Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы

14.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

19 июня 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

В этой статье

Краткое содержание

Способность контролировать Т-клеточные реакции в деталях в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа. Здесь мы опишем использование люминесцентных целевых массивов (ССТ) в в естественных условиях Т-клеток анализа, который оценивает> 250 параметров одновременно с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Способность контролировать Т-клеточные реакции в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа и разработке иммунотерапии. Здесь мы опишем использование люминесцентные целевого массива технологии (FTA), которая использует жизненные красители, такие как карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE), фиолетовый лазерных возбудимых красителей (CellTrace Фиолетовый: CTV) и красный лазер возбудимых красителей (пролиферации клеток Краска eFluor 670: CPD ) в комбинаторно этикеток лимфоциты мыши в> 250 различимых кластеров люминесцентных клеток. Сотовые кластеры внутри этих ССТ может быть импульсным с главного комплекса гистосовместимости (МНС) связывающие пептиды класса I и МНС класса-II и тем самым выступать в качестве клеток-мишеней для CD8 + и CD4 + Т-клеток, соответственно. Эти FTA клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, и, следовательно, могут быть введены мышам с целью оценки CD8 + Т-клеточно-опосредованного убийства ССТ клеток-мишеней и CD4 + Т-клеток-медитировал Хельр FTA B клетки-мишени клеток в реальном времени в естественных условиях с помощью проточной цитометрии. С> 250 клеток-мишеней может быть оценена сразу, техника позволяет контролировать Т-клеток ответов против нескольких антигенных эпитопов в нескольких концентрациях и в нескольких повторах. Таким образом, способ может измерять Т-клеточные реакции как на количественном (например, совокупный величины ответа) и качественными (например, функциональной. Авидности и эпитоп-перекрестной реактивности в ответ) уровне. В данном случае мы описываем, как эти ССТ построены и дают пример того, как они могут быть применены для оценки Т-клеточные реакции, вызванные рекомбинантной вакцины вируса оспы.

Введение

Т-клетки играют центральную роль в адаптивного иммунного ответа и часто становятся мишенью для манипуляций в иммунотерапии. CD4 + эффекторные Т клетки реагируют на чужеродный антиген по секреции цитокинов, которые регулируют многие аспекты иммунитета, а также может напрямую помочь В-клеток для производства антител. CD8 + цитотоксические Т-клетки (CTL) также может реагировать на чужеродный антиген по секреции цитокинов, а также играет центральную роль в непосредственно убивает клетки выражая чужеродный антиген. Фундаментальное взаимодействие, которое инициирует эти функции эффекторных Т-клеток включает взаимодействие Т-клеточного рецептора (TCR) с иностранными пептидов, отображаемых на молекул МНС на поверхности клеток. CD4 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-II на антиген-представляющих клеток и CD8 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-I, которые обычно отображаются на микробных клеток, инфицированных.

В порядкеоценить роль Т-клетки играют в иммунного ответа, важно, что их эффекторные функции измеряются надежных и чувствительных методов. Общие методы оценки отклика клеток T включают в себя: МНС class-I/II/peptide тетрамером реактивность; продукция цитокинов по ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокинов; и убивая мощности на 51 Cr-релиз анализов. Эти анализы, однако, как правило, выполняются экс виво со стимуляцией в пробирке, или обеспечивают ограниченное понимание функции Т-клеток. В идеале, при измерении Т-клеточные ответы, было бы полезно, чтобы оценить их на месте, в естественных условиях, как они происходят, без манипулирования Т-клеток с тем, чтобы избежать изменений в функциональных параметров, которые могут возникнуть через стимуляцию в пробирке. Некоторые из наиболее часто используемых в естественных Т-клеток функциональных анализов, основанный на измерении CTL, опосредованного умерщвление клетки-мишени импульсных с МНС класса I-связывающих пептидов, которые перечислены в естественных условияхчерез их обнаружения через флуоресцентного мечения витальных красителей, таких как CFSE. Хотя эти типы анализов может контролировать CTL, опосредованного убийство целей, когда они происходят в живом организме, они ранее были сравнительно ограниченные возможности для оценки убийства нескольких целей, представляющих различные концентрации и различных типов пептидных эпитопов, который необходим, чтобы позволить качественные параметры, такие как функциональные алчность и Эпитоп вариант перекрестной реактивности в оценке. Эти анализы также не дает никакой информации о CD4 + Т-клеток опосредованных реакций.

