Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная

27.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

14 июня 2014 г.

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Люминесцентная в гибридизация (FISH) позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в их родной среде внутри клетки. Мы здесь опишем протокол для комбинированной, одновременного обнаружения РНК и ДНК с помощью FISH, который может быть использован для изучения инактивации Х-хромосомы в мышиных эмбриональных стволовых клеток.

Аннотация

Флуоресцентный в гибридизация (FISH) представляет собой молекулярный метод, который позволяет обнаруживать нуклеиновых кислот в клетки. РЫБЫ ДНК часто используется в цитогенетики и диагностики рака, и может обнаружить аберрации генома, которые нередко имеют важное клиническое значение. РНК FISH может быть использован для обнаружения молекулы РНК в клетках и предоставил важную информацию в регуляции экспрессии генов. Сочетание ДНК и РНК FISH в одной камере технически сложным, так как условия, пригодные для ДНК FISH может быть слишком суровыми для хрупких, одноцепочечными молекул РНК. Мы здесь представляем легко применимый протокола, который позволит комбинированный, одновременное обнаружение Xist РНК и ДНК, кодируемый Х-хромосомы. Это в сочетании протокол FISH ДНК-РНК может, вероятно, быть применены к другим системам, в которых необходимо как РНК и ДНК, которые будут обнаружены.

Введение

Изучение клеток и тканей с помощью флуоресцентной в гибридизация (FISH) с момента своего появления в конце 1970-х 1, позволило исследователям изучить гены, организации хроматина и экспрессии генов на субклеточном уровне. РЫБЫ ДНК часто используется в цитогенетики, кариотипирование 2, диагностики рака 3 и предимплантационной генетического скрининга 4, и имеет важную роль в молекулярных исследований 5-6, так как это позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в их родной среде. Одноместный анализ экспрессии клеток РНК FISH может обнаружить родные первичных транскриптов и некодирующие РНК транскрибируется от хромосом, и дает преимущества с другими методами, которые оценивают экспрессию генов на уровне населения, в том числе, например, количественной ОТ-ПЦР, геном широкий анализ экспрессии или Северная блоттинга . Визуализируя РНК-транскриптов, происходящих непосредственно со своих сайтов происхождения, он, например, былзаметил, что экспрессия гена является стохастической 7, а иногда может быть аллельспецифический 8. Улучшения в технике даже позволяли обнаружение и количественное определение отдельных молекул мРНК в клетках 9-11.

Основной принцип состоит из FISH-гибридизации нуклеиновых кислот в клетке с зондом нуклеиновой кислоты с помощью высоко специфического Уотсон и Крик спаривания оснований. Зонд может быть прямо или косвенно обнаружено, что приводит к сигналу, который может быть визуализированы под микроскопом. Первоначальные попытки состоял из радиоактивно меченых зондов, которые имели недостатки основе по вопросам безопасности, ограниченного пространственного разрешения и способности обнаружить только один цель одновременно 12-14. Последующее развитие нерадиоактивных меток, включая флуорохромами, гаптенами и ферментов, позволило широкое распространение использование рыбы, как рутинной техники молекулярной биологии. РЫБЫ зонд либо могут быть непосредственно помечены fluorochROMES по химическому связыванию флуоресцентных молекул нуклеиновой кислоты в последовательности 15 и интеграции флуоресцентно меченых нуклеотидов 16-19, или зонд может быть косвенно визуализированных после интеграции гаптенов (в том числе биотин и дигоксигенин) и иммунологической детекции гаптенов на гаптен специфических антител, конъюгированных с люминесцентные репортер молекул 20-21. Последний подход позволяет усиление сигнала с помощью нескольких слоев флуоресцентно меченых антител, которые используются для повышения исходный сигнал, и позволяет обнаруживать РНК видов, которые экспрессируются на низких уровнях. Комбинируя прямые и косвенные методы маркировки и различные гаптенов, несколько целей могут быть одновременно визуализировать в пределах одной ячейки.

