетики в 1762 см ^-1 (т _1/2 ~ 60 мкс) сообщает о динамике Asp85 протонирования от сетчатки Шиффа ^66, и его распад нулю указывает на его депротонирование на первом-насытить восстановления ^67. Отрицательный рост кинетики в 1740 см ^-1 (T _1/2 ~ 1 мс) сообщает о депротонированием Asp96 боковой цепи, протонного донора основания Шиффа ^68. Спад интенсивности в нулевых отчетов о своей reprotonation из цитоплазмы ^67. Динамика белковых конформационных изменений можно исследовали изменения поглощения в Амид I и амид II регионе, которая достигает максимального изменения на ~ 3 мс при комнатной температуре ^67,69.

Применение SVD спектроскопических проблем был рассмотрен до ^55,56. Вкратце, СВД пропускается экспериментальные данные, расположенные в матрице А, как: А = U S V ^T. Это разложение может быть изменен для учета зависимости шума на волновом и наказывать колебаний / заносы в базовом ^57. Столбцы U и V содержат ортонормированный спектры и временные следы векторов для каждого компонента SVD, соответственно. S-диагональная матрица, содержащая так называемые особые значения. В (абстрактных) спектрометры-временной компоненты в U и V появится в убывания релевантности описать экспериментальные данные в наименьших квадратов смысле, количественно связанных с ними особой ценности. 13А показывает особые ценности, как в зависимости от числа компонентов, и воспроизводит первые восемь столбцы / компоненты U (абстрактный спектров, фиг.13В) и V (абстрактный временные следы, Рисунок 13С). Сигнал сконцентрирован в первых пяти компонентов (как ожидалось для телotocycle содержащий пять промежуточных состояний), с компонентами выше в значительной степени преобладают случайного шума и других источников ошибок. Экспериментальные данные был реконструирован с использованием только первые пять столбцов U и V и первые пять столбцов и строк S. Данные реконструированные СВД представляет собой наилучший наименьших квадратов экспериментальных данных в матрице ранга пяти. Реконструированный данные показывают улучшение качества (рис. 10, б). А именно, шум в значительной степени снижается, а также некоторых едва заметными колебаниями и заносов в базовой (общей в времяразрешенного шаг сканирования спектроскопии ^25). Обработка СВД особенно полезно для улучшения качества экспериментальных временных следов в миллисекунды (красные линии на рисунке 12).

Временным разрешением данных шаг сканирования для фотохимического ChR2 были получены с использованием описанного выше протокола для пропускания Sion эксперименты (рис. 14, а), примерно с участием 120 ч накопленных измерений. В времяразрешенные данные, собранные за шагом сканирования простирается от 6,25 мкс до 125 мс. Фотохимический из ChR2 требуется около 60 с для полного выздоровления. Последняя часть фотохимического могут быть покрыты с помощью быстрого сканирования ИК-Фурье, и оба шаг сканирования и наборы данных быстрого сканирования объединены как представлено в другом месте ^48. Спектральные изменения ChR2 составляют ~ 10 раз меньше, чем получить от Br, делая измерения более сложным. Специально, колебания в базовой линии в диапазоне миллисекунд стать ясно видно на этих изменений низких поглощения. Это из-за небольших колебаний в мобильном зеркалом в времени миллисекунд масштабе ^25. Колебания, вместе с частью шума, может быть в значительной степени удалены СВД, удивительно улучшение внешнего вида данных (рис. 14b).

Gure 1 "FO: содержание-шир =" 5 дюймов "Первоначально" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. Спектр поглощения BR в пурпурных мембран сушили на верхнем алмазной поверхности аксессуара ATR. Группы из колебаний пептидной связи (амидной I, II, и) указаны.

Рисунок 2. Спектр поглощения пленки БР после регидратации с использованием буферов различных ионных силах (разведения 4 М NaCl, 100 мМ Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ при рН 7,4). Обратите внимание на уменьшение полосы Амид II, т.е. увеличилось пленки отек, с уменьшением ионной силы буфера. (Вставка) Относительная количество белка вблизи поверхности, количественно по интенсивности поглощения при 1541 см ^-1 (максимальный амид II) после subtractiна вклада поглощения буфера.

Коэффициент вычитание, 0.87, Рисунок 3. Спектр поглощения пленки тормозной регидратированного с объемной буфера (4,3 М ионной силы) и после вычитания вклада буфера. Был выбран, чтобы удалить сильное поглощение воды между 3,700-3,000 см ^-1 и получить ровную базовой линии между 2,700-1,800 см ^-1.

Рисунок 4. Спектр поглощения BR после регидратации с буфером 4,3 М ионной силы (поглощение буфер был вычитается для ясности, как на рисунке 3). Вставка показывает эволюцию фильма отек после rehydratион, с последующим поглощением белок амид II в 1541 см ^-1. Подходят к одному экспоненты указывает на постоянную времени для фильма набухания стабилизации 12 мин.