Чтобы преодолеть многие из ограничений с нынешних методов, используемых для оценки Т-клеточные реакции, мы недавно разработали многозальный анализа на основе флуоресцентных целевых массивов (ССТ), которая позволяет осуществлять мониторинг Т-клеточного ответа против> 250 клеток-мишеней одновременно в одном животного проточной цитометрии 1, 2. ССТ состоят из лимфоцитов, меченных нескольконцентрации Eral и комбинации витальных красителей, как CFSE, CTV и ДСП, позволяющих> 250 клеток кластеры уникальной флуоресценции, которые будут созданы. Так как эти клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, они могут быть введены в животных, чтобы обеспечить контроль за их взаимодействие с эффекторных Т-клетках в естественных условиях 3. Например, клеточные кластеры FTA может быть импульсным с МНС класса пептидов-I-связывания, чтобы позволить оценку антиген-специфических ЦТЛ, опосредованной гибели клеток-мишеней 1. Кроме того, кластеры клеток FTA также может быть импульсным с МНС класса-II-связывающих пептидов, позволяя оценка антигена специфические Т-хелперных клеток (T H) путем оценки активности активацию (по оценке маркеров активации CD69, таких как CD44, и / или CD62L) В-клеток в пределах ЗСТ несущих родственный пептид 2. Поскольку более 250 мишени могут быть обнаружены одновременно, можно измерить ЦТЛ и Т H ответы против многих кластеров клеток-мишеней с п импульсныхumerous пептиды в различных концентрациях и включение многих повторов. FTA анализ, следовательно, обеспечивает беспрецедентный уровень Т-клеточного эффекторной оценки реакции в естественных условиях.

Здесь мы опишем подробно строительство ЗСТ и показать, как они могут быть применены к оценке Т-клеточные реакции в естественных условиях. Процедура описывает конструкцию ЗСТ, состоящей из 252 различимых кластеров клеток за счет использования трех жизненно важных красителей, состоящих из 6 повторами 42 кластеров клеток импульсных с МНС класса-I и II-связывающих пептидов. Маркировка 42 кластеров клеток происходит в 10 мл коническую дном трубки и это полезно, чтобы заложить эти в стойке трубки, как показано в таблице 1. Этот метод может быть отрегулирован для меньшим числом различаемых кластеров в соответствии с требованиями уменьшения количества маркировки каждого красителя производится 1.

Мы подчеркиваем полезность анализа, показывая, как он может измерять отвэс генерируемые рекомбинантного оспа-вирусной вакцинации против нескольких эпитопов в небольшой группе мышей. Это показывает, насколько этот анализ FTA может быть использован для измерения кумулятивные ответы и функциональный алчность через, соответственно, использование площади под кривой (AUC) оценки и измерения эффективной концентрации пептида, необходимого для генерации половиной ответов максимальные (EC 50).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Мыши, используемые в рамках этого протокола были обработаны в соответствии с рекомендациями австралийского Комитета по этике Национального университета экспериментов на животных и мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков.