Одним из наиболее важных шагов в протоколах рыба гибридизация зонда к своей цели. Хотя теоретически, зонд специфически связываются только с его мишенью, на практике это специфичностьне всегда достигается, в качестве зондов могут связываться с гомологичными участками, и условия гибридизации не всегда будет идеальным для конкретного региона ДНК или РНК видов. После гибридизации моет, следовательно, особенно важное значение, поскольку они могут увеличивать строгость процедуры рыба, и может предотвратить неспецифическое связывание рыбы зондов, что приведет к высокому уровню фонового шума. Как Молекулы РНК одноцепочечную они могут быть легко гибридизуют с зондом FISH. В противоположность этому, двухцепочечной молекулы ДНК сначала должен стадии денатурации, после чего зонд может гибридизоваться. Это обычно достигается путем нагревания образца, что приводит к денатурации ДНК. Тем не менее, в этих тяжелых условиях, хрупкие, одноцепочечные молекулы РНК могут быть потеряны. Таким образом, в сочетании ДНК-РНК FISH требует значительного оптимизацию условий, и более технически сложным по сравнению с отдельной обнаружения только РНК или ДНК.

Здесь мы изложета Подробный протокол комбинированного, одновременного ДНК-РНК FISH, который позволил нам изучить Х-хромосома инактивации (XCI) в дифференциации женский мышиных эмбриональных стволовых клеток 22-24. XCI является одним из важнейших эпигенетические механизм женского эмбрионального развития 25, и приводит к хроматина и, следовательно, заставить замолчать одного из двух Х-хромосом в женских особей 26-27. Существенное значение для этого процесса является некодирующих РНК Xist 28-30, который регулируется RNF12 22-23 и Rex1 24 белков. Xist экспрессия становится активируется на будущей неактивной Х-хромосоме (Xi) во время эмбрионального развития или по дифференциации клеток ES в пробирке , и может распространяться по Х-хромосоме и тем самым привлечь хроматина ферменты, которые приводят к транскрипции закрытия Х-хромосоме 31. Это распространение Xist РНК могут быть визуализированы РНК FISH в виде покрытия на хромосоме Xнекоторых, который также упоминается как Xist облака. Поскольку женские стволовые клетки могут потерять один из своих Х-хромосом из-за нестабильности генома, мы и другие использовали комбинированную ДНК-РНК FISH учиться XCI, чтобы убедиться, что только кариотипически стабильные клетки оцениваются в анализе этого важного процесса 22,32 -34. Как и в любом молекулярной техники биологии, несколько различных отличные протоколы были опубликованы 35-38. Здесь мы представляем наш метод, начиная с индукции дифференцировки в ЭС клеток мыши, для фиксации клеток, маркировки рыбы зонды ник-трансляции, предварительной обработки основных клеток, чтобы позволить пермеабилизации и последующее поглощение зонд, гибридизация зонда мишенью, и, наконец, обнаружение зонда по флуоресцентно меченых антител. Протокол здесь представлены позволяет верный обнаружение Xist РНК и Х-хромосомы в течение двух дней, и основы этого метода, вероятно, могут быть адаптированы к аее системы и направления исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Индукции дифференцировки в женском эмбриональных стволовых клеток для стимуляции Х-хромосома инактивации

ПРИМЕЧАНИЕ: Женский мышиных эмбриональных стволовых клеток (по запросу) выращивают в стандартных условиях клеточных ES на желатинизированные чашек для культивирования, покрытых мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). Мы здесь предполагаем, что читатель знаком с помощью стандартных методов культивирования клеток 39-41. Чтобы индуцировать дифференцировку ЭС клетки, выращенные в Т25 блюд будут отделены от MEFs, и будет помещали в дифференциации среды.

  1. Удалить среда для ЭС клеток из культуры клеток ES, и дважды промывали PBS для культивирования клеток.
  2. Добавить 1,5 мл трипсин-ЭДТА (предварительно нагревали до 37 ° С), и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 7 мин. Через 3,5 мин, встряхните блюдо аккуратно разбить колонии.
  3. Инактивации трипсина-ЭДТК добавлением 3,5 мл среды дифференциации в клетки. Внесите клетки вверх и вниз, чтобы получить единое решение клеток, и собратьв 15 мл пробирку. Вращение в течение 5 мин при 200 х г, и собрать клетки в 10 мл дифференцировки среды.
  4. Добавить клеточной суспензии на не желатинированный культуральной чашке, и инкубируют в течение 1 ч в инкубаторе для клеточных культур. ПРИМЕЧАНИЕ: MEFs сможете присоединиться к не-желированного блюдо культуры, в то время как ЭС клетки останутся во взвешенном состоянии.
  5. В то же время, добавляют стерилизованные покровные стекла (24 х 24 мм) в 6-луночных планшетах, добавьте 0,2% желатина, и инкубируют в течение минимального 5 мин при комнатной температуре.
  6. Через 1 ч, собирают супернатант предварительно покрытием ES клеточной культуры, которая в основном состоит из не-прилипших ЭС клеток. Пластинчатые ЭС клетки в 6-луночных планшетах, содержащих покровные. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ⅙ й из сливной T25 блюдо на 6 скважинах 6-луночный планшет. Это позволит сливающийся дифференциацию хорошо после 3 дней дифференциации. Изменение среды на ежедневной основе. Для более длинных курсов времени дифференциация, плиты предварительно металлизированных ЭС клеток в дифференциации среды в бактериальных блюд, и incubели по мобильному шейкере, интегрированного в инкубаторе для клеточных культур. Это позволит сформировать клетки эмбриональных телец, которые могут быть покрыты в покровных 1-2 дней до фиксации.