Рисунок 5. Спектр поглощения гидратированного пленки ChR2 измеряется передачи (синяя линия). Вымирание коэффициент спектр воды (пунктирная оранжевая линия) и ДМ (пунктирная голубая линия) была сокращена и вычитается (красная линия).

Рисунок 6. Приводится масса коэффициента экстинкции спектры при 25 ° С в течение жидкой воды (~ http://www.ualberta.ca/ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) и гидратированного пленки / ATP носителя ADP (AAC) ⁶⁴ . Чонг> Коэффициент спектр массовое вымирание было измерено в растворе для DM (100 мг / мл), а в гидратной пленки для BR.

Рисунок 7. Пропускания оптического фильтра, используемого в временным разрешением сканирования сканирования ИК-Фурье измерений.

. Рисунок 8 Выполнение лазерных импульсов, предусмотренных второй гармоники (532 нм) в Nd:. YAG лазер Гистограмма изменения относительной энергии 1000 лазерных импульсов, и подходят для распределения Гаусса со стандартным отклонением 0,05.

1622/51622fig9highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 9. Светоиндуцированный абсорбции изменения тормозной на трех представительных волновых чисел в единого времени шагом толкателей интервалы (зеленый, черный, и синие линии) и после квази-логарифмической усреднения до ~ 20 баллов / декада (красные линии). Обратите внимание на уменьшение шума после логарифмическая усреднение, открывая колебание времени следы в диапазоне миллисекунд.

Рисунок 10. 3D представление светоиндуцированных изменение коэффициента поглощения для тормозной зарегистрированных ATR при рН 7,4 (4 М NaCl, 100 мМ NAPI). А) Исходные данные. B) Данные реконструированные с пятью SVD компонентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 11. ИК-Фурье спектры разница поглощение фотохимического BR в трех выбранных времен, где L (12,5 мкс), M (300 мкс) и N (6 мс) промежуточные наиболее обогащенных.

Рисунок 12. Перенос протона и белковые динамика позвоночника в фотохимического BR как решены с временным разрешением шаг сканирования ИК-разница спектроскопии. Изменения поглощения при 1762 см ^-1 отчетов по динамике протонирование / Депротонирование Asp85, и в 1741 см ^-1 на динамику депротонирование / reprotonation из Asp96 (включая изменения Н-связи до 300 мкс). По времени следы на 1670 и 1555 см ^-1Сообщайте об изменениях в амидной I и вибрации II, как чувствительные к конформации пептидной цепи. Задние следы соответствуют исходных данных, и красные в СВД-обработанных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 13. Сингулярное разложение (SVD) экспериментальных временным разрешением шаг сканирования ИК-Фурье данных фотохимическом Br (см. фиг.10а). SVD проводили после взвешивания экспериментальные данные с учетом шума стандартное отклонение зависимости от волнового числа (рис. 15); в сочетании с ^1-го производного уменьшить статистический вес исходных колебаний, как описано выше ^57. A) и #160; земля относительных особых значений первых 50 компонентов (черные кружки). Первые пять компонентов назначены сигнал компоненты (красные кружки). Остальные распада компонентов экспоненциально, как ожидалось для шумовых компонентов (см. пунктирную серая линия). Б) Первый восемь абстрактный спектры (U ₁ до U _8). C) Первый восемь абстрактные временные следы (V ₁ до V _8). Абстрактный спектры и временные следы назначен сигнала изображены в красных линиях, и с черными линиями иным образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 14. 3D представление светоиндуцированных изменение коэффициента поглощения ИК для ChR2 записанных за шагом сканированияв режиме передачи. шаг сканирования данные не распространяется до 125 мс, обеспечивая только часть фотохимического. A) исходных данных. b) Данные реконструированные с пятью SVD компонентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 15. Расчетное уровень шума в спектре поглощения в ИК-Фурье. Разница 6,25 мкс временная и 8 см ^-1 спектральное разрешение для эксперимента с участием 1 позицию co-addition/mirror (500 фотореакций) или ~ 200 позиций co-addition/mirror (10 ⁵ фотореакции). Значения приведены для ослабленного полного отражения (ATR) и установки передачи.

Обсуждение

Одним из первых аспектов, которые необходимы рассмотрение при выполнении временным разрешением шаг сканирования ИК-Фурье эксперименты на белок является подготовка образца в подходящей форме для ИК-спектроскопии. Поглощение ИК от других, чем белка, представляющего интерес вещества должна быть уменьшена, особенно от воды. Наиболее распространенным подходом является, чтобы испарить воду объемной пробы с образованием пленки. Пленка может быть регидратации либо добавив несколько капель водного раствора или путем воздействия на пленку в атмосфере контролируемой влажностью. Мы показали, как в обоих случаях можно оценить уровень гидратации, полученную с помощью спектроскопии ИК поглощения (см. рисунок 3 и рисунок 5). Хотя полученные уровни гидратации может показаться низким по сравнению с теми, в растворе, они на самом деле близко к тем, которые содержатся в живых клетках ^70, что делает изучение гидратированных пленок белков функционально соответствующих. Кроме воды, онКроме того, важно знать и контролировать количество липидов или моющего средства в образце. Оба должны быть достаточно низким, чтобы иметь минимальное воздействие спектроскопического в поглощении ИК, но достаточно высоко, чтобы сохранить целостность и функциональность интересующего белка.