1. Краситель и пептид Подготовка

  1. Подготовка краски
    Примечание: Красители разведенных в различных концентрациях, чтобы позволить маркировки клеток в дискретных интенсивности флуоресценции. CFSE используется в семи концентрациях, сделанные через 3,5-кратных серийных разведений, и CTV и CPD используются в шести различных концентрациях, сделанные через 3,7-кратных серийных разведений (см. таблицы 2-4). Маточные концентрации красителей, перечисленных в таблицах 2-4 будут использоваться для обозначения клетки-мишени в концентрации конечных красителей, перечисленных в таблицах 2-4. Красители реагировать при воздействии водного раствора. Поэтому важно, что флаконы быть доведены до комнатной температуры перед открытием, чтобы минимизировать воздействие красителей конденсации.
    1. CFSE
      Примечание: CFSE приобретается как карбоксифлуоресцеин Диацетат сукцинимидиловым эфиром (CFDA, SE; МВт 557,47), как правило, на 25 мг / флакон.
      1. Ресуспендируют 25 мг CFSE в 4,48 мл ДМСО с получением исходного раствора 10 мМ.
      2. Серийно разбавить CFSE: Добавить 35 мкл 10 мМ CFSE складе в 87,5 мкл ДМСО и повторить это разбавленной маточного раствора, чтобы дать концентрацию каждого красителя в таблице 3.
    2. CTV
      Примечание: КТВ обычно приобрести в упаковках по 9 флаконов, каждый из которых может быть восстановлена ​​с 10 мкл ДМСО для генерирования 10 мМ раствора красителя.
      1. Восстановить и объединить все 9 флаконов CTV 90 мкл ДМСО для получения раствора 10 мм.
      2. Серийно разбавить CTV: Добавить 11 мкл 10 мМ CTV складе в 29,7 мкл ДМСО и повторить это разбавленной маточного раствора, чтобы дать концентрацию каждого красителя в таблице 2.
    3. CPD
      Примечание: КПИ (МВт 792,6) характернолы приобрести как 0,5 мг / флакон.
      1. Ресуспендируйте 0,5 мг НПР в 63 мл ДМСО, чтобы получить решение 10 мм.
      2. Серийно разбавить ДСП: Добавить 11 мкл 10 мМ CPD складе в 29,7 мкл ДМСО и повторить это разбавленной маточного раствора, чтобы дать концентрацию каждого красителя в таблице 4.
        Примечание: запасы Dye можно хранить при -20 ° С в течение нескольких месяцев и может быть несколько раз размораживали и замораживать без значительной потери функции.
  2. Пептидный препарат
    Примечание: МНС класса-I-связывающие пептиды, как правило, используется для импульса клетки-мишени в 6 различных концентраций с использованием 10-кратное разведений из исходного концентрации 1 мкМ (табл. 5). МНС класса II-связывающие пептиды, как правило, используется для импульса клетки-мишени в 6 различных концентрациях с использованием 3 кратные разбавления от исходной концентрации 400 мкм (табл. 5). Каждый пептид производится при конечной концентрации 2 раза в PBS такой тхат каждый концентрация пептид имеет минимальный объем 250 мкл. Запасы пептид может быть подготовлен до FTA строительства и хранили при -20 ° С без значительной потери функции.
    1. Подготовка акции МНС класса-Я-связывающие пептиды
    2. Подготовка самую высокую концентрацию каждого пептида эпитопа до 2 мкм маточных растворов (2x 1 мкм)
    3. Серийно разбавить МНС пептиды класса-Я-связывающий: добавить 44,4 мкл 2 мкМ пептида раствора в 400 мкл PBS. Повторите этот разбавленной маточного раствора, чтобы дать каждому концентрации пептида в таблице 5.
    4. Подготовка акции МНС класса-II-связывающие пептиды
    5. Подготовка самую высокую концентрацию каждого пептида эпитопа 800 мкМ растворов (2x 400 мкм).
    6. Серийно разбавить МНС класса II-связывающих пептидов: добавить 150 мкл 800 мкМ раствора пептида в 300 мкл PBS. Повторите это разбавленной маточного раствора, чтобы дать каждому концентрации пептида в таблице 5 .