2. Фиксация Дифференцированный ES клеток для последующей ДНК-РНК анализа FISH

  1. Удалить дифференциации среды из дифференциации культур, и мыть дважды культуры клеток PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: тщательно Добавить PBS, чтобы предотвратить клетки смывается.
  2. Удалить культуры клеток PBS и клетки исправить путем добавления 4% параформальдегида (PFA) / PBS, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным и может вызвать значительный риск для здоровья при вдыхании или при контакте с кожей и глазами. Кроме того, PFA является канцерогенным.
  3. Удалить 4% PFA / PBS, и мыть покровные 3x с 70% этанола. ПРИМЕЧАНИЕ: Правильный стиральная важно, так как никаких следов PFA будет мешать последующих стадиях РЫБЫ. Покровные могут быть сохранены в 70%-ном этаноле при -20 ° С в течение нескольких месяцев до FISH анализ.

3. Маркировка ДНК зондов для рыб экспериментов

ПРИМЕЧАНИЕ: Получить фрагмента ДНК интересующего гена (минимальная длина> 2 кб для РНК FISH, или> 20 кб для рыб ДНК), или BAC охватывающий интересующий ген. Для обнаружения РНК, меньший зонд может быть достаточным по сравнению с выявления ДНК, так как, скорее всего, приведет к транскрипции в различных транскриптов, которые могут быть одновременно обнаружены. Для сильного сигнала на одной нити ДНК-копии, больше зонд требуется, чтобы иметь возможность обнаружить достаточное количество включенных гаптенов. Предпочтительно, нетранскрибируемые геномной область выбрана для проектирования ДНК-зонда. Кроме того, при использовании меньшего зонд для обнаружения РНК, она будет предотвращено, что геномные локусы, из которых РНК транскрибируется в настоящее время обнаружено в сочетании ДНК-РНК FISH подхода, хотя это не может быть полностью исключена. Для обнаружения мыши XIST, был использован 5,5 кб кДНК-зонд. Для опрАЗДЕЛ Х-хромосомы, несколько ВАС зонды могут быть использованы. Хорошие результаты были получены со смесью BAC RP23-100E1 и BAC CT7-474E4, которые расположены в непосредственной близости от очага Xist. В зависимости от гена или хромосомы интереса, несколько различных зондов может потребоваться для получения оптимальных результатов. Всякий раз, когда работы с материалами, которые будут использоваться для РНК-FISH, использовать стерильные наконечники фильтра, РНКазы H 2 O и работу в чистой окружающей среде.