Время-разрешенная шаг сканирования спектроскопия только прямо применимо к белкам, показывающих обратимые реакции, которые могут быть вызваны воспроизводимо светом (но увидеть прогресс в соединительном шаг-сканирование с быстрого обмена буфер) ^71. На шаге сканирование реакция должна быть воспроизводимыми, по крайней мере ~ 500X, минимальное количество, чтобы завершить интерферограммы, закрывающую 1,800-850 см ^-1 в область 8 см ^-1 разрешением. На практике, однако, дополнительное усреднение данных обычно требуется, чтобы подтолкнуть уровень шума вниз. Для 200 co-additions/mirror положение (10 ⁵ повторений реакции) 6.25 разница поглощения разрешение мкс спектр может отображать шума STAndard отклонение между 2 х 10 ^-5 и 2 х 10 ^-4 для ATR и между 5 х 10 ^-6 и 3 х 10 ^-5 для эксперимента передачи (рис. 15). Благодаря своей высокой фотон пропускной, передачи позволяет ~ 7 снижения уровня шума, чем ATR, является ключевым аспектом для успешного изучения образцы, дающие слабые изменения поглощения, такие как ChR2. С другой стороны, ATR требует от 5 до 25 раз меньше, чем образец эксперимента передачи.

Применение временным разрешением шаг сканирования ИК-спектроскопии является проблематичным для белков отображения медленные photocycles: записи интерферограмму за шагом сканирования может стать непрактичным долго. Некоторые решения были представлены для рассмотрения таких случаях ^72,73, часто основанных на использовании нескольких сменных образцы для ускорения измерений за счет увеличения потребления белка и экспериментальной сложности ^27,74. В некоторых случаях можно обойти эту проблему, эксссылаясь на образец перед фотохимический строго завершена. Для ChR2, с фотохимический требующего после фото-возбуждения 60 сек для восстановления 99%, восстановление в 4 сек уже 80% ^48. С эффективностью возбуждения 10% в лазерном импульсе, 98% молекул ChR2 в темной состояние 4 сек после фото-возбуждения, что делает возможным проводить эксперименты с частотой повторения лазерного до 0,25 Гц.

Обработка данных является окончательным технический аспект, необходимых для достижения наилучших результатов. Логарифмическая усреднение уменьшает шум и, также важно, уменьшает размер данных без искажений, художественный, необходимых для анализа данных задние используя особую разложение значения или глобальную установку. Логарифмическая усреднение, однако, не очень успешны в среднем из колебания времени-следы, вызванные колебаниями в мобильном зеркалом и других источников 1 / е шума во время измерений (рис. 9). Эти колебания базовой линииможет превышать шум в миллисекунды и коррумпированной качества данных. Сингулярное разложение использует избыточности данных, чтобы уменьшить шум, и с некоторыми изменениями ⁵⁷ он может уменьшить, а колебания базовой линии.

Наконец, все труднее и самый трудоемкий частью временным разрешением шаг сканирования ИК-эксперимента соответствует назначению полос и спектральной и кинетической интерпретации данных. Для бактериородопсине многие из полос, появляющихся в спектрах разница ИК были назначены или интерпретировать благодаря накопленной работы многих групп исследователь в течение десятилетий. Для гораздо менее изученной белка, такие как channelrhodopsin-2, выше представленные временным разрешением ИК эксперименты должны сопровождаться параллельных экспериментах на сайт-направленного мутантов и в сочетании с информацией из дополнительных методов для достижения механистической интерпретации ^48.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ИК-Фурье спектрометр	Bruker	Vertex 80v	Оснащен фотоэлектрическим детектором MCT, внешним глобальным и безмасляным насосом. Прошивка 2.3.
BaF2 windows	korth Kristalle
Diamond ATR accesory	Smiths detection		Девятиотражательная DuraDisk
Термостатическая ванна	Julabo	F25
Вибрационный развязываемый стол	OPTA
Pulsed Nd:YAG лазер с генератором второй гармоники	Continuum electro-Optics	Minilite
Оптический параметрический генератор (ОПТ)	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Цифровой генератор задержек/импульсов	Stanford Research Systems	DG535
Импульсный Nd:YAG лазер с генератором третьей гармоники	Spectra-Physics	Quanta-Ray
Различные оптические зеркала и линзы	ThorLabs
OPUS 7.0	Bruker		Программное обеспечение для управления Vertex 80v спектрометр
MATLAB время работы	Mathworks		Используется для запуска самодельных исполняемых программ для Предварительная обработка данных