2. FTA Подготовка

Примечание: Описанная ниже процедура описывает строительство ЗСТ, состоящей из клеток импульсных с 7 разных пептидных эпитопов в 6 различных концентрациях (т.е. 42 кластеров клеток.) ​​Неоднократные 6 раз, чтобы генерировать 252 заметных кластеры клеток. В каждом повторе, клетка кластера не импульсно любой эпитопа (ноль), включен в качестве контроля. Это полезно для ССТ иметь разницу CD45 аллотип от животных-хозяев, чтобы их дискриминации со стороны клеток-реципиентов по маркировке антител в момент анализа. В противном случае ССТ могут быть помечены с другими красителями, такими как PKH-26 для этой цели (описано в шаге 2.6). Как правило, процедура подготовки FTA осуществляется от начала до конца в течение одного заседания.

  1. Этикетка 42, 10 мл конические пластиковые пробирки дном 1-42 (как в таблице 1, например).
  2. Подготовка клеток
    1. Изолировать селезенку и / или lymphnodes от мышей. Подготовка суспензии отдельных клеток из тканей, делая пюре через 70 мкм корпели сито с 5 мл поршень шприца и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
    2. Ресуспендируют лимфоциты со скоростью до 200 х 10 6 клеток / мл в 11,5 мл Rochester Park Memorial института 1640 (RPMI или эквивалент), содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Примечание: Важно использовать буфер с высоким содержанием амина, чтобы минимизировать токсичность к клеткам краситель 3.
  3. CTV маркировки
    Примечание: Клетки изначально помечены 6 концентраций CTV.
    1. Тщательно ресуспендирования клеток путем обращения трубки несколько раз. Добавить 1,9 мл клеточной суспензии на 6 из 10 мл пробирок меченых 37-42, стараясь не намочить верхнюю половину трубы.
    2. Чтобы пометить клетки с CTV, снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    3. Добавить 83 мкл PBS к не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют 17 мкл фондовом КТВ (см. таблле 2, для которых исходный раствор назначены каким трубка). Примечание: несмачиваемые трубка важно, чтобы предотвратить движение суспензии клеток и преждевременное смешивание раствора клеток с раствором красителя.
    4. Закрывают пробирку и перемешивают суспензию клеток с красителем быстро и тщательно при интенсивном перемешивании.
    5. Повторите шаги 2.3.2-2.3.4 для фондовых решений CTV в назначенных труб, описанных в таблице 2.
    6. Инкубируйте клетки для минимум 5 мин при комнатной температуре (20 ° C).
  4. CFSE маркировки
    1. После КТВ маркировки, добавляют 5 мл RPMI, содержащей 5% FCS в каждую пробирку и тщательно ресуспендирования клеток на вортексе.
      1. От трубки 37 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 31, 25, 19, 13, 7 и 1.
      2. От трубки 38 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 32, 26, 20, 14, 8 и 2.
      3. От трубки 39 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 33, 27, 21, 15, 9 и 3.
      4. Из трубки 40 передачи 1 мл ячейкиподвеска для труб 34, 28, 22, 16, 10 и 4.
      5. От трубки 41 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 35, 29, 23, 17, 11 и 5.
      6. От трубки 42 передачи 1 мл клеточной суспензии в трубах 36, 30, 24, 18, 12 и 6
        Примечание: Будьте осторожны, чтобы не замочить верхнюю половину труб во время шагов 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Чтобы пометить клетки с CFSE, снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    3. Добавить 103 мл PBS тем, что не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют 7 мл бульона CFSE (см. таблицу 3, для которых исходный раствор, назначенный который трубки).
    4. Закрывают пробирку и перемешивают суспензию клеток с красителем быстро и тщательно при интенсивном перемешивании.
    5. У шаги 2.4.2-2.4.4 для фондовых решений CFSE в обозначенных труб, описанных в таблице 3.
    6. Инкубируйте клетки для минимум 5 мин при комнатной температуре (20 ° C).
    7. Вымойте клеток: Развести клеточной суспензии с 9 мл 20 ° CRPMI, содержащей 5% FCS, осадок центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 20 ° С и супернатанты удалить аспирацией с пипетки.
  5. Пептид пульсирующий и стиральная клеток
    Примечание: После клетки были помечены CTV и CFSE, они пульсируют с МНС класса-I и / или МНС класса-II связывающие пептиды (подготовленные в 1,2). Один из клеточных популяций не должно также быть импульсным с пептидом (например. Всухую в таблице 1) и использовали в качестве отрицательного контроля для расчета Т-клеточные ответы.
    1. Пептид пульсирующий
      1. Ресуспендируют клеток в общем объеме 250 мкл RPMI, содержащей 5% FCS. Примечание: Обычно 50 мкл клеточной суспензии остается после аспирации супернатант в конце стадии 2.4.7, поэтому добавить 200 мкл среды для клеточного осадка.
      2. Добавить 250 мкл предварительно подготовленных запасов пептид (как в таблице 5), чтобы соответствующим образом обозначены трубы (как в Таблице 1) а Sur бытье включать контрольную трубку PBS добавлены отдельно без пептида в качестве контроля нулю.