  1. Возьмем 1 мкг ДНК и разбавленной в H 2 O в общем объеме 16 мкл. Добавьте 4 мкл дигоксигенином или биотин маркировки решение (см. реагенты), перемешать встряхиванием и инкубировать при 16 ° С в течение 90 мин. Примечание: биотин или дигоксигенином-меченых нуклеотидов теперь будут включены в ник-трансляции.
  2. В то же время, подготовить столбцы G50 для удаления не интегрированные нуклеотидов. Возьмите 2 мл шприц, снимите штампа, а также добавить стерилизованное хлопок в шприц. Добавить G50 шары в растворе то заполнить шприц, поместите шприц в 15 мл трубки и центрифуге при 642 мкг в течение 1 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Около 80% шприца теперь должны быть заполнены G50. Повторите, когда менее G50 присутствует.
  3. Через 90 мин, добавить 40 мкл H 2 O в ник-трансляции реакционной смеси и добавить реакцию на колонке G50. Добавить пустую трубу в столбце, и центрифуге при 642 мкг в течение 2 мин. Сбор поток через в реакционной трубке.
  4. Измеряют объем потока через пипеткой, а также добавить H 2 O, чтобы достичь общего объема 200 мкл. Осадок поток через добавлением 13,3 мкл ДНК спермы лосося (10 мг / мл), 13,3 мкл дрожжевой тРНК (10 мг / мл), 26,7 мкл мыши Cot-1 ДНК (1 мг / мл) и 28 мкл 2 М, рН NAAC 5.6. Смешайте встряхиванием, и добавить 533 мкл ледяным 100% этанола. Встряхнуть пробирку и центрифуги в 16 200 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
  5. Удалить супернатант и мыть гранул в два раза с 70% этанола. Центрифуга на 16200 мкг в течение 5 мин при4 ° С, а воздух сухой осадок. Добавить 50 мкл 50 + растворе для гибридизации, и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы облегчить растворение. Примечание: меченым зондом могут быть сохранены в течение нескольких лет при -20 ° С. ВНИМАНИЕ: 50 + решение гибридизации содержит формамид, который является токсичным, может раздражать кожу, глаза и дыхательные пути, а также является тератогенным.

4. Пермеабилизации, Предварительная обработка и Гибридизация фиксированные клетки для комбинированных ДНК-РНК FISH

  1. Увлажняет фиксированных клеток на покровных стеклах, путем удаления 70% этанола и добавление культуры клеток PBS в 6-луночных планшетах с. Инкубировать в течение 5 мин. Повторите в общей сложности три раза.
  2. Удалить культуры клеток PBS, и добавить 0,2% пепсин в 6-луночных планшетах с, чтобы клетки проницаемыми. Инкубировать 6-луночных планшетах в водяной бане при 37 ° С в течение 4 мин. Удалить пепсин, и инактивировать РНКазой свободной H 2 O.
  3. После исправить путем инкубации клеток с 4% PFA / PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. После fixatiна, дважды промывали PBS для культивирования клеток в течение 5 мин.
  4. Высушить клеток путем инкубации с 70% этанолом в течение 3 мин, 90% этанола в течение 3 мин и 100% этанола в течение 3 мин. Передача покровные из 6-луночных планшетах, и воздушные сухие покровные в течение нескольких минут.
  5. Возраст клеток путем инкубации покровные при 65 ° С в течение 1 часа на нагревательной пластине.
  6. Предварительно гибридизуются FISH зонд с мыши Cot-1 ДНК путем суммирования для каждого покровного стекла для анализа, 25 мкл 50 + растворе для гибридизации, 0,5 мкл мышиной Cot-1 ДНК, 1 мкл меченных биотином Xist зондом и 1 мкл дигоксигенином помечены BAC зонд обнаружения Х-хромосома. Смешайте на вортексе и денатурация при 99 ° С в течение 5 мин. Инкубировать немедленно при 37 ° С в течение 45 мин, чтобы позволить Cot-1 ДНК для гибридизации с повтора последовательности, присутствующие в зондов.
  7. После старения, место 50 мкл денатурации буфера (состоящие из 70% formamide/2x SSC/10 мМ фосфатного буфера) на предметное стекло, и положить покровные на вершине с клетки сталкиваются Towarспуск буфера денатурации. Инкубируют при 65 ° С в течение 2 мин.
  8. Добавить покровные обратно в 6-луночных планшетах и ​​пост-исправлений клетки путем инкубации в ледяной холод 70% этанола в течение 5 мин.
  9. Высушить клетки путем последующей инкубацией в 70% этаноле в течение 3 мин, 90% этанола в течение 3 мин и 100% этанола в течение 3 мин. Удалить покровные от 6-луночных планшетах, и пусть сухой воздух в течение нескольких минут.
  10. Пятно предварительно гибридизировали зонда на предметное стекло, и инкубировать покровное на вершине. Место слайдов в увлажненной камере, заполненной 50 мл 50% formamide/2x SSC и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.