      3. Смешайте клеточные суспензии с вихрем. Примечание: Очень важно, чтобы каждый пептид Эпитоп и каждая концентрация пептида присваивается одной пробирке и это записано четко исходя из ожидаемого флуоресценции клеток в эту трубу, так как флуоресценция подпись этого кластера будет определять этот пептид (как в таблице 1, например).
      4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Стиральная Сотовый
      1. Добавить 5 мл охлажденного льдом (4 ° С) RPMI, содержащей 5% FCS в суспензию клеток и ресуспендирования клеток путем обращения трубки. Осторожно легли в основу клеточной суспензии с 3 мл охлажденного льдом (4 ° С) FCS.
      2. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Использование медленно ускорение и торможение, чтобы обеспечить интерфейс FCS и клеточную суспензию раствор поддерживают.
      3. Тщательно аспирата от RPMI, а затемФТС с пипетки, оставляя промытых ячейки гранул спокойно. Примечание: Использование подложки FCS мыть клетки помогает обеспечить столько раствор пептид удаляется из клеток, как это возможно, и тем самым ограничения воздействия клеточных популяций на нескольких свободных пептидов, когда клетки объединяли.
      4. Промыть клетки снова: Ресуспендируют клеточный пеллет в 10 мл 4 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Вылейте супернатантами.
      5. Бассейн все сотовые населения вместе в одной пробирке с помощью пипетки с использованием 6 мл 4 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок собирали клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте от супернатант с пипетки.
  6. CPD сотовый маркировки
    Примечание: На данный момент шесть внутрирегиональные повтора анализов могут быть получены путем маркировки пептидных импульсных клеток с 6 различными концентрациями ДСП.
    1. Добавить 11,4 мл 20 ° CRPMI, содержащей 5% FCS в объединенной осадок клеток ресуспендируют и тщательно с помощью пипетки.
    2. Добавить 1,9 мл клеточной суспензии до 6, 10 мл трубки помечены AF, стараясь не намочить верхнюю половину трубы.
    3. Чтобы пометить клетки с ДСП, снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    4. Добавить 92 мкл PBS к не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют запаса ДСП (см. таблицу 4 для количества маточного раствора, назначенного каждой пробирки).
    5. Закрывают пробирку и перемешивают суспензию клеток с красителем быстро и тщательно при интенсивном перемешивании.
    6. . Ли шаги 2.6.3-2.6.5 для фондовых решений ДСП в назначенных труб, описанных в таблице 4 Примечание: В отличие CFSE и CTV, концентрация CPD ​​маркировка точно не в линейной зависимости от полученной интенсивности флуоресценции меченых клеток, и поэтому концентрация маркировка используется для получения эквидистантных пиков флуоресценции меченых нескольких популяций былопределяют эмпирически (см. таблицу 4).
    7. Инкубируйте клетки для минимум 5 мин при комнатной температуре (20 ° C).
    8. Промыть клетки дважды: ресуспендирования клеток до 10 мл при 20 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 20 ° С. Аспирируйте от супернатант с пипетки. Повторите.
    9. Бассейн все клетки вместе в одной пробирке с использованием 8 мл 4 ° C RPMI, содержащей 5% FCS с помощью пипетки. Осадок собирали клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации от супернатанта с пипетки.
  7. (Необязательно) PKH-26 сотовый маркировки
    Примечание: Если ССТ не могут быть построены с клеток, экспрессирующих allotypic разницу CD45 для размещения мышей, они могут быть помечены рКН-26, чтобы позволить их дискриминации со стороны клеток-реципиентов.
    1. Добавить 2,9 мл 20 ° C в PBS Объединенные осадок клеток и тщательно ресуспендируют с помощью пипетки.
    2. Добавить клеточной суспензии к никакомун смачивается 10 мл трубку, стараясь не намочить верхнюю половину трубы.
    3. Снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    4. Добавить 58 мкл разбавителя С (в комплекте с красителем РКН-26) к не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют 42 мкл 1 мМ исходного PKH-26.
    5. Закрывают пробирку и перемешивают раствор клеток с красителем тщательно при интенсивном перемешивании.
    6. Инкубируйте клетки в течение как минимум 10 мин при комнатной температуре (20 ° С).
    7. Промыть клетки дважды: ресуспендирования клеток до 10 мл при 20 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 20 ° С. Аспирируйте от супернатант с пипетки. Повторите.
  8. Потребители инъекционных ССТ в животных-хозяев
    Примечание: Для измерения Т-клеточные реакции в живом организме, ССТ вводятся в животных, которые имеют активную иммунную реакцию и остались на месте на срок до 24 часов. Очень важно, что ССТ также вводят в наивной животного в качестве отрицательного контроля.
    1. Граф и ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 8 клеток на мл в PBS. Введите 200 мкл клеток мышам внутривенно принимающих, в том числе наивным животного в качестве контроля.