5. После гибридизации Моет и опосредованной антителами Обнаружение Probe

  1. Заполните 6-луночных с 2х SSC, и предварительно прогревается до 42 ° С Добавить покровные после инкубации в течение ночи и инкубировали при 42 ° С в течение 5 мин.
  2. Удалить 2x SSC, и инкубировать покровные с 50% formamide/2x SSC в течение 10 мин при 42 ° С Повторите всего 3 раза (30 мин стирки в целом).
  3. Удалить 50% formamide/2x SSC, и мыть слайды с Трис-солевом-Tween (TST) для 2 х 5 мин при комнатной температуре.
  4. Пятно 50 мкл Трис-солевой БСА (TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову для блокирования в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере.
  5. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  6. Пятно 50 мкл овец-анти-DIG антитела (1:500 в TSBSA) в покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные вверх-вниз для первого шага инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере.
  7. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  8. Пятно 50 мкл кролик-анти-овец антитела, конъюгированного с FITC (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову во второй стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере .
  9. Транспортфер покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  10. Пятно 50 мкл козьего антителам кролика сопряженной с FITC (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову в третий стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере .
  11. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  12. Пятно 50 мкл мышиной анти-биотин антитела (1:200 в TSBSA) на покровное на новые предметные стекла и инкубировать покровные вверх дном на четвертой стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в увлажненной TST-темную камеру.
  13. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  14. Пятно 50 мкл осла анти-мышиного антитела, конъюгированные с родамина (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову в пятый стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненном темной Chambэ.
  15. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST.
  16. Пятно 50 мкл козы против лошади антитела сопряжено с родамина (1:250 в TSBSA) за покровного о новых предметных стеклах, и инкубировать покровные с ног на голову в шестой стадии инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в ТСТ-увлажненной темной камере . ПРИМЕЧАНИЕ: коза-анти-лошадь антитела распознает антитела осла антимышиного; когда станет доступен для исследователя, коза-анти-осел антитело будет работать также.
  17. Передача покровные обратно в 6-луночные планшеты, и мыть 2 х 5 мин с TST. Промыть еще 5 мин с Трис-солевом растворе (TS).
  18. Высушить клетки путем последующей инкубацией в 70% этаноле в течение 3 мин, 90% этанола в течение 3 мин и 100% этанола в течение 3 мин. Удалить покровные от 6-луночных планшетах, и пусть сухой воздух в течение нескольких минут.
  19. Найди каплю монтажа среду с DAPI (см. реагенты) на предметное стекло, и добавить покровное с ног на голову сверху. Печать слайдов с лаком для ногтей иоценки результатов FISH методом флуоресцентной микроскопии (рис. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя упомянутую выше протокол для комбинированной ДНК-РНК FISH, мы были в состоянии представить себе инактивации Х-хромосомы в дифференциации женские эмбриональных стволовых клеток. Рисунок 1 показывает, представитель пример FISH эксперимента ДНК-РНК, где мы обнаруженного как XIST (который является видимым в качестве так называемого Xist РНК облако на неактивной Х-хромосомы и базальной транскрипции Pinpoint на активной Х-хромосомы), а область Х-хромосоме, которая видна как сигнал ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В сочетании ДНК-РНК FISH может быть технически сложным, так как условия, пригодные для ДНК FISH может быть слишком жестким для менее стабильных молекул РНК. Некоторые подходы были применены для изучения как ДНК и РНК в одной камере, в обход необходимость одновременной инкубации с зондов обнаружения как ДНК и РНК. Например, в наложении подхода первого РНК FISH выполняется, и клетки отображаемого, и координаты взяты. Впоследствии те же слайды используются для FISH ДНК, в течение которого сигнал РНК FISH теряется. После FI...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят всех предыдущих и нынешних членов отдела воспроизводства и развития Erasmus MC за полезные и стимулирующие дискуссии в течение последних лет. Мы также хотим поблагодарить трех анонимных рецензентов за предоставленные полезные отзывы. Работа в лаборатории в Грибнау финансируется Голландским исследовательским советом (NWO-VICI) и стартовым грантом ERC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