3. Проточной цитометрии

  1. 18-24 ч после FTA впрыска урожая крови или селезенке (или других тканей интересов) от мышей-хозяев.
  2. Подготовка суспензии отдельных клеток из тканей, делая пюре через 70 мкм корпели сито с 5 мл поршень шприца.
  3. Ресуспендируют клеток со скоростью до 65 × 10 6 клеток / мл в PBS, содержащем 0,1% БСА.
  4. 100 мкл аликвоты клеточной суспензии в лунки планшета для микротитрования для маркировки антител.
  5. Этикетка клетки с флуорохромом меченые антитела и флуоресцентные жизнеспособности зондов с спектрально совместимый флуоресценции к CFSE, CTV и ДСП. Примечание: Антитела к В-клеток маркеры, такие как B220 и маркеров активации, таких как CD69 необходимы для измерения активации В-клеток при использовании FTДля измерения реакции Т Н клеток 2. Включите антитела к CD45.1 и / или CD45.2 если ССТ и мыши хозяева имеют allotypic разницу CD45.
  6. Добавьте 100 мкл 2х исходного раствора антител / жизнеспособности красителей (в PBS, содержащем 0,1% BSA) в 100 мкл аликвоты клеток, хорошо перемешать и инкубировать на льду (4 ° C) в течение 30 мин.
  7. Промыть клетки: засыпные клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS, содержащего 0,1% БСА, осадка клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант.
  8. Ресуспендируют клеток в общем объеме 400 мкл PBS, содержащего 0,1% BSA, клетки фильтруют через 70 мкм меш и анализируют методом проточной цитометрии в проточном цитометре способен обнаруживать соответствующие флуоресцентные красители и конъюгатов. Соберите до 3 х 10 6 событий лимфоцитов в целях урегулирования каждый сотовый кластер FTA и получить достаточно клеток для статистическикал анализ. Примечание: Убедитесь, что все типичные элементы управления (такие как одинарные окрашенных управления) для проточной цитометрии заняты. Как правило, CFSE требуется возбуждение от синей лазерного источника (обычно на 488 нм) и обнаружения с полосовых фильтров по центру над 520 нм; CTV требуется возбуждение от фиолетового лазерного источника (обычно на 405 нм) и обнаружения с полосовых фильтров по центру над 450 нм; и CPD требуется возбуждение из красного лазерного источника (как правило, на 633 нм или 640 нм) и обнаружения с полосовых фильтров по центру над 670 нм.

4. Анализ данных

  1. Анализ проточной цитометрии данных с использованием стандартного программного обеспечения проточной цитометрии (см. представительный результат для примера типа используемой стратегии стробирования).
  2. Для% конкретного убийства, подсчитать количество клеток в каждой клеточной кластера FTA импульсного с МНС пептидов класса-Я-связывающий и кластеров FTA, которые не были пептида импульсных ("Нил") и, используя следующую формулу для расчета% Удельный Убийство.
    % Удельный Убийство figure-protocol-1
    Примечание: В приведенной выше формуле "загрунтовать" относится к целям от животных, которые, как считается, имеют иммунный ответ против целевых пептидов, "наивным" относится к целям от наивных животных, "пептид" относится к целям импульсных пептидами и "ноль" относится к целям не импульсных с любыми пептидов.
  3. Для активации В-клеток в качестве меры активности T H, вычислить среднее геометрическое интенсивности флуоресценции (GMFI) из CD69 антител флуоресценции от FTA В-клеток пульсировали с МНС класса-II-связывающих пептидов в "примированных" животных и из этого вычесть из GMFI CD69 выражение на соответствующих FTA В-клеток в "наивной" животных, чтобы дать меру T H деятельности.
  4. Из статистики генерируемых с шагом 4,2 и 4,3, использованияматематическое обеспечение электронной таблицы, таких как GraphPad Prism для расчета других количественных и качественных параметров, таких как площадь под кривой и ЕС 50 (в подробное описание того, как эти расчеты проведены для AUC можно найти на
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, а для ЕС50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. HTM? reg_the_ec50.htm).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве примера использования анализа FTA, BALB / C мышей иммунизировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы (VV), выражающей эпитопы ВИЧ-I (VV-ВИЧ) и ответы на эпитопов ВИЧ-I ЦТЛ, Gag, Gag MUT, Env и Pol, В.В. CTL эпитопы F2, F2, и MUT, и клеточный эпитоп ВИЧ-I T H, Gag Th (как описано в пункте 2) были оценены с использованием параметра 252 FTA анализ (Фигура 1В). Варианты эпитопом Gag Gag (МУТ) и F2L (F2, Мут) не выражены в векторе ВВ-ВИЧ и, следовательно, ответы против этих ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Преимущество анализов РИФ-основе, что они позволяют дискриминацию> 250 населения жизнеспособным и полностью функциональный клеток-мишеней с одного животного-хозяина с помощью проточной цитометрии. Это обеспечивает уровень сложности для естественных условиях проточной цитометрии на основе анализов в том, что не удалось раньше. Это подчеркивается в экспериментах 2 животных было показано выше, где ответы на 7 различных вирусных эпитопов на 6 концентраций можно было наблюдать в повторах 6 одновременно в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана проекта грантов # 1010395 (BQ и СР) и # 525431 (CR), а также грантовой программы # 455395 (СР) из Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, австралийский Центра гепатита и ВИЧ вирусологии ВЗ 2012 грант (CR и RJJ) и грант от Гордона и Гретель Волопаса Foundation (BQ и CR). Мы хотели бы поблагодарить Harpreet Вохра и Майкл Devoy за отличную поддержания лаборатории JCSMR FACS, Фонд Австралии онкологический научный фонд Биомолекулярная ресурсов, JCSMR, АНУ, для синтеза пептидов, и д-р Дэвид Бойл, CSIRO животных лаборатории здоровья, Джилонг, Австралия для обеспечения запасов вакцин против ВИЧ родительские.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMISigmaR8758
Фетальная сыворотка для теленкаSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
анти-CD69 brilliant violet 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
ЦентрифугаEppendorf
Flow цитометр (Fortessa или эквивалент с синим, красным и фиолетовым лазерным источником)BD Bioscience

Ссылки

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MHCCellTrace VioletCFSECPDin vivo
Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.