эмбриональные стволовые клеткибудут доступны по запросу
Эмбриональные фибробластымогут быть получены из эмбрионов E13.5 или из коммерческих источников например
средадля культивирования клеток Millipore ESDMEM, 15% эмбриональная телячья сыворотка, 100 ЕД/мл пенициллин, 100 мг/мл стрептомицина, заменимые аминокислоты, 0,1 мМ γ-меркаптоэтанол и 1 000 ЕД/мл ЛИФ. Фильтр простерилизовать и хранить при 4 ° C максимум 2 недели.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
сыворотку плода теленкаInvitrogen10099141
пенициллином; стрептомицин (100x)Invitrogen15140-122
Заменимые аминокислотыInvitrogen11140-050
γ-меркаптоэтанолSigma-AldrichM7522
ES средаIMDM-Glutamax, 15% термоинактивированная сыворотка теленка плода, 100 Ед/мл пенициллин, 100 мг/мл стрептомицин, заменимые аминокислоты, 37.8 μ л/л монотиоглицерин и 50 μ г/мл аскорбиновой кислоты
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
Аскорбиновая кислота (50 мг/мл)Sigma-AldrichA4403
монотиоглицеринSigma-AldrichM6145
T25 чашки для клеточных культурGreiner Bio-one690160
6-луночные чашки для клеточных культурGreiner Bio-one662160
клеточная культура класса PBSSigma-AldrichD8537
Трипсин-ЭДТА 0,25% (v/v) трипсин/0,2% (w/v) EDTA в PBSGibco25200-056
Falcon пробиркиFalcon352196
24 x 24 мм покровные стеклаMenzle780882
желатинаSigma-AldrichG1890-100Gприготовьте 0,2% желатин/клеточную культуру PBS раствор и автоклав
PepsinSigma-AldrichP7000Разбавленный до 0,2% в 0,01 М HCl (pH 2,0)
абсолютный 100% этанолSigma-Aldrich32221-2,5Lиспользуйте абсолютную 100% воду без этанола и РНКазы для получения 70% и 90% растворов этанола
Свободная водаBaxterTKF7114
стерильные фильтрующие наконечникиRainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
набор для мечения дигоксигенина (перевод DIG-Nick)Набор
(перевод Biotin Nick)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
2 мл шприцBD Plastipak300013
стерилизованный хлопок
Eppendorf tubesEppendorf
тРНК дрожжей 10 мг/млInvitrogen15401-029
Сперма лосося ДНК 10 мг/млInvitrogen15632-011
мышиная кроватка-1 ДНК 1 мг/млInvitrogen18440-016
Настольная микроцентрифуга EppendorfМодель 5417R
Eppendorf рефрижераторная центрифуга EppendorfМодель 5810R
2 М NaAc, pH 5,6Sigma-AldrichS7670
50+ раствор50% формамид, 2x SSC, 50 мМ фосфатный буфер pH 7, 10% сульфат декстрана pH 7
формамидAcros organics3272350000
сульфат декстранаFluka31403
10 мМ фосфатный буфер, pH 7добавить 57,7 мл 1 М Na2HPO4 и 42,3 мл 1 M2PO4; использовать очищенную воду DEPC и буфер
денатурации70% формамид/2x SSC/10 мМ фосфатный буфер pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7,5 раствор
для умывания Tris-saline-Tween (TST)100 мл 10x физиологический раствор, 50 мл 2M Tris, 500 μ l Tween-20, добавить воду без РНКазы до 1 л
10x солевого растворарастворить 85 г NaCl в 1 л H2O и автоклав
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 μ l 10x солевой раствор, 250 μ l 2 M Tris, 1 мл 100x BSA, 3,25 мл свободной РНКазы H2O
BSA, очищенный, 100xNew England BiolabsB9001S
антитела против рытья Rocheдиагностическоеиспользование 1:500 разведенное в TSBSA
антитело против кролика и овцы, конъюгированное с FITCJackson labsиспользование 1:250 разведенное в TSBSA
антитело против козы против кролика, конъюгированное с FITCJackson используют 1:250 разведенное в TSBSA
антитело к мышиному антибиотинуДиагностика Rocheиспользует 1:200 разведенное в TSBSA
антитело против мыши, конъюгированное с РодаминомДжексон Лабораториииспользуют 1:250 разведенное в TSBSA
антитело козы против лошади, конъюгированное с родаминомДжексон Лабораториииспользуют 1:250, разведенное в TSBSA
Трис-солевой раствор для промывки (TS)10 мл 10x физиологического раствора, 5 мл 2 М Трис, 85 мл РНКазы без H<суб>2О
Монтажная среда Vectashield с
самок мышей мышей для дифференцировки клеток для маркировки биотина Roche 11745816910 30120086 для гибридизации для автоклава лаборатории флуоресцентным мискроскопом для ногтей DAPI Vectorlabs H-1200

Ссылки

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Комбинированная ДНК-РНК FISHдетекция РНК Xistмечение ДНК-зондовник-трансляцияиммунофлуоресцентная микроскопияфиксация параформальдегидомгибридизационный буферфлуоресцентные антитела
В сочетании ДНК-РНК Люминесцентная
